Abstract
Bakgrunn
Palmitate, en mettet fettsyre (FA), er kjent for å indusere giftighet og celledød i forskjellige typer celler. Resveratrol (RSV) er i stand til å forebygge patogenese og /eller retardere progresjon av en rekke sykdommer. Flere
in vitro Hotell og
in vivo
studier har også vist en beskyttende effekt av RSV på fett opphopning indusert av fettsyrene. I tillegg har endoplasmatisk retikulum (ER) spenning nylig blitt knyttet til cellulære responser adipogenic. For å møte den hypotesen om at RSV effekt på overdreven fettakkumulering fremmet av forhøyet mettede fettsyrer kan delvis skyldes en reduksjon av ER stress, studerte vi RSV handling på eksperimentelt indusert ER stress ved hjelp palmitate i flere kreftcellelinjer.
Principal Funn
Vi viser at, uventet, fremmer RSV en forsterkning av palmitat toksisitet og celledød, og at denne mekanismen er trolig på grunn av en forstyrrelse av palmitat opphopning i triglyserid form og til en mindre viktig membranfluiditet variasjon. I tillegg RSV avtar radikale oksygen arter (ROS) generasjon i palmitate-behandlede celler, men fører til økt X-box binding protein-1 (XBP1) skjøting og C /EBP homolog protein (CHOP) uttrykk. Disse molekylære effekter blir indusert samtidig til caspase-3 cleavage, noe som tyder på at RSV fremmer palmitate lipoapoptosis først og fremst gjennom en ER stress avhengig mekanisme. Videre lipotoxicity hjemfalls indusert av eikosapentaensyre (EPA) eller ved en lever X reseptor (LXR) agonist forsterker hypotesen om at RSV-mediert hemming av palmitate kanalisere inn triglyserid bassenger kan være en viktig faktor i forverring av palmitat-indusert cytotoksisitet.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at RSV utøver sin cytotoksiske rolle i kreftceller eksponert for en mettet FA sammenheng først og fremst av triglyserid opphopning hemming, sannsynligvis fører til en intracellulær palmitate akkumulering som utløser en lipid-mediert celledød. I tillegg er dette celledød fremmet av ER stress gjennom en CHOP-mediert apoptotiske prosessen og kan representere en potensiell kreft strategi
Citation. Rojas C, Pan-Castillo B, Valls C, Pujadas G, Garcia-Vallve S, Arola L, et al. (2014) Resveratrol Forbedrer Palmitate-Induced ER Stress og apoptose i kreftceller. PLoS ONE 9 (12): e113929. doi: 10,1371 /journal.pone.0113929
Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spania
mottatt: 14. september 2012; Godkjent: 03.11.2014; Publisert: 01.12.2014
Copyright: © 2014 Rojas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette reserach ble støttet med tilskudd fra Ministerio de Educación y Ciencia av den spanske Goverment (AGL2008-00387 /ALI og AGL2011-25831 /ALI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adipocytter ha en unik kapasitet til å lagre overskytende fettsyrer (fettsyrer) i form av triglycerider i fettdråper, mens ikke-adipose vev, slik som lever, har en begrenset kapasitet for lagring lipid. En overbelastning av fettsyrer indusere lipotoxicity og celledød i ikke-adipose celler, inkludert kardiomyocytter, p-celler og hepatocytter [1] – [4]. Høye doser av mettede fettsyrer, slik som palmitat, kan føre til cellulær skade og til og med celledød, mens forhøyede konsentrasjoner av oleat og linoleat, som er umettede fettsyrer, blir bedre tolerert [1], [2]. Selv om de detaljerte mekanismene bak FA-indusert lipotoxicity forbli mangelfulle, er det generelt akseptert at reaktive oksygenforbindelser (ROS) og endoplasmatiske retikulum (ER) stress er de viktigste intracellulære mekanismene som er involvert [4] -. [8]
eR det store området i cellen for proteinfolding og trafficking, og mange cellulære funksjoner avhenger av denne avdelingen. Svikt i ER sin tilpasningsevne er definert som ER stress, og cellene vise ulike tilpasnings svar å lindre denne situasjonen. Den ufoldet protein respons (UPR) er den primære adaptative respons på ER stress og skjærer med mange forskjellige inflammatoriske og spenningssignalveier [9], [10]. Overvåking av ER lumen og signalisering gjennom de kanoniske grenene av UPR formidles av de følgende tre ER membranassosierte proteiner: (a) PERK (PKR-lignende eukaryot initiering faktor 2a kinase); (B) IRE1 (inositol krever enzym 1); og (c) ATF6 (som aktiverer transkripsjonsfaktor-6). Når ER stress ikke er løst, blir cellen funksjonelt kompromittert og kan gjennomgå apoptose. Foreløpig har flere veier vært direkte innblandet i ER stress-indusert apoptose. For eksempel er det transkripsjonsfaktor C /EBP homologe protein (CHOP) indusert ved ER stress på transkripsjonsnivå, noe som sensitizes celler til apoptose ved nedregulering av B-celle lymfom 2 (Bcl-2) og aktivering av GADD34 og ERO1α [11], [12]. ER stress aktiverer også IRE1 og ekstra fordel, som har vært innblandet i aktivering av pro-apoptotiske c-Jun NH
2-terminal kinase (JNK) [13], [14].
Flere rapporter har studert sammenhengen mellom resveratrol (RSV) effekter (i sin beskyttende eller cytotoksiske utfall) og eR stress relaterte faktorer som nye molekylære mål for virkningen av polyfenoler [15] – [18]. I tillegg kan mange
in vitro Hotell og
in vivo
studier har også vist en beskyttende effekt av RSV og andre polyfenoler på leveren fett opphopning indusert av mettet fettsyrer eller et fettrikt kosthold [19] – [22]. Bortsett fra disse beskyttende effekter, er RSV stand til å inhibere tumor initiering, markedsføring og progresjon i en rekke forskjellige cellekultursystemer og dyremodeller ved mekanismer som inngår cellesyklus-stans, kinase trasé inhibering og apoptose aktivering [23] -. [26]
Interessant, metabolske endringer, preget av økt glykolyse og lipogenese, er et kjennetegn på kreftceller [27], [28]. Derfor aktivt voksende kreftceller til stede ikke bare kvantitative endringer i
de novo
lipid biosyntesen, men også endringer i lipid membran sammensetning, påvirker membran flyt, signaltransduksjon og genuttrykk [29], [30]. En rekke forskjellige krefttyper tilstede endringer i lipidmembranen sammensetning, som først og fremst kjennetegnes ved mettet FA og FA enumettede akkumulering. Dette opphopning synes å være mindre på grunn av økt opptak av mettet fettsyrer og enumettet fettsyrer enn til forverret syntese av endogen fettsyrer [31], [32].
I tillegg mettede og umettede fettsyrer varierer betydelig i deres bidrag til lipotoxicity. Tidligere studier med primære cellekulturer og kreftcellelinjer har antydet at lipotoxicity fra akkumulering av langkjede fettsyrer er spesifikk for mettede fettsyrene. Denne selektivitet er blitt tilskrevet dannelsen av spesifikke proapoptotiske lipid art eller signalmolekyler som reaksjon på mettede, men ikke umettede fettsyrer [33]. Naturen av disse signalene kan variere over celletyper, men omfatter ROS generasjon,
de novo
ceramid syntese, nitrogenoksid generasjon, minsker i phosphatidylinositol-3-kinase, og primære effekter på mitokondrienes struktur og funksjon. Langkjedete fettsyrer kan også undertrykke anti apoptotiske faktorer, som BCL-2 [33].
For å teste hypotesen om at RSV nedskrivning av overdreven fettakkumulering forårsaket av forhøyet mettede fettsyrer kan være delvis mediert av en reduksjon i ER stressrespons, vi eksperimentelt indusert ER stress ved hjelp palmitate i flere kreftcellelinjer med eller uten RSV. Uventet, gjorde under giftige RSV nivåer (25 mm) ikke redde celler fra palmitat-indusert ER-stress og lipoapoptosis. I motsetning til dette, fikk vi følgende: (a) et RSV-mediert apoptose bare i nærvær av det mettede FA, og (b) en sterk profilering av lipotoxicity ved samtidig økning i FA mengde. Vi karakterisert denne RSV virkning på molekylnivå, og fant at stearoyl-CoA-desaturase 1 (SCD1) rolle (umettethet anrikning) er sannsynligvis relatert til den cellulære «fenotype», men hovedsakelig palmitat lagring i triglycerid-bassenger synes å være kritisk involvert i høyere følsomhet av kreftceller til palmitat-indusert lipotoxicity. Resultatene viser en relativt ukjent RSV cytotoksisk mekanisme som kan utnyttes til å målrette apoptose opprykk i transformerte celler.
Resultater
RSV induserer ER stress i HepG2 celler
Figur 1 viser at HepG2-celler eksponert for økende konsentrasjoner RSV (som varierer fra 5 til 100 uM) for forskjellige varigheter (4, 8 og 24 h) har endringer i eR homeostase, og følgelig å presentere aktive eR stress mekanismer. Den detaljerte effekt på X-box binding protein-1 (XBP1) skjøting og hogge uttrykk ble evaluert (figur 1A og 1B). Den maksimale økning i XBP1 spleising (nesten alle av de XBP1 i spleiset form) og i CHOP uttrykket (51,29 ± 4,81 ganger endring; p 0,001) ble ved en 100 uM RSV-konsentrasjon og en 24 timers inkubering. Selv om ER stress ved 24 timer er tydelig, er det en mangel på korrelasjon med cellenes levedyktighet, noe som tyder på at selv om cellen er nær sviktende grunn til ER funksjonsfeil, det forblir levedyktig; reduksjonen i levedyktighet vises etter 24 timer av RSV behandling (figur 1C) med en verdi på ~40% ved 28 h (p 0,001). Legg merke til at den valgte RSV konsentrasjon (25 pM) som brukes i ytterligere forsøk var ute av stand til å indusere betydelige ER stress som helst punkt.
HepG2-celler ble utsatt for kjøretøy (0 uM) eller økende RSV-konsentrasjoner (5, 10 , 25, 50 og 100 uM) og innhøstet ved bestemte tidspunkter (8, 4 og 24 t). A) RSV utøver en tids- og konsentrasjonsavhengig aktivering av XBP1 spleising (XBP1 unspliced-197 bp amplikon, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Representative bilde av tre uavhengige eksperimenter B) RSV utøver en tids- og konsentrasjonsavhengig aktivering av CHOP uttrykk. C) RSV avtar HepG2 levedyktighet ved høyere doser og inkubasjonstider. Levedyktigheten ble evaluert ved anvendelse av en MTT analyse. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer) ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og * p 0,05
RSV forverrer palmitat-indusert. celledød i HepG2 celler
palmitate-indusert celledød (uttrykt som en reduksjon i cellulære levedyktighet) ble evaluert ved en MTT-assay på HepG2 celler. RSV-virkning på palmitate-behandlede celler, ble også evaluert. Som vist i figur 2A, økende konsentrasjoner av palmitat (fra 0,2 mM til 1 mM) forårsaket en tids (4, 8 og 24 timer) og doseavhengig reduksjon av cellulær levedyktighet. Når palmitate-behandlede celler ble ko-inkubert med økende konsentrasjoner (RSV som strekker seg fra 25 uM til 100 uM), en ytterligere nedgang i HepG2 levedyktighet ble observert. Denne effekten var tydeligere på 50 um (-60% maksimal reduksjon av mobilnettet levedyktighet; p 0,001) og 100 mikrometer (~80% maksimal reduksjon av mobilnettet levedyktighet; p 0,001) RSV behandlinger på 24 timer av co-inkubasjon (figur 2B-D). På grunn av mangelen på en additiv effekt av 25 uM RSV konsentrasjon på palmitat-indusert celledød (~ 20% maksimal reduksjon av cellulær levedyktighet; ns), ble denne konsentrasjonen valgt for ytterligere å studere RSV effekt på ER stress og dens forhold til fettakkumulering indusert ved forhøyede fettsyrer.
palmitate-indusert celledød (uttrykt som prosent av cellulær levedyktighet) ble evaluert ved en MTT analyse i HepG2-celler. RSV-virkning på palmitate-behandlede celler, ble også evaluert. A) Økende palmitate konsentrasjoner (som strekker seg fra 0,2 mM til 1 mM) forårsaket en tids (4, 8 og 24 timer) og doseavhengig reduksjon av cellulær levedyktighet. Palmitat-behandlede celler ble også ko-inkubert med økende konsentrasjoner av RSV på følgende måte: b) 25 pM RSV; C) 50 uM RSV og D) 100 μMRSV. En ytterligere reduksjon på HepG2 levedyktighet sammenlignet med behandlinger med palmitat alene ble observert i 50 uM RSV og 100 uM RSV-analyser. Dataene er uttrykt som gjennomsnittet ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer) ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og * p 0,05
RSV øker palmitat-indusert. eR stress i kreftceller
bidraget av eR stress i palmitat-indusert celledød ble opprinnelig undersøkt ved hjelp XBP1 spleising som eR stress markør. Figur 3A viser at en sub-toksisk RSV konsentrasjon (25 pM) induserte en samtidig økning i den palmitat effekt på XBP1 spleising. For ytterligere å bekrefte resultatene våre, vi studert andre ER stress markører, for eksempel ATF4, ATF6 og CHOP. Interessant, RSV effekt ble også observert (figur 3B) på CHOP (17,03 ± 0,01 vs. 8,91 ± 0,65; p 0,001; maksimal ganger endring var mellom RSV-behandlede og ubehandlede prøver) og ATF4 uttrykk (3.13 ± 0,35 vs. 1,7 ± 0,09; p 0,01; maksimal ganger endring var mellom RSV-behandlede og ubehandlede prøver). Effekten var palmitat avhengig, noe som indikerer at selv om den samme konsentrasjonen av polyfenol var til stede, den stimulus som fremmet en forstørrelse av de molekylære virkninger for nesten alle av de studerte ER stress markører var FA høyde.
HepG2 celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med eller uten 25 mM RSV i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist. B) ATF4, CHOP og ATF6 mRNA uttrykk nivåer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. HeLa-celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med eller uten 25 mM RSV i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. C) Den mottakelighet av HeLa celler til palmitat-indusert ER stress. XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist. D) RSV forverrer palmitat-indusert skjøting i HeLa celler. XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist E) RSV forsterker CHOP mediert signalering. CHOP mRNA uttrykk nivåer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer) ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test.: *** P 0,001 og ** p 0,01
ATF6 var den eneste studerte ER stress markør som så ut til å være upåvirket av behandlingen. Imidlertid er ATF6 translokasjon til Golgi-apparatet som kreves for sin aktivering; Derfor er det sannsynlig at dens uttrykk er upåvirket.
i utlandet, disse resultatene antydet at RSV fremmet endringer i flere molekylære mekanismer som ble forverret når mengden av palmitat økes.
Bemerkelsesverdig er den samme eksperimentelle resultat ble oppnådd når et annet kreftcellelinje HeLa-celler, ble brukt (figurene 3C, 3D og 3E). Dette tyder på at denne effekten ikke var begrenset til en bestemt kreftcellelinje.
RSV sensitizes HepG2 celler til palmitat-indusert apoptose
For å evaluere RSV effekt på palmitat lipoapoptosis, utviklet vi Western blotting analyser av kløyvde caspase-3. Apoptosiske protein kaspase-3 blir syntetisert som et inaktivt proenzym (32 kDa) som er behandlet i celler som gjennomgår apoptose ved selv-proteolyse og /eller spalting av en annen oppstrøms protease. Den prosesserte form av caspase-3 består av store (17 kDa) og små (12 kDa) underenheter som assosierer for å danne et aktivt enzym. Den aktive caspase-3 proteolytisk spalter og aktiverer andre caspaser og relevante mål i cellene, slik som PARP og DFF [34].
Figur 4A viser at palmitate behandlingene bare induserte en svak økning i den caspase-3- spaltning ved høyere doser (0,75 og 1 mM). Når RSV ble det tilsatt, i stedet for å redusere den apoptotiske nivå, det fremmet lipoapoptotic effekten av palmitat. Således RSV samtidig behandling indusert følgende: (a) forøkning av caspase-3 spalting sammenlignet med det som observeres med palmitat alene; og (b) reduksjon av den mettede FA konsentrasjonen terskel som kreves for å fremkalle den apoptotiske effekt (dvs, 0,5 mM palmitat vs. 0,5 mM palmitat 25 pM RSV).
HepG2-celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med eller uten 25 mM RSV i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) kløyvet caspase-3-analyse ved Western blotting. Blottet vist er et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter. B) HepG2-celler ble behandlet med eller uten 25 mM RSV i 28 timer. Før en 8 h-palmitat RSV ko-behandling, ble cellene inkubert med DCFH-DA (20 pM sluttkonsentrasjon) ved 37 ° C i 30 minutter. ROS produksjon er vist som gjennomsnittet av RFU (relative fluorescensenheter) ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer eller palmitat) ble analysert ved hjelp av paret Students t-test. *** P 0,001, ** p 0,01 og * p. 0,05
ROS produksjonen er redusert med RSV i palmitate behandlet HepG2 celler
Bidraget av oksidativt stress i palmitat-indusert celledød ble undersøkt ved å detektere ROS produksjon. For denne analysen, målte vi den fluorescerende signal etter intracellulær oksydasjon av ROS (for eksempel hydrogenperoksyd og hydroksylradikal) av den membran som er gjennomtrengelig fargestoff 2 «, 7»-diklor-dihydro-fluorescein-diacetat (DCFH-DA). Figur 4B viser at dyrkning av HepG2-celler med økende konsentrasjoner av palmitat (fra 0,2 mM til 1 mM) i 8 timer førte til en økning i det fluorescerende signalet (1026 ± 104 vs. 3294 ± 61; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom de ikke-behandlede prøver og de palmitate behandlede prøver). Tidligere inkubasjoner med 25 uM RSV i 20 timer redusert mengden av intracellulær ROS i alle de prøvede palmitate dosene (2478 ± 36 vs. 1222 ± 108; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat behandlede prøver). Dette resultatet understøtter etablert antioksidant kapasiteten av polyfenol [35], og antyder at de nevnte RSV effekter relatert til forverring av palmitat virkning på HepG2-celler er ikke først og fremst på grunn av en økning i det intracellulære ROS produksjon.
SCD1 dynamikk blir endret som reaksjon på RSV
Det er tidligere blitt vist at blant de ernæringsmessige stimuli som modulerer SCD1 genekspresjon, mettet fett var sterke aktivatorer. I dyrkede myotubes, palmitat øket SCD1 uttrykk forbundet med en økning i FA-muskelen lagrings [36]. Figur 5A viser at åtte timers behandling med økende palmitate konsentrasjoner induserte en betydelig overekspresjon av SCD1 ved høyere palmitate doser (1 ± 0,14 vs. 2,21 ± 0,52; p 0,001; maksimal ganger endring var mellom palmitat behandlet og ikke-behandlede prøvene ). I motsetning til dette, når HepG2-celler ble forbehandlet i 20 timer med RSV, SCD1 overekspresjon betydelig redusert, noe som tyder på at RSV svekker palmitat-induserte økning i SCD1 uttrykket (2,21 ± 0,52 vs. 0,7 ± 0,12; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom palmitate behandlet prøvene og RSV + palmitat behandlet prøvene). Motsatt, ble en svak reduksjon i proteininnhold som oppnås når SCD1 ble studert på proteinnivå (figur 5B). Denne mangelen på korrelasjon mellom SCD1 mRNA og protein nivå tyder på at faktorer (posttranslasjonelle faktorer, enzymatisk aktivitet forskrift) andre enn genuttrykk kan også være viktig for SCD1 dynamikk som svar på RSV. På grunn av dette avviket, utviklet vi siRNA knockdown eksperimenter for å avklare hvilken rolle SCD1 i RSV-indusert ER stress. SCD1 uttrykk betydelig redusert på grunn av siRNA transfeksjon (figur S1 A). De store nivåer av inhibering ble oppnådd ved en 10 nM siRNA konsentrasjon ved anvendelse siRNA- (3) eller ved hjelp av en kombinasjon av de tre siRNA oligonukleotider siRNA- (1, 2 og 3). Følgelig SCD1 proteininnhold (figur S1B) ble også signifikant redusert på grunn av denne eksperimentell tilnærming. Når SCD1 knockdown ble validert, studerte vi effekten av dette genet Slå på ER stress mekanismer som bruker XBP1 spleising som ER stress markør. Interessant, som tidligere har blitt beskrevet av andre forfattere [37], SCD1 inhibering aktivert XBP1 spleising (figur S1C), noe som antyder at nedgangen i membranen umettethet kan utløse ER-spenning og celledød. Vi valgte siRNA (3) og kombinasjonen av de tre siRNA oligonukleotider siRNA- (1, 2, og 3) for ytterligere å studere effekten av SCD1 inhibering i en mettet FA kontekst (palmitat behandling). Overraskende, både av siRNA stanse tilnærminger (tall 5C) viste at den etterfølgende eksponering av palmitate til eksperimentelt SCD1 fattige celler ikke forverre XBP1 skjøting; omvendt, i nærvær av palmitat, dette spleising var svakt redusert. For å bekrefte at dette cellulære fenotype var ikke på grunn av en hypotetisk «overordnet» av stanse strategi, studerte vi SCD1 uttrykk når siRNA- (3) ble transfektert. Den palmitate behandling var ute av stand til å reversere SCD1 genetiske undertrykkelse (figur 5D). Derfor, som omtalt nedenfor, kan andre kompenserende mekanismer fremmes av SCD1 inhibering være ansvarlig for den relative reduksjon i XBP1 spleising. I tillegg viser figur 5E som CHOP nivåer liten økt på grunn av SCD-1-hemming, noe som tyder på at til tross for relativ nedgang i XBP1 spleising, andre sensorer av ER stress, for eksempel ATF6 eller ekstra fordel, kan påvirke CHOP uttrykk. Spesielt er dette CHOP høyde ikke kan sammenlignes med det som ble oppnådd tidligere med RSV + palmitate behandlinger (figur 3B).
HepG2-celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med eller uten 25 uM RSV i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) SCD1 genuttrykk nivåer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. B) SCD1 protein nivåer. Cellelysatene ble fremstilt og analysert ved Western blotting. Resultatene av triplikate immunoblot ble kvantifisert ved densitometri. Resultatene er vist i grafen representerer forholdet mellom SCD1 /tubulin. En representant immunoblot er vist under grafen. . Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer eller palmitat) ble analysert ved hjelp av paret Students t-tester for SCD1 mRNA-ekspresjon og ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test for Western blot-kvantifisering *** p 0,001, ** p 0,01 og * p 0,05. SCD1 knockdown (C) induserer XBP1 spleising, men denne sammenføyning blir redusert når ferdigproduserte SCD1 cellene eksponeres for økende konsentrasjoner palmitate. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist. D) Nedgangen i XBP1 skjøting i siRNA + palmitate celler ikke skyldes SCD1 restaurering. Prosentandelen av relativ SCD1 genekspresjon er vist. Resultatene er representert som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. E) SCD1 lyddemping fremmer en svak økning på CHOP uttrykk. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
RSV hemming av palmitate opphopning i triglyserid bassenger korrelerer med økningen i CHOP og XBP-en spleising
for å belyse andre mulige RSV molekylære mekanismen som fremmer forverring av eR stress-avledet apoptose, fokuserte vi vår oppmerksomhet på triglyserid opphopning.
triglyserider lagring ble evaluert av olje rød O farging. Figur 6A viser at åtte timer palmitat behandling induserte en doseavhengig økning i HepG2 triglyceridinnhold (0,643 ± 0,006 vs. 0,994 ± 0,015; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom de ikke-behandlede prøver og palmitat behandlede prøver). Motsatt, når cellene ble forinkubert i 20 timer med RSV, ble det intracellulære fettinnhold redusert i det hele tatt av den analyserte palmitate konsentrasjoner (0,951 ± 0,068 vs. 0,774 ± 0,011; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom palmitat behandlede prøvene og den RSV + palmitate behandlede prøver). Disse resultatene er i samsvar med den akkumulerte
in vitro Hotell og
in vivo
bevis på anti-adipogenic effekten av RSV [38], [39].
HepG2 celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med eller uten 25 mM RSV i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) Oil red O flekker kvantifisering. Triglyserid opphopning er uttrykt som gjennomsnittet av OD (optisk tetthet) ± SD av fire uavhengige eksperimenter. For de faste RSV-konsentrasjoner, ble HepG2 celler vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med en bærer (0,1% etanol), 5, 10, 25, 50 eller 100 uM RSV og en fast konsentrasjon av palmitat ( 0,25 mM) i 24 timer. B) Olje rød O flekker kvantifisering. Triglyserid opphopning er uttrykt som gjennomsnittet av OD (optisk tetthet) ± SD av fire uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer) og 0,25 mM palmitat ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test: *** p 0,001. C) CHOP mRNA uttrykk nivåer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (bærer) ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og ** p 0,01. D) XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist.
I tillegg har vi utviklet flere eksperimenter der vi fikset palmitat konsentrasjon (0,25 mm) og synlige HepG2 celler til å øke RSV konsentrasjoner. Spesielt, RSV var i stand til å redusere triglycerid opphopning på en doseavhengig måte (figur 6B). Til tross for denne reduksjon i triglycerid akkumulering, var det en samtidig aktivering av en primær ER stress komponent, så som XBP1 spleising og ER-avledet nedstrøms apoptotiske faktor CHOP (figur 6C og 6D). Dette resultat sterkt at, til tross for den første fordelaktige effekten av RSV i nedsette triglycerid akkumuleringen, var det en terskel av RSV-indusert hemming av lipidakkumulering (25 uM RSV) som, når de nådde, utløste ER stress-avledede apoptose indusert ved palmitate. Derfor, viste det seg at selv om bufferkapasiteten til palmitat av cellen inhiberes av RSV (først og fremst ved den kjente RSV inhiberende virkning av SREBP1c), når denne hemning er overdrevent sterk /kontinuerlig, er mengden av gjenværende palmitat inne celle vil øke og fremme de skadelige effektene av mettet FA (palmitat-indusert ER stress og apoptose).
Hjemfall av RSV effekter på grunn av co-behandlinger med eikosapentaensyre (EPA) eller leveren X reseptor ( LXR) agonist (tO-901317)
for ytterligere å undersøke om eR stress induksjon i RSV + palmitate-behandlede celler skyldes endringer i palmitat prosesseringskapasitet på cellen, utviklet vi følgende to eksperimentelle tilnærminger: ( a) polyumettet fettsyre (PUFA) tilskudd (behandling med EPA ved to økende konsentrasjoner) og (b) LXR agonist behandling (tilsetning av tO-901 317 for å stimulere SCD1 uttrykk). Påfallende, figur 7C viser at supplering av begge de EPA konsentrasjonene reddet HepG2-cellene fra den apoptotiske prosess (reduserte nivåer av spaltet kaspase 3 sammenlignet med RSV + palmitat). Dette reduserte nivå av den apoptotiske faktor korrelert med en nedgang i XBP1 spleising (figur 7A) og CHOP uttrykket (figur 7B) (16,54 ± 2,16 vs. 6,27 ± 0,67; p 0,001; den maksimale forskjell var mellom RSV + palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat + EPA behandlede prøver), noe som tyder på gjenopprettelse av ER funksjon.
HepG2-celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med en bærer (0,1% etanol), 25 uM RSV, 50 uM EPA eller 100 uM EPA i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0, 0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment). Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist. B) CHOP mRNA uttrykk nivåer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av folden endring ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. C) Det spaltede caspase-3-nivået ble bestemt ved Western blotting. Blottet vist er et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og ** p 0,01
Alternativt HepG2 celler behandlet med to konsentrasjoner (1 uM. og 10 mm) av LXR agonist TO-901317 viste økt SCD1 protein og mRNA nivåer (figur S2A og S2B). I tillegg viser figur 8 at agonistbehandling også korrigert effektene fremmes av palmitate og utløst av RSV. For eksempel, korrigert agonisten behandling økningen i caspase-3-spalting (figur 8A) og tilbakekalles effektene på ER stress (figur 8B og 8C) i XBP1 og i CHOP uttrykket (4,43 ± 0,26 vs 1,67 ± 0,26; p 0,001, den maksimale forskjell var mellom RSV + palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat + TO-901317 behandlede prøver)
HepG2-celler ble vasket to ganger i serumfritt DMEM og overført til serumfritt medium med. kjøretøy (0,05% etanol og 0,1% DMSO) og 25 uM RSV eller 10 mM TO-901 317 i 28 timer; 8 timer før slutten av forsøket, økende konsentrasjoner av palmitat (0,75 og 1 mM) ble tilsatt til den korresponderende brønnen. A) XBP1 spleising. (XBP1 unspliced-197 bp fragment, XBP1 skjøtes-171 bp fragment).
