Abstract
Bakgrunn
glykosylering er en viktig og universelt post-translasjonell modifikasjon for mange proteiner, og regulerer proteinfunksjoner. Men enkle og raske metoder for å analysere glykaner på enkelt proteiner har ikke vært tilgjengelig før nylig.
Metoder /hovedfunnene
En ny teknikk for å analysere glykopeptider i en svært følsom måte ved matrise-assistert laserdesorpsjon /ionisering massespektrometri (MALDI-MS) ved anvendelse av flytende matriks 3AQ /CHCA ble utviklet nylig, og vi optimalisert for denne teknikk for å analysere en liten mengde av transmembranprotein separert ved SDS-PAGE. Vi brukte MALDI-MS-metoden for å vurdere status glykosylering av membran-type 1 matriksmetalloproteinase (MT1-MMP).
O
-glycosylation av MT1-MMP er rapportert å modulere sin protease aktivitet og dermed påvirke kreftcelle invasjon. MT1-MMP uttrykt i humane fibrosarkom HT1080 celler ble immunoutfelt og løses ved hjelp av SDS-PAGE. Etter in-gel tryptisk fordøyelse av proteinet, ble en enkelt dråpe av digestionen påføres direkte til den flytende matriks på en MALDI sikteplate. Konsentrasjon av hydrofile glykopeptider innenfor det sentrale området oppstått på grunn av gradvis fordampning av prøveoppløsningen, mens det uglykosylerte hydrofobe peptider forble ved periferien. Denne spesifikke separasjon og konsentrasjon av glucopeptidene aktivert omfattende analyse av MT1-MMP
O
-glycosylation.
Konklusjon /Betydning
Vi viser for første gang, heterogen
O
-glycosylation profilen til et protein av en hel protein analyse ved hjelp av MALDI-MS. Siden kreftceller er rapportert å ha forandret glykosylering av proteiner, åpner denne enkle å bruke metoden for glykopeptid analyse for muligheten til å identifisere spesifikke glykosyleringsmønstre av proteiner som kan anvendes som nye biomarkører for ondartede svulster.
Citation: Shuo T, Koshikawa N, Hoshino D, Minegishi T, Ao-Kondo H, Oyama M, et al. (2012) Påvisning av heterogene
O
-Glycosylation Profilen til MT1-MMP Uttrykt i kreftceller ved en enkel MALDI-MS metode. PLoS ONE 7 (8): e43751. doi: 10,1371 /journal.pone.0043751
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 5 april 2012; Godkjent: 27 juli 2012; Publisert: 22 august 2012
Copyright: © Shuo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) [22700375] (TS), en Grant-in-Aid for Scientific Research (S) [22220014] (til MS) og Global COE Program «Center Utdannings- og forsknings for Advanced Genome – Basert medisin – for personlig medisin og kontroll av verden smittsomme sykdommer «(til TS og MS) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SS, SI, og KT er ansatte i Shimadzu Corporation. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
glykosylering er en vanlig og svært mangfoldig co- og post-translasjonell proteinmodifisering [1 ]. Oppsamling av bevis indikerer at tilsetning eller modifisering av en eller flere sukkerdelene kan ha forskjellige virkninger på proteinfunksjon og slike modifikasjoner har blitt implisert i forskjellige sykdoms [2]. Spesielt konkrete endringer i protein
O
-glycosylation har blitt rapportert i maligne svulster [3], [4], [5].
O
-glycosylation blir initiert ved tilsetning av en
N
-acetylgalactosamine (GalNAc) til en hydroksylgruppe på en serin eller treonin rest etterfulgt av påfølgende tilsetning av galaktose eller
N
-acetylglucosamine (GlcNAc), som danner kjernestrukturen av den glykankjeden [6]. Kjernen
O
-glycans kan ytterligere utvides ved andre karbohydratdeler som fukose, og /eller sialinsyre. Det har blitt rapportert at kjerne strukturer av
O
-glycans er involvert i metastatisk kapasitet på kreftceller. For eksempel Iwai
et al
. viste at tvang uttrykk for β1,3-
N
-acetylglucosaminyltransferase 6, som legger β1,3 bundet GlcNAc til GalNAc på de reduserende endestasjonen, i menneskelig fibrosarkom FP-10 celler (en meget inngripende variant av HT1080 celler ) resulterte i signifikant reduksjon i
in vitro
migrasjon evne og i dannelsen av lungemetastaser
in vivo
i mus [7].
MT1-MMP er et type i transmembrane proteinase som spiller viktige roller i tumor celle invasjon, på grunn av dens evne til å spalte et bredt spektrum av ekstracellulær matrix makromolekyler, inkludert kollagener og laminins, og for å aktivere proMMP-2 [8]. MT1-MMP har en multi-domene struktur med en katalytisk domene (Thr
112-Gly
285), et hengsel domene (Glu
286-Ile
318), et hemopexin-lignende domene ( Cys
319-Cys
508) og en stilk domene (Pro
509-Ala
541) i den ekstracellulære region [9]. Nyere studier indikerer at MT1-MMP er post-translatorisk endret av
O
-glycan på flere områder innenfor den hengseldomenet. Denne modifikasjon har vært innblandet i substratet erkjennelse [10], proteinstabilitet [11], og omsetning av det enzym [12]. For eksempel, Wu
et al
. viste at MT1-MMP
O
-glycosylation påvirker proMMP-2 aktivisering på celleoverflaten [10]. Mulige glykosyleringsseter av MT1-MMP ble foreslått av aminosyresekvensanalyse og seterettet mutagenese [10], [13] og ved sukkermolekyldelene ble analysert ved hjelp av lektiner og glykosidaser [10], [11]. MT1-MMP er vanligvis uttrykt på lave nivåer (1-2 x 10
5 molekyler /celle), selv i kreftceller [14]. Derfor er disse biokjemiske metoder ikke egnet for å analysere den heterogene glykosylering status av MT1-MMP, særlig i kliniske prøver.
MALDI-MS [15], [16] er en uunnværlig analytisk verktøy for å belyse både peptidet og glykan -deler av glykopeptider [17]. Imidlertid glykopeptider er generelt mer ineffektivt ionisert enn uglykosylerte peptider, og videre er mengden av glykopeptidet som genereres ved proteasenedbrytning av en proteinprøve vanligvis ganske liten sammenlignet med ikke-glykosylert peptid. Det er derfor forutgående separasjon av glykosylerte og uglykosylerte peptider uunngåelig kreves for MS-analyse [18]. En nylig utviklet MALDI teknikk ved bruk av en flytende matriks 3AQ /CHCA, som består av 3-aminokinolin og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre, aktivert på-target separasjon av glykosylerte og uglykosylerte peptider basert på forskjeller i deres hydrofile egenskaper etter en dråpe protease spaltningen ble påført på den flytende matriks på en MALDI målplate [19]. Denne on-target separasjonsmetode ble benyttet for å analysere
N
-glycosylation av ribonuklease B, som brukes som en modell glykoprotein. Her har vi brukt og optimalisert den nye MALDI-MS metode for å analysere
O
-glycosylation profilen til MT1-MMP uttrykt i kreftceller på et lavt nivå og prøvde å påvise heterogene modifikasjonsstatus.
Resultater
On-target separasjon av peptider på en flytende Matrix 3AQ /CHCA
peptider av forskjellig hydrophilicity kan skilles på væske matrise 3AQ /CHCA prikket inn en MALDI sikteplate [19] . Den 3AQ /CHCA matriks danner en gul-farget viskøs sted når den anvendes på skyteskiven som vist i fig. 1A. En enkelt dråpe av proteolytisk spaltningen av en proteinprøve som inneholder både glykosylerte og uglykosylerte peptider blir deretter flekket på overflaten av den flytende matriks. Prøven sprer seg jevnt på den flytende matriks og prøveløsningen gradvis fordamper i løpet av ca. 12 minutter (Fig. 1B). Under fordampning blir hydrofile bestanddeler slik som glykopeptider konsentrert innenfor det sentrale området. I motsetning til dette, hydrofobe peptider som har en tendens til å bli ekskludert fra å fordampe oppløsningen og blir stående ved periferien av den flytende matriks.
(A) Skjematisk representasjon av på-target separasjonsmetode som er beskrevet i denne studien. 3AQ /CHCA først blir flekket ut på MALDI skyteskiven, og deretter de proteolytiske spaltninger fullproteininneholdende både glykosylerte og uglykosylerte peptider er påført på den øvre overflate av den flytende matriks. (B) Tidsforløp overvåkning av prøvedråpe på den flytende matriks. Fordampning av prøveløsningen gjør det mulig for dråpe til å krympe slik at de hydrofile bestanddeler gradvis konsentreres i en fokusert dråpe.
Påvisning av Glykosylert peptider av endogent MT1-MMP
MT1-MMP er en integrert membran proteinase uttrykt på overflaten av aggressive kreftceller. Vi prøvde først å oppdage MS spekteret generert fra glucopeptidene av MT1-MMP uttrykt i kreftceller. Endogen MT1-MMP ble immunopresipitert fra membranlysatene på menneske fibrosarkom HT1080 celler ved hjelp av et monoklonalt anti-MT1-MMP antistoff fremstilt i vårt laboratorium som beskrevet i
Materialer og metoder
. Sialinsyrer, som motstår ioniseringen i MS-analyse [20], ble fjernet ved hjelp av sialidase. Prøvene ble deretter separert ved SDS-PAGE (Fig. 2A). Fortynninger av bovint serumalbumin (BSA) ble også påført på gelen for å beregne proteinmengden (data ikke vist). Gelen ble farget med Coomassie-blått og omtrent 150 ng av MT1-MMP-protein ble skåret ut (fig. 2A, blir båndet parentes). Det isolerte gel fragment ble utsatt for i-gel fordøyelse med trypsin og én sekstiende av sammendraget ble påført direkte på 3AQ /CHCA matrise på en MALDI sikteplate.
(A) Endogene MT1-MMP var immunopresipitert med anti-MT1-MMP-antistoff-konjugert harpiks fra membran lysater av villtype HT1080-celler og ble ytterligere separert ved hjelp av SDS-PAGE og farging med Coomassie-blått. Sialidase, som inneholder BSA som et bærerprotein, ble lagt i lys lane (merket med stjerne). Tall til venstre i panelet representerer molekylmasser i kD (KDA). (B) Et polypeptid som bånd tilsvarende MT1-MMP ble skåret, kuttet i-gel med trypsin. En alikvot av tryptisk MT1-MMP digest avledet fra HT1080-celler ble påført direkte på den flytende matriks 3AQ /CHCA på MALDI sikteplaten. MS-spektrum ble oppnådd innenfor det sentrale området av den flytende matriks (åpen sirkel [○]). En stereoskopisk mikroskop bilde av prøven sted er vist i det venstre øvre innsatsen. Nummer representerer den kumulative intensiteten av den øverste topp (vilkårlige enheter).
tryptisk MT1-MMP fordøye påføres den flytende matriks på en MALDI sikteplate ble tillatt å fordampe, og den sentrale del av prøven last området ble bestrålt ved hjelp av en laserstråle (fig. 2B, innsatt bilde). Den MS-spekteret generert omfattet flere topper (
m /z
2,042.5, 2,245.1, 2,406.9, 2,609.7, 2,771.6, 2,974.0 og 3,135.8) og avstanden mellom toppene tilsvarte nøyaktig til massene på typiske monosakkarider: 162 og 203 Da for heksoseok (Hex) og
N
-acetylhexosamine (HexNAc), henholdsvis (fig. 2B). Derfor ble disse toppene antatt å være avledet fra en enkelt peptid glykosylert forskjellig.
Analyse av Glycosylated Peptider
For ytterligere å undersøke glykopeptidepolymerenhetene toppene stammer fra MT1-MMP etter andre og tredje trinn av MS analyser (MS
2 og MS
3), brukte vi en FLAG-merket MT1-MMP (MT1-FLAG) uttrykt i HT1080 celler på grunn av den grunn at en stor mengde av FLAG-merket protein kan renses enkelt og effektivt. For å reprodusere den opprinnelige glykosyleringsmønster av MT1-MMP i cellene, ble MT1-FLAG uttrykte stabilt ved et nivå som kan sammenlignes med den endogene protein i villtype-celler. Vi uttrykte MT1-flagg i en HT1080 derivat hvor uttrykket av endogen MT1-MMP ble slått ned ved hjelp shRNA. Nivåer av MT1-MMP ekspresjon i cellene ble bekreftet ved Western blot-analyse (Fig. S1A). MT1-FLAG ble renset fra membranlysatene av de revertante celler ved hjelp av anti-FLAG antistoff. Omtrent 400 ng av MT1-FLAG protein ble løst ved SDS-PAGE (Fig. S1B) og deretter analysert av on-target separasjon metoden gjennom MALDI-MS.
Den oppnådde MS spekteret av MT1-FLAG var nesten identisk med den endogene MT1-MMP (fig. 3 versus fig. 2B), med unntak av en hydrofil FLAG-tag (DYKDDDDK) -inneholdende peptid topp på
m /z
1,786.9 i MT1-FLAG. Kollisjonen-indusert dissosiasjon av stor protonert ion [M + H]
+ topper (
m /z
2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 og 3,134.2) via MS
2 indikert at fragmentioner tilsvarer en serie av tap av monosakkarider fra den glykosylerte peptid
299TTSRPSVPDKPK
310 (fig. 4). De glycoforms av dette peptid inneholdt 2-5 Hex og HexNAc. Fragment ion spektra ble også hentet fra en annen glycopeptide
278GIQQLYGGESGFPTK
292 som sodiated ion [M + Na]
+ topp på
m /z
1,968.7 (Fig. S2A). Den MS
2 produkt ion på
m /z
1,024.0 viste seg å være en Hex-HexNAc inneholder peptid
287SGFPTK
292 av MS
3 fragmentering (Fig. S2B). En oppsummering av de identifiserte glucopeptider er indikert skjematisk på strukturen av MT1-MMP (fig. 5). Derfor har vi vært i stand til å oppdage glykosylert peptider av MT1-MMP av MS-analyse av en hel protein ekstrakt fra en gel. Slike glykopeptid topper ble ikke oppnådd når den samme prøve ble analysert ved bruk av en konvensjonell fast matriks DHB [21] som vist i fig. S3. Disse resultatene indikerer klart overlegenhet av den nye metoden bruker flytende matrise 3AQ /CHCA.
En porsjon av tryptiske MT1-FLAG digest ble brukt direkte på det flytende matrise 3AQ /CHCA. MS-spektrum ble oppnådd innenfor det sentrale området av den flytende matriks. Ved sukkermolekyldelene og aminosyresekvensene til peptidene, inkludert glykosyleringsseter til disse glykopeptidene ble tildelt av MS
2 og MS
3. Tallet representerer den kumulative intensitet av den øverste toppen (vilkårlige enheter).
Ion topper som stammer fra MS spekteret av tryptiske MT1-FLAG fordøyer på
m /z
2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 og 3,134.2 (fig. 3) ble utsatt for MS
2 analyse. Disse fragmentioner ble tilordnet til tap av enkle monosakkarider (162 og 203 Da for henholdsvis Hex og HexNAc,) fra samme peptid ion (
299TTSRPSVPD
307).
MT1- MMP er en type i transmembrane proteinase, og har en spesiell multidomain struktur med et katalytisk domene, et hengsel domene, et hemopexin-lignende domene og en stilk domene i den ekstracellulære region. Understreking angir glucopeptidene identifisert i denne studien.
Heterogene glykosyleringsprofil av MT1-MMP
For å forberede en standard protein prøve å sette opp analysebetingelser for glycopeptide analyse, har vi utarbeidet en oppløselig MT1-MMP, som mangler den transmembrane domene som ble uttrykt i Madin-Darby kaninnyre (MDCK) celler. Resultatet av MS-analyse av det løselige MT1-MMP er presentert i fig. S4. Bare én stor glycopeptide topp ble oppdaget for peptid
299TTSRPSVPDKPK
310. På den annen side ble flere glykopeptid topper detekteres fra det samme peptid med MT1-FLAG uttrykt i HT1080-celler (Fig. 3). Derfor er glykosyleringsmønster av MT1-FLAG erholdt fra HT1080-celler representerer en heterogen glykosyleringsprofil av peptidet, og det er ikke på grunn av nedbrytning eller modifikasjon av karbohydratkomponentene under tillagingen og dens anvendelse til MS-analyse. Tatt sammen, dette på målet separasjonsmetode kan bli et kraftig lett-å-bruke verktøy for å analysere heterogene glykosyleringsmønstre av proteiner av valg.
Påvisning av glykosylert Peptider på samme mål Plate
MS spektra av glykopeptider ble fortrinnsvis oppnådd fra det sentrale området av prøven belastede matrise. Dette resultatet indikerer at vi oppnådd separasjon av glykosylerte og uglykosylerte peptider på den flytende matriks. For å bekrefte at ytterligere separasjon av uglykosylerte peptidene på matrisen, analyserte vi periferien av prøven belastede område på den flytende matriks av laserstråling. Faktisk ble mange umodifiserte peptider som stammer fra MT1-MMP digest oppdaget (Fig. S5, topper preget av stjerner), mens glucopeptidene ikke ble påvist innenfor dette området.
Totalt oppnådde vi ca 50% sekvens dekning av det ekstracellulære område av MT1-MMP ved hjelp av denne metoden (fig. S6). Således ble et helt protein analyse av glykosylerte og uglykosylerte peptider oppnådd følgende konvensjonelle SDS-PAGE, i-gel-fordøyelse, og direkte påføring av en enkelt dråpe av en prøve fordøye på den flytende matriks 3AQ /CHCA på MALDI sikteplaten.
Nedre grense for protein beløp for analysen
Vi har endelig bestemt MS spektra generert fra glucopeptidene innenfor en mindre mengde av prøven protein. Forskjellige mengder av MT1-FLAG-protein, ble underkastet SDS-PAGE og gelen ble farget med Coomassie-blått. Mengden av MT1-FLAG ble beregnet ved bruk av BSA som en standard protein (Fig. 6A). Deler av gel inneholdende prøve proteiner ble skåret ut og analysert på samme måte (fig. 6B). Selv om toppintensitetene av MS-spektra ble redusert i henhold til prøven beløp, kunne vi påvise glykopeptid topper selv fra den minste mengden av prøven og mengden av protein fylt på den flytende matriks i dette tilfellet ble anslått til å være ca. 1,6 ng.
(A) MT1-FLAG ble seriefortynnet og deretter separert ved SDS-PAGE og farget med Coomassie-blått. Sialidase, som inneholder BSA som et bærerprotein, ble lagt i langt venstre kjørefelt (merket med stjerne). Tall på venstre side av panelene representerer molekylmasser i kD (KDA). (B) polypeptidet bånd tilsvarende MT1-FLAG ble skåret ut, i-gel spaltet med trypsin, og analysert ved MS hjelp av flytende matriks 3AQ /CHCA. Glykopeptider som inneholdes i hele proteinet fordøye oppnådd fra MT1-FLAG (ca. 1,6 ng basert på sammenligning med en BSA-standard) ble detektert i sentrum av den flytende matriks. Tallene representerer den kumulative intensiteten av de beste toppene (vilkårlige enheter). Pilspisser indikerer glykopeptidepolymerenhetene ioner (se Fig. 3).
Diskusjoner
Mange biokjemiske verktøy er tilgjengelig for å analysere
N
-glycosylation av proteiner, mens de for
O
-glycosylation er begrenset. Derfor har analysen av
O
-glycosylation status av proteiner ved hjelp av små mengder av prøven vært teknisk utfordrende. En on-target separasjonsmetode, og gjør bruk av den flytende matriks 3AQ /CHCA for MALDI-MS, ble nylig utviklet og anvendt for å analysere
N-
glykosylering av ribonuklease B. Vi har brukt denne metoden til å analysere
O
-glycosylation av MT1-MMP uttrykt i lave nivåer i kreftceller.
på målet separasjonsmetode ved hjelp av flytende matrisen er svært enkel og rask å analysere en blanding av glykosylert og uglykosylerte peptider i forhold til konvensjonell MS analyse ved hjelp av DHB. Siden glykosylert peptider er svakt ionisert forhold til uglykosylerte seg, kunne glykopeptidepolymerenhetene signaler ikke oppdages når den samme MT1-FLAG digest ble brukt til DHB matrise (fig. S3). Derfor kan DHB ikke brukes til glykopeptid analyse uten forutgående behandling for separering av sistnevnte. I motsetning til dette er forutgående separasjon av glykosylerte og uglykosylerte peptider som ikke er nødvendig for MS-analyse ved bruk av 3AQ /CHCA. Etter et ytterligere separasjonstrinn følgende proteolytisk fordøyelse ikke er nødvendig, kun en liten mengde av proteinprøven var tilstrekkelig til å oppnå entydige resultater som vist i fig. 6. Videre er den flytende matriks 3AQ /CHCA er kompatibelt med ikke bare analyse av Coomassie blue-farget proteinprøver, men også at av sølv-farget de (data ikke vist). Sølvfarging tillater påvisning av de fleste proteiner, ettersom det er mer følsom enn farving med Coomassie blå. Tatt sammen, kan den MALDI-MS-metoden ved bruk av 3AQ /CHCA gjør det mulig å undersøke glykosylering av et protein som uttrykkes i små mengder og /eller til stede i spesifikt overflateareal, slik som lipid flåter hvor rensningen er mer komplisert.
i denne studien har vi hovedsakelig brukt MT1-FLAG protein uttrykt i HT1080 celler for å evaluere allsidighet av ny anvendelse av væsken matrise for å analysere glykoproteiner ved MS. Dette er rett og slett fordi vi har studert MT1-MMP uttrykt i kreftceller, og ønsket å bruke den som en standard trans protein uttrykkes på lave nivåer. Vi oppdaget glykosylert MT1-MMP peptid topper avledet fra
278GIQQLYGGESGFPTK
292 og
299TTSRPSVPDKPK
310 (Fig. 3). Derfor Thr og Tjen rester innenfor disse peptidene representerer mulige
O
-glycosylation nettsteder. Thr
291, Thr
299, Thr
300, og Ser
301 ble foreslått til å være områder av
O
-glycosylation ved mutasjon analyse [10], [13]. I tillegg fant vi at Ser
304 er også glykosylert i HT1080 celler ved å oppdage en glycopeptide signal fra
303PSVPDKPK
310 av MS
2 analyse av sodiated ion [M + Na]
+ topp på
m /z
2,791.9 som i fig. 3 (data ikke vist). Selv om disse resultatene er i stor grad bekreftende analysen avslørte også den heterogene
O
-glycosylated peptid topper fra
299TTSRPSVPDKPK
310 (Fig. 4). Således, et helt protein MS-analyse ved bruk av flytende matriks er et kraftig verktøy for å analysere heterogenitet av glykosylering. Fremgangsmåten er lett å bruke selv for kliniske prøver hvor spesifikke antistoffer som er tilgjengelige for immunoaffinitetskromatografi rensing av target-proteiner fra celler, vev, serum og urin. Siden endret glykosylering av proteiner har blitt knyttet til kreft progresjon [3], [4], [5], on-target separasjon metode med 3AQ /CHCA vil akselerere analyse av heterogenitet av
O
-glycosylation for forskjellig kreftrelaterte proteiner. Hvis det er kreftspesifikke variasjoner var identifisert
O
-glycans kan representere nye kandidat biomarkører for ondartede svulster. I tillegg er det økende interesse for bioteknologi-baserte legemidler som er produsert ved hjelp av levende celler. Glykosylering status til disse biologiske produkter har vist seg å være viktig av de farmakologiske egenskapene [22]. Den nåværende MALDI-MS metoden kan bli et verdifullt verktøy for glycoanalysis av kliniske prøver samt vurdering for kvaliteten av biologiske legemidler.
Materialer og metoder
Cell Culture
Humant HT1080 fibrosarkom-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum, 10 pM MMI270 (et syntetisk hydroksaminsyre matriks-metalloproteinase-inhibitor, en slags gave av Novartis Pharma AG, Basel, Sveits), og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Lentiviral Vektorer for MT1-MMP uttrykk og knockdown
Den shRNA sekvens brukes til knockdown av MT1-MMP var 5′-CACCGCAGCCTCTCACTACTCTTTCCGAAGAAAGAGTAGTGAGAGGCTGC-3 «. Et DNA-fragment som koder for sekvensen ble subklonet inn i pENTR /U6 TOPO (Invitrogen) og deretter overført via rekombinasjon inn mot lentivirus vektoren pLenti6 BLOCK det (Invitrogen). En konstruksjon som koder human MT1-MMP merket med FLAG epitop (DYKDDDDK) ble beskrevet tidligere [23]. En cDNA-klon av FLAG-merket MT1-MMP (MT1-FLAG) ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av de følgende primere: 5»-CACCATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3 «og 5′-TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3». Den forsterkede MT1-FLAG sekvensen ble subklonet inn pENTR /D-TOPO og deretter overført via rekombinasjon inn i lentiviral pLenti6 /V5-MÅL uttrykk vektor (Invitrogen). Disse lentiviral vektorer ble generert og brukes i henhold til produsentens instruksjoner.
MT1-MMP knockdown og revercellelinje
MT1-FLAG ble uttrykt i lentivirus-infiserte HT1080 celler (revertante celler) der uttrykket av endogen MT1-MMP ble først tømt ved å uttrykke shRNA targeting den endogene MT1-MMP (knockdown celler). MT1-FLAG ble uttrykt på et nivå lik som villtype protein basert på Western blot analyse.
Hele cellelvsat Forberedelse
35 cm
2 celle-kultur retter som inneholder Subkonfluente vill-type, MT1-MMP knockdown og MT1-FLAG rever HT1080-celler supplert med 10 uM MMI270 ble vasket med PBS og lysert ved koking i 200 pl Laemmli prøvebuffer [24] som inneholdt 5% β-merkaptoetanol. En 10 ul aliquot av lysatet ble benyttet for Western blot-analyse.
Membrane Lysatfremstilling
Alle prosedyrer ble utført ved 4 ° C. Sixteen 150 cm
2 celle-kultur retter som inneholder subsammenflytende kulturer av villtype eller MT1-FLAG rever HT1080 celler supplementated med 10 mm MMI270 i media ble vasket med PBS og skrapte i 32 ml sukrose /Hepes buffer (0,25 M sukrose /20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) inneholdende proteaseinhibitorer (protease-inhibitor cocktail sett I, Calbiochem, San Diego, CA). Cellene i buffer var Dounce-homogenisert (10 ganger). Homogenatet ble sentrifugert ved 1000 x g i 7 min. Pelleten ble rehomogenisert i 16 ml sukrose /Hepes-buffer, og suspensjonen ble sentrifugert 1000 x g i 7 min. Supernatantene ble slått sammen og sentrifugert ved 2000 x g i 30 min. Supernatanten fra denne sentrifugering ble ultrasentrifugert ved 105.000 x g i 1 time. Pelletene ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (1% Triton X-100/20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) inneholdende proteaseinhibitorer og deretter sentrifugert ved 20 000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blir referert til som den membranen lysat, noe som resulterer i en proteinkonsentrasjon på 10 mg /ml. Proteinkonsentrasjonen i lysat ble bestemt ved hjelp av en Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) med BSA som en referansestandard.
Endogene MT1-MMP Isolation
et monoklonalt antistoff for endogen MT1-MMP isolasjon ble utarbeidet i vårt laboratorium ved en genetisk immunisering metode [25] med en full-lengde human MT1-MMP uttrykk plasmid. Dette antistoffet gjenkjenner en region i en stamme domene av MT1-MMP (et papir under forberedelse). En 70 ug prøve av MT1-MMP-spesifikt antistoff ble kovalent bundet til 10 mg av epoksy-funksjonaliserte magnetiske kuler etter den angitte protokoll (Dynabeads M-270 epoksy, Invitrogen). For immunoutfelling, ble 1 ml av membranlysatene fremstilt fra villtype HT1080-celler inkubert i 24 timer ved 4 ° C med 10 mg av anti-MT1-MMP-antistoff-konjugerte perler. Etter inkubering, ble harpiksen oppsamlet med en magnet og vaskes med lyseringsbuffer. Det bundne MT1-MMP ble eluert med 0,1 M glycin-HCl (pH 3,0), og deretter nøytralisert med 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Eluatet ble konsentrert til 20 mL (ca 7,5 ng protein /mL) ved diafiltrering å bruke en Amicon Ultra-enhet (cut-off: 10 kDa, Millipore, Billerica, MA).
FLAG-merket MT1-MMP Isolation
Isolering av MT1-FLAG ble utført ved bruk av anti-FLAG M2 magnetiske kuler (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, ble 1 ml av membranlysatene fremstilt fra MT1-FLAG rever HT1080-celler inkubert i 16 timer ved 4 ° C med 20 pl av harpiksen. Den MT1-FLAG ble eluert med 3 × FLAG peptid i TBS som inneholder 0,1% CHAPS. Eluatet ble konsentrert til 20 ul (omtrent 25 ng protein /mL) som beskrevet ovenfor.
Oppløselig MT1-MMP Fremstilling
An MT1-MMP transmembrandelesjonsmutant ble renset fra det kondisjonerte medium av Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler som beskrevet tidligere [26].
sialidase Behandling
for desialylering, ble 500 ng av analytt behandlet med 5 mU sialidase /neuraminidase F (EC 3.2 .1.18. fra
Streptococcus
, Seikagaku Co., Tokyo, Japan) ved 37 ° C i 16 timer i 20 ul TBS som inneholder 0,1% CHAPS.
SDS-PAGE
prøver i Laemmli prøvebuffer inneholdende 5% β-merkaptoetanol ble kokt i 5 minutter og deretter sentrifugert ved 20 000 x g i 5 minutter ved 25 ° C. Supernatantene ble underkastet diskontinuerlig Tris-glycin-SDS-PAGE ved anvendelse av en 4% stabling gel og en 10% separering av gelen.
Western Blot
Etter elektroforese materialer i SDS-PAGE-geler var elektrooverført på PVDF-membraner (Millipore), og membranene ble blokkert med 5% skummet melk i PBS. Immunoreaktive materialer ble detektert ved farging med de angitte antistoffer ved hjelp av kjemiluminescens substratet Western Lightning (Perkin Eimer Inc., Waltman, MA). Følgende antistoffer ble brukt i denne studien: et monoklonalt anti-MT1-MMP-antistoff (222-1D8, en sjenerøs gave fra Dr. Kazushi Iwata, Daiichi Fine Chemical, Takaoka, Japan), en polyklonale anti-FLAG antistoff (Sigma-Aldrich ), et monoklonalt anti-β-tubulin-antistoff (E7, utviklingsstudier Hybridom Bank, University of Iowa, USA), pepperrot-peroksidase-konjugert anti-muse-IgG-antistoff og anti-kanin-IgG-antistoff (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ).
Densitometry
intensiteten av Coomassie Blue-farget protein ble kvantifisert ved hjelp ImageJ 1,43 programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
3AQ /CHCA flytende Matrix
Konsentrert 3AQ /CHCA ble fremstilt ved å oppløse 35 mg av 3-aminokinolin (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich) i 150 ul av en mettet oppløsning av α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Frankrike) i metanol. Den konsentrerte 3AQ /CHCA løsningen ble fortynnet 10 ganger med 100 mM ammoniumfosfat, og betegnes som den flytende matriks 3AQ /CHCA. En mettet CHCA oppløsning ble fremstilt ved å oppløse 10 mg av CHCA i 540 pl av 50% acetonitril /0,1% trifluoreddiksyre og 60 pl 100 mM ammoniumfosfat.
DHB Matrix
DHB (2- , 5-dihydroksybenzosyre) matriseoppløsning ble fremstilt ved å oppløse 10 mg av DHB (LaserBio Labs) i 1 ml 50% acetonitril /0,1% trifluoreddiksyre. For DHB matriseanalyse, ble en 0,5 pl prøve av tryptisk MT1-MMP digest som hadde blitt blandet med et likt volum av DHB matriseoppløsning prikket inn på en sikteplate og tillatt å tørke.
Tryptic In-gel Fordøyelse
i-gel-fordøyelse ble utført i henhold til metoden ifølge Shevchenko
et al product: [27]. En region av gelen som inneholdt MT1-MMP-protein farget med kolloidal Coomassie Blå G-250 (SimpleBlue SafeStain, Invitrogen) ble skåret ut og kuttet i små biter. De MT1-MMP gelbitene ble avfarget med 50 mM ammoniumbikarbonat i 50% metanol og deretter tørket under vakuum sentrifugering.
