Abstract
Wnt signal er en kritisk regulatorisk vei i utvikling og sykdom. Svært lite er kjent om mekanismene for Wnt signal i prostatakreft, en ledende årsak til død hos menn. En kvantitativ analyse av ekspresjonen av Wnt5A protein i humane vev matriser, inneholdende 600 prostatavev kjerner, viste 50% økning i ondartet sammenlignet med benigne kjerner (
p
0,0001). I en matchende par av prostatakreft og normal cellelinje, ekspresjon av Wnt5A protein ble også øket. Kalsium bølger ble indusert i prostata-celler i respons til Wnt5A med en 3-ganger økning i Flou-4 intensitet. Aktiviteten av Ca
2 + /kalmodulin-avhengig proteinkinase (CaMKII), en transduser av den ikke-kanonisk Wnt /Ca
2+ signalering, økt med 8 ganger i kreftceller; ingen endring ble observert i β-catenin uttrykk, kjent for å aktivere den kanoniske Wnt /β-catenin veien. Bryting av offentlig tilgjengelige humane prostata cancer oligoarray datasett avslørte at ekspresjonen av mange gener (for eksempel CCND1, CD44) under kontroll av β-catenin transkripsjon er nedregulert. Konfokal og kvantitativ elektronmikroskopi viste at spesifikk inhibering av CaMKII i kreftceller fører til ombygging av aktin cytoskjelettet, uregelmessige sårkantene og løs intercellulær arkitektur og en seks og åtte ganger økning i hyppigheten og lengden av filopodia, respektivt. Omvendt, ubehandlede normale prostataceller viste en uregelmessig sår kant og løs inter arkitektur; inkubasjon av normale prostataceller med rekombinant Wnt5A protein indusert aktin ombygging med en vanlig sår kant og økt sårtilheling kapasitet. Levende celle avbildning viser at en funksjonell følge av CaMKII inhibering ble 80% reduksjon i sårheling kapasitet og redusert cellemotilitet i kreftceller. Vi foreslår at ikke-kanoniske Wnt /Ca
2 + signalering via CaMKII fungerer som en roman regulator av strukturell plastisitet og cellemotilitet i prostatakreft
Citation. Wang Q, Symes AJ, Kane CA, Freeman A, Nariculam J, Munson P, et al. (2010) A Novel rolle for Wnt /Ca
2 + Signale i Actin Cytoskjelett Ombygging og cellemotilitet i prostatakreft. PLoS ONE fem (5): e10456. doi: 10,1371 /journal.pone.0010456
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 19 november 2009; Godkjent: 08.04.2010; Publisert: 04.05.2010
Copyright: © 2010 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Cancer Institute og Prostate Cancer Research Center, Storbritannia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vingeløse /Wnt gener kode for en familie av utskilte glykoproteiner som regulerer mange cellulære prosesser [1], [2]. Avvikende signalisering gjennom Wnt signalbaner som er knyttet til en rekke sykdommer, inkludert kreft [3] – [6]. Wnt signal skjer via den kanoniske (Wnt /β-catenin, CTNNB1) og ikke-kanoniske (Wnt /Ca
2 +) veier [3], [7]. En mindre godt beskrevet Wnt veien er Wnt-JNK veien [8]. Signalering via Wnt /β-catenin vei aktiverer transkripsjon av mange gener, for eksempel cyclin Ds og membran metalloproteinaser (MMP), via TCF /LEF faktorer. Wnt /Ca
2+ vei fører til en økning i intracellulært kalsium [9] og aktivering av kalmodulin-avhengig protein-kinase II (CaMKII) [10], og er kjent for å modulere celle bevegelse og opptreden [11], [12] og induserer strukturelle endringer [11], [13], [14]. Koblingen mellom økt β-catenin signalisering i tumorigenese og økt transkripsjon av gener som er involvert i celle-transformasjon og spredning er dokumentert, men rollen ikke-kanonisk Wnt /Ca
2+ signalering i kreft er bare langsomt blir belyst [15] [16].
prostatakreft står for anslagsvis 25% av alle nye krefttilfeller og er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn [17]. Verken uttrykket av Wnt proteiner eller mekanismer for Wnt signal i prostatakreft blir forstått [18]. Tidligere studier konsentrert på karakterisering av wnt reseptorer, reseptor-relaterte proteiner og ekspresjon av gener wnt [5], [19] – [21], i prostata kreftcellelinjer. Direkte interaksjon mellom androgenreseptoren (AR) og TCF for β-catenin og andre transkripsjons co-faktorer ble også foreslått [22]. Imidlertid har bare en liten prosentandel av prostatakreft prøvene dysregulerte ødeleggelse kompleks eller mutert β-catenin [18]. Det er derfor sannsynlig at andre mekanismer, kanskje direkte knyttet til Wnt signal, kan være involvert
Vi har nylig viste [23] at WNT5A (en av de 19 medlemmene av Wnt familie) genuttrykk økes ( 50 ganger) i prostata kreft vev og kreftcellelinjer på grunn hypometylering. Men viktige spørsmål om Wnt5A uttrykk og mekanismene for Wnt5A mediert signalering i prostatakreft forbli. For eksempel vet vi ikke (i) om økningen i WNT5A gentranskripsjon resultater i økt Wnt5A protein uttrykk i ondartede svulster? (Ii) Om kanonisk eller ikke-kanoniske signalveien er aktivert i prostata kreft? (Iii) Hva er den funksjonelle rollen Wnt signalering i prostata kreft? For å løse disse spørsmålene vi testet følgende hypoteser: (i) Det Wnt5A protein uttrykk økes i human prostatakreft (ii) At Wnt /β-catenin signal bør resultere i økt uttrykk av TCF /LEF målgener som MMP og TIMP3 i prostatakreft (iii) Aktivering av Wnt /Ca
2+ signalering i prostatakreftceller bør resultere i en økning i CaMKII enzymaktivitet som forårsaker endringer i cytoskjelettet og celle motilitet. Vi viser, for første gang, at Wnt5A protein ekspresjon økes i malign human prostata sammenlignet med godartet vev og Wnt /Ca
2+ signaleringsmekanisme blir aktivert i prostatakreftceller. Vi tilbyr også romanen mekanistisk bevis for en kritisk rolle for CaMKII som en modulator av aktin cytoskjelettet og cellemotilitet i prostatakreft.
Resultater
RNA transkripsjon vurdering ved bruk av Real Time PCR
Vi målte mRNA nivåer for WNT5A (tabell S1), tidligere identifisert fra vår oligoarray analyse skal dysregulerte i prostatakreftceller [23]. WNT5A mRNA vises i samme størrelsesorden i endring (-50 ganger) i 1542-CP
3TX kreftceller sammenlignet med vanlige 1542-NPTX celler, enten målt ved hjelp oligoarray [23] eller real time PCR (tabell S1). WNT5A transkripsjon kommer også til uttrykk i andre prostatakreft cellelinjer f.eks PC3 og DU145 [19], [23].
Wnt5A protein uttrykk i ondartet og godartet menneskelige prostata
3,3-diaminobenzidin (DAB) etikett, som representerer Wnt5A uttrykk, ble observert i begge ondartede og godartede vev kjerner (fig. 1A og B). Vi kvantifisert etiketten, på en objektiv måte, ved hjelp av en reproduserbar, semi-automatisert partikkelanalyse (Analyser partikler) protokollen ved hjelp av ImageJ programvare [24] etter omdannelse RGB-bilder til 16-bits gråskala (figur 1C og D) fra 600 individuell prostatavev kjerner (se Materialer og metoder). Beregnede parametere av tellingen, totalt areal, gjennomsnittlig størrelse og område fraksjon er gitt i Tabell S2. Integrering av arealet under kurven viste en 55%, 25% og 45% økning i det totale areal, gjennomsnittlig størrelse og område fraksjon (samlet areal /totalt antall bildepunkter), som representerer i hvilken grad og intensitet av farging, i maligne kjerner (n = 301 ) sammenlignet med benigne kjerner (n = 299), henholdsvis (figur 1E, F og G) som var svært signifikant (p 0,0001, Student t-test). Disse resultatene indikerer at Wnt5A ekspresjon er økt i forhold til ondartet godartet human prostata.
Representative ondartet (A) og godartet (B) vev kjerne fra humane prostata matriser som benyttes til å beregne Wnt5A uttrykket (DAB etikett, brun, i stor grad i akinærceller). RGB-bilder (A og B) ble konvertert til 16 bits bilder (C og D) for kvantifisering av DAB-signalet ved hjelp Analyser Particle protokollen i ImageJ programvare for å få Bruttoareal farget (E) og gjennomsnittlig størrelse på partikkel måles (F) i piksel, og området fraksjon (G, totalt areal delt på totalt antall piksler i bildet). Wnt 5A uttrykk ble økt i maligne v godartede kjerner (p 0,0001). Hver bin er data for et individ, ondartet (rød, n = 301) eller godartet (grønn, n = 299) kjerne.
Mekanismer av Wnt-signal i prostatakreft
Expression of Wnt5A protein var også høyere i 1542-CP
3TX kreftceller sammenlignet med matchede normale 1542-NPTX celler (fig. 2A). Det var også en samtidig reduksjon (2,5 ganger) i mRNA karakter CTNNB1 og andre elementer av Wnt /β-catenin signal (f.eks Axin, DVL1, GSK3p) i kreftceller sammenlignet med normale celler (tabell S1). Antagonisme av β-catenin som følge av overekspresjon av Wnt5A, noe som fører til nedregulering av Wnt /β-catenin mål har blitt foreslått tidligere i melanoma [25] og Xenopus embryoer [11]. β-catenin proteinekspresjon, ved hjelp av Western blotting viste et enkelt bånd (~94kDa) i en proteinkonsentrasjonsavhengig måte, i cellelysater fra både 1542-CP
3TX og 1542-NPTX celler (Fig. 2B). Densitometriske analyser viste at det ikke var noen endring i β-catenin protein i kreft sammenlignet med normal cellelinje (Fig. 2C). Videre, i henhold til våre oligoarray data [23] en rekke Wnt /β-catenin mediert TCF transkripsjon målgener viste redusert mRNA uttrykk i kreftceller (Tabell S3). En detaljert undersøkelse på protein og funksjonelt nivå av utvalgte mål av TCF /LSF transkripsjon (f.eks MMP2, MMP14 og TIMP3) [26] bekreftet disse observasjonene. mRNA-ekspresjon av disse genene var 3-10 ganger lavere i kreftceller sammenlignet med normale celler (tabell S1) som støttes av indirekte immunfluorescens (fig. S1). MMP-14 aktivitet skal gjenspeile likevekt mellom MMP-14 katalytisk og TIMP3 regulatoriske aktiviteter. MMP aktivitet var tre ± 0,06 ganger lavere i kreftcellene ved hjelp av gelatin zymografi (fig. S2). Disse resultatene bekreftet at en rekke mål for Wnt /β-catenin signalveien ble nedregulert ved gen, protein eller funksjonelle nivå.
Western blot av (A) Wnt5A proteinekspresjon, som viser høyere nivå i 1542-CP
3TX (CP) celler sammenlignet med 1542-NPTX (NP) celler. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) β-catenin (94kDa) ekspresjon i cellelysat fra 1542-CP
3TX og 1542-NPTX cellelinjer (GAPDH, 35kDa, brukt som en proteinlastekontrollen på samme blott). (C) Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av kommersiell programvare (GeneTools, Synoptics, UK). NP (fylt bar) = 1542-NPTX og CP (hul bar) = 1542-CP
3TX.
analyse av genuttrykk av CTNNB1 og TCF /LEF transkripsjons mål, ved hjelp Oncomine [27 ] og GeneSpring programvare og offentlig tilgjengelige microarray datasett for normal (ikke-neoplastisk eller godartet)
vs
prostatakreft vev, viste at uttrykket av nesten alle Wnt /β-catenin /TCF mål analysert, bortsett fra c-myc ble redusert i prostatakreft (fig. S3). Disse resultatene er lik de for prostata cellelinjer og viser at β-catenin mediert økning i TCF-transkripsjon var ikke sannsynlig å være mekanismen for Wnt signalisering i prostata kreft. Vi testet derfor hypotesen om at i prostata kreft, er Wnt signal omformet via Wnt /Ca
2+ veien. Vi utførte eksperimenter for å fastslå om Wnt5A direkte indusert kalsium utgivelse i prostata celler. Tilsetning av Wnt5A peptid-indusert kalsium bølger, som varer opp til 100s, i prostatakreft-cellelinje med et 3,1 ± 0,1 (n = 12) fold økning i intensiteten av Flou-4 fra grunnlinjen (fig 3 og film S1).
en representant graf av kalsium utgivelse i prostatakreft cellelinje (PC3) som en funksjon av Fluo-4 intensitet endrer seg over tid ved hjelp av konfokal levende celle bildebehandling. Den grønne linje representerer endringen i Fluo-4 intensitet (grønn linje) i (A) kontroll (etter tilsetning av kjøretøyet PBS) eller (B) rekombinant Wnt5A peptid (100 ng /ml). Det var en 3,1 ± 0,1 ganger økning i Fluo-4 intensitet etter tilsetning av Wnt5A (n = 12). I noen forsøk Fura Rød (rød linje) ble lastet med Fluo-4. Forholdet mellom endringen i Fluo-4 og Fura-rødt er plottet i (C).
CaMKII aktivitet og dens rolle i strukturell plastisitet av prostataceller
CaMKII er en stor transduser av Wnt /Ca
2 + signalering. I alle prostata cellelinjer CaMKII enzymaktivitet var Ca
2+ avhengig, minst i 1542-NPTX, større i 1542-CP
3TX og DU145 og uttalt i PC3 cellelinje (Fig. 4). Det var en 4 og 8 ganger økning i Ca
2 + -avhengig CaMKII aktivitet in1542-NPTX og 1542-CP
3TX celler (Fig. 4), henholdsvis. Enda viktigere, Ca
2 + avhengig aktiviteten CaMKII ble økt med ~4 ganger i 1542-CP
3TX i forhold til 1542-NPTX (
innfelt
Fig. 4). Disse resultatene indikerer en økning i aktiviteten av CaMKII i kreftceller i forhold til normale celler.
fosfotransferaseaktivitet av CaMKII i cellelysatene ble målt ved anvendelse av en [γ-
32P] ATP-baserte CaMKII assay ( Upstate, UK) med Ca
2 + (skraverte søyler) eller uten Ca
2 + (hule søyler).
Innfelt
: Ca
2 + -avhengig CaMKII aktivitet ble beregnet som beskrevet i materialer og metoder. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra 3 eksperimenter. NP is1542-NPTX, CP is1542-CP
3TX, er DU DU145 og PC er PC3 prostata cellelinje.
For å undersøke hvilken rolle Wnt signal i aktin cytoskjelettet av normale og kreft prostata celler brukte vi et sår /ripe analyse i kombinasjon med konfokal og scanning elektronmikroskopi og levende celle bildebehandling. For det første var den fremre kant av såret observert for aktin-remodellering, ved hjelp av konfokal mikroskopi etter farging med fluorescensmerkede phalloidin. I 1542-CP
3TX celler forkanten av såret, ved 4 timer post-såret, viste glatt, regelmessig aktin farging, med celler som forekommer i en lamellipodia som dannelse (Fig. 5A). I 1542-celler NPTX den fremre kant av såret var uregelmessig med morfologi av individuelle celler, noen med fin filopodia lignende strukturer synlige ved 4 h (fig. 5B).
Celler ble såret og farget med fluorescein phalloidin- -5-(FITC, grønn) for å visualisere aktin filamenter med en Leica SP2 konfokal mikroskop. A, B og G har de ubehandlede 1542-CP
3TX, 1542-NPTX og PC3-celler, respektivt. C, D og H er AIP (10 mm) behandlet 1542-CP
3TX, 1542-NPTX og PC3 cellene, henholdsvis. E og F er 1542-CP
3TX og 1542-NPTX behandlet med rekombinant Wnt5A (100 ng /ml). Uregelmessig såret forkant og løs av inter tilkoblinger og fine filamenter av aktin (filopodia som utstikkere), hvite piler, er synlig i 1542-NPTX normale celler og etter AIP behandling i 1542-CP
3TX og PC3 kreftceller. Propidiumjodid ble anvendt for å farge nukleinsyre (rød). Scale bar = 10 mikrometer
Vi neste testet følgende hypoteser: (i) hemming av CaMKII skal forstyrre såret ledende i prostatakreft cellelinjer (ii) aktivering av Wnt5A signalering i 1542-NPTX celler skal fremme aktin ombygging av såret som ble observert i 1542-CP
3TX celler. Vi brukte Myristoylated autocamtide-2-relaterte inhiberende peptid (AIP), en inhibitor av CaMKII, og rekombinant Wnt5A protein (for å aktivere Wnt signalisering) i normale celler og kreftceller for å teste disse hypotesene (fig. 5). Konfokalmikroskopi sårede /riper monolag av 1542-CP
3TX celler inkubert med AIP (10 mm) vises forstyrret, uregelmessig sår forkant med fin filopodia (Fig. 5C, piler) sammenlignet med vanlig såret kanten i ubehandlede celler (Fig . 5A). Den fremre kant av sårede 1542-NPTX celler med eller uten AIP viste en uregelmessig kant, med løs celle til celle kontakt og fine aktin filament fremspring (fig. 5B og D). Disse mikrografer viser at hemming av CaMKII i 1542-CP
3TX kreftceller induserer filopodia som fremspring. Omvendt, såret 1542-NPTX normale celler, inkubert med rekombinant Wnt5A protein (100 ng /ml), viste en vanlig ledende kant (fig. 5E) av såret sammenlignet med den ubehandlede kontroll (Fig. 5B). Ingen åpenbar forskjell ble observert i ledende såret kanten for ubehandlet vs Wnt5A protein inkuberes 1542-CP
3TX celler (fig. 5A og F).
For å validere at aktin ombygging ble formidlet av CaMKII og ikke via andre kinaser (f.eks CaMKIV, PKA, PKC, Raf eller MAPK1, JNK1α1, eller Raf), brukte vi tatCN21a, en spesifikk hemmer av CaMKII [28]. 1542-CP
3TX celler behandlet med 5 uM av tatCN21a viste uregelmessige sårkantene, løs celle til celle kontakt og filopodia dannelse (Fig. S4) som den som ble observert med AIP (fig. 5). Hemming av CaMKII også indusert, uregelmessig såret kanten, løsner fra celle til celle kontakt og filopodia i andre prostatakreft cellelinjer inkludert PC3 (fig. 5G og H og Fig. S5), DU145 (Fig. S6) og androgen sensitive LNCaP cellelinje (fig. S7).
Den mekanismen som CaMKII hemming forårsaket filopodia formasjon i prostatakreftceller var neste vurdert. Vi brukte scanning elektronmikroskopi for å kvantifisere filopodia lignende strukturer (fig. 6). Lav forstørrelse skanning elektronmikroskopi av 1542-CP
3TX celler viser jevne og ujevne sår kanter i ubehandlet (
innfelt
Fig. 6A) og AIP behandlede celler (
innfelt
Fig. 6B ). Høy forstørrelse Bildene viser tydelig mange og utvidet fin filopodia som anslagene fra cellemembranen (Fig. 6B) i AIP behandlet 1542-CP
3TX celler sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 6A). Inhibering av CaMKII med AIP forårsaket en lignende effekt i PC3 cellelinje (Fig. 5 H og S5b fig.). Frekvensen og lengden av filopodia ble målt manuelt ved hjelp ImageJ programvare. En gaussisk tilpasning av lengden fordeling histogram av behandlet og ubehandlet 1542-CP
3TX-celler viste en 8 gangers økning i lengde og en seks gangers økning i den totale frekvensen av filopodia som fremspring i AIP behandlede sammenlignet med ubehandlet 1542-CP
3TX celler (fig. 6C og tabell 1). Histogrammet kan monteres i minst to lengder av filopodia som fremspring i 1542-CP
3TX celler: lang (opp til 2 um) og meget lang (mer enn 2 um). Videre analyser viste at det var en 5 gangers økning i lengde, men en mye større (15 ganger) økning i hyppigheten av de svært lange fremspringene i AIP behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler (tabell 1). Disse resultatene bekrefter en stor rolle for CaMKII mediert Wnt signal i aktin ombygging i prostata kreft ved å redusere lengden og hyppigheten av filopodia.
Hoved bildene er representative bilder (skala bar en mikrometer) av ubehandlet (A) og AIP (10 uM) ble behandlet (B) celler. Innfelt er lav forstørrelse bilde (skala bar 10 mikrometer) i hovedbildet. Uregelmessig såret kanten og fine filopodia som utvekst er synlige etter behandling med AIP (B, hovedbildet). Lengde på filopodia som utstikkere ble målt ved hjelp av Image J programvare og konvertert til distribusjon histogram (C) for AIP behandlet (hule søyler) og ubehandlede (skraverte søyler) celler. Det ble observert en 8 ganger økning i arealet under kurven for behandlede sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av en Gaussian passform.
Funksjonelle konsekvenser av Wnt /Ca
2 + signalering i prostata kreftceller
Cytoskjelett spiller en viktig rolle i cellen motilitet. For å undersøke mulige manifestasjoner av cytoskeletal endringer vi testet hypotesen om at CaMKII hemming vil redusere cellemotilitet i prostata kreft cellelinjer. Vi brukte såret scratch-analysen og levende celle avbildning med Incucyte (Essen Instruments) for å beregne hastigheten for sårheling som et mål på celle motilitet. Satsen for sårheling ble redusert med 80% i PC3 kreftcellelinjer som ble behandlet med AIP (Fig. 7 og Movie S2, kontroll og Movie S3, AIP).
Confluent PC3 prostatakreftcellelinjer ble såret og avbildes over natten på 1t mellomrom. Bildene ble avsatt (se filmer S2, kontroll og S3, AIP) og data importeres til et regneark. Tilsetting av AIP (10 mikrometer, klekket bar) reduserte satsen for sårheling med 80% sammenlignet med kontrollgruppen (hul bar, * p 0,001) eller Wnt5A (100 ng /ml, solid bar). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE, signifikans av forskjell mellom kontroll og AIP ble oppnådd ved ANOVA. Hastighet for sårheling ble bestemt ved å utføre lineær regresjon for å beregne helningen av linjen (
Innsatt
, representative for n = 6-7) for ubehandlet kontroll (fylte trekanter,
R
= 0,99) , Wnt5A (fylte firkanter,
R
= 0,99) eller AIP (fylt sirkel,
R
= 0,97) behandlet PC3 celler.
Diskusjoner
Wnt uttrykk og mekanismer for Wnt signal fortsatt et lite undersøkt område i prostata. Vi viser at (i) Wnt5A proteinekspresjon er økt i forhold til ondartet godartet humant prostatavev og i kreftcellelinjer i forhold til det normale. (Ii) Wnt5A er store svinger av Wnt signal via aktivering av Wnt /Ca
2 + sti og ikke Wnt /β-catenin banen i prostata celler. (Iii) Aktivering av CaMKII er en ny og kritisk regulator av cytoskjelettet i prostata kreft. (Iv) CaMKII hemming reduserer betydelig cellemotilitet og kapasiteten på sårtilheling i prostata kreft cellelinjer.
En forståelse av det molekylære grunnlaget for prostatakreft, og den rollen signaliserer nettverk som Wnt-veien, krever ikke bare en fullstendig beskrivelse av genet og protein ekspresjon i humane prostatavevet, men også et cellesystem med å undersøke mekanismene for signalering og dens funksjonelle konsekvenser sykdom. Våre prostatavev array-undersøkelser viser at det var en svært signifikant (p 0,0001) økning i både det totale areal (utstrekning) og gjennomsnittlig størrelse på de merkede partikler (intensitet) og område fraksjon (figur 1E, F og G og Tabell S2) . Disse resultatene støtter tidligere observasjoner av økning i uttrykket av Wnt5A genet i prostata kreft på grunn av hypometylering [23] og også en veldig fersk rapport fra Yamamoto
et en
l [29] som brukes konvensjonelle, ikke-quantiative , histologisk undersøkelse for å vurdere Wnt5A uttrykk prostata. Denne informasjonen er også i samsvar med det som ble oppnådd for normal (1542-NPTX) og kreft (1542-CP
3TX) cellelinjer (figur 2). Samlet utgjør de humane vev og cellelinje-data tyder på at Wnt5A protein blir uttrykt i normal (eller godartet) vev, men dens ekspresjon øker dramatisk i ondartet (kreft) prostatavev og denne endringen blir reflektert i de cellelinjene som ble brukt i denne studien.
Nesten alle kjente transkripsjons mål aktiveres av Wnt /β-catenin vei, f.eks CTNNB1, CCCNDs, MMP, PITX2, CD44, APCDD1, juni [30] – [32], uendret eller nedregulert i prostata kreft vev eller cellelinjer i forhold til normalt vev eller cellelinje (Fig. S3 og tabell S1) . Disse resultatene indikerer at cellelinjen datasettet skyldes i stor grad den genuttrykksmønstrene for TCF /LEF-regulerte gener i både cellelinje og kreftvev. Videre var det ingen økning i proteinekspresjon eller funksjonelle aktiviteten til nedstrøms mål for kanonisk Wnt-signalering (for eksempel MMP-14). Dette tyder på at 1542-NPTX og 1542-CP
3TX og PC3 cellelinjer kan være en nyttig modell for å undersøke mekanismene for Wnt signal i prostatakreft som integriteten av Wnt signale elementer i prostata kreft er bevart i disse cellelinjene på genet, protein og funksjonelle nivå.
CaMKII er en viktig formidler av Wnt /Ca
2+ signalering, selv om en ytterligere undergruppe av det ikke-kanonisk Wnt signalering via Wnt5A er foreslått å være en β-catenin degradering svei som ikke krever aktivering av CaMKII [33]. En tre gangers økning i fri intracellulær kalsiumkonsentrasjon ble observert etter tilsetting av Wnt5A i prostata celler (figur 3 og Movie S1). I tillegg fikk vi ikke se en nedgang i β-catenin protein uttrykk og aktivitet CaMKII ble funnet å øke i prostatakreft cellelinjer, noe som indikerer at Wnt /Ca
2+ vei var trolig være operativ via CaMKII i prostata kreft
De mange rollene som CaMKII i aktin ombygging, cellemotilitet og migrasjon av normale keratinocytter, muskel og nerveceller er kjent [34] -. [36]. Men involvering av CaMKII mediert Wnt /Ca
2 + signalering i sykdom er mindre godt karakterisert. Pukrop
et al product: [37] har foreslått at det ikke-kanonisk reaksjonsvei kan være involvert i den økte migrasjon /invasivitet av MCF7-brystkreftcellelinjer ved rekombinant Wnt5A blir tilsatt til cellekulturen. Imidlertid mekanismer eller hvorvidt Wnt5A mediert sin virkning gjennom CaMKII aktivering, ble ikke undersøkt. Cellemotilitet krever to hovedtyper av aktin baserte strukturer i cellemembranen, lamellipodia og filopodia. Det er blitt foreslått, i fibroblaster, som filopodia formasjon fra lamellipodia er et tett regulert prosess som delvis kontrolleres av aktin-bindende proteiner, slik som aktivert (Ena) /vasodilator-stimulert fosfoprotein (VASP) capping aktin filamentet [38]. Fibroblaster flytte ved å utvide lamellipodia i forkant og dannelse av fine aktin strukturer i forkant fører retrograde bevegelse [39]; lagring av Ena /VASP til mitokondrier øker mens satsingen til cellemembranen reduserer bevegeligheten [38]. Rollen Wnt5A mediert signalisering i cellemotilitet [37] og andre mellomledd proteiner (f.eks Ena /VASP, Arp2 /3) i filopodia formasjonen har blitt undersøkt i menneskelige [14], [40] og mus [41] melanomceller. Weeraratna og medarbeidere [40] har foreslått at Wnt5A økt celle motilitet i humane melanomcellelinjer etter aktivering av proteinkinase C (PKC). Witze
et al product: [14] viste at akutt respons fra melanom cellelinjer til Wnt5A innebærer rekruttering av store cytoskeletal proteiner (aktin og myoxin IIB) og frizzled 3 og melanom celleadhesjonsmolekyl inn en intracellulær struktur via Wnt5A regulering av Rab4 og RHOB guanosine triphosphatases. En annen studie undersøkte rolle for Ror2 kinase i Wnt5A indusert cellemigrasjon [42]. I motsetning til de data som presenteres her, disse studiene [40], [42] verken undersøkt eller direkte manipulert CaMKII aktivitet i sine eksperimenter eller undersøkt sin rolle i filopodia formasjon. Vi brukte tatCN21a, en spesifikk inhibitor av CaMKII (men ikke CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1, eller Raf). Behandling av prostata kreft celler med tatCN21a også forårsaket en løsning av celle til celle kontakt og indusert filopodia dannelse (Fig. S4) ligner på resultatene oppnådd med AIP (Fig. 5). Disse resultater indikerer at inhibering av direkte CaMKII (og ikke CaMKIV, PKC, PKA og andre kinaser) resulterer i tap av celle-til-celle kontakt og filopodia dannelse i prostatakreftceller.
i prostatacancercellelinjer (1542 -cp
3TX og PC3) en jevn, regelmessig viklet kant er observert med tett celle til celle kontakt forut for lamellipodia som forkanten (fig. 4 og 5). I motsetning til dette, behandling med AIP induserer en økning i filopodia som fremspring med en løsning av celle-til-celle kontakt før den vikles kant (fig. 5 og 6 og tabell 1). Faktisk hastigheten for sårheling ble redusert med 80% etter hemming av CaMKII i kreftcellelinje (PC3). Omvendt, tilsetning av Wnt5A til normal cellelinje (1542-NPTX) økte hastigheten for sårheling (um /h) sammenlignet med ubehandlede celler med 25 ± 4%. Vi foreslår at aktivering av CaMKII via Wnt5A signalering er en fordel å kreftcelle mobilitet som det undertrykker dannelsen av fine filopodia som induserer retrograde bevegelse og dermed redusere celle mobilitet.
Protein uttrykk for Wnt5A i human prostatakreft og mekanismer for Wnt signal i normale og prostatakreft cellelinjer, som er beskrevet her, gir den første rammen for nøyaktig deltakelse av wnt reseptorene og sekretorisk frizzled relaterte proteiner [20], [21] og ulike aktin bindende proteiner og formidler signalmolekyler som Ena /VASP og ERK1 [34], [38], kan bli undersøkt i kreft. Ytterligere undersøkelser for å identifisere reseptoren (e) for Wnt5A binding og andre proteiner som er involvert i den nedstrøms signalisering via CaMKII i celle motilitet i prostata cancer vil bidra til å klargjøre den nye rolle CaMKII i undertrykkelse av filopodia formasjon for å øke celle motilitet i prostata cancer . Som konklusjon fra resultatene presentert her og vår nylig studie [23] som viser hypometylering som en regulator av Wnt5A gentranskripsjon i prostata, følgende sekvens kan tenkes: (i) Gene ekspresjon av Wnt5A økes i kreft sammenlignet med normale celler på grunn til hypometylering av genet promoter-regionen (ii) økning i genuttrykk resultater i økt proteinuttrykk av Wnt5A i human prostatakreft (iii) Wnt /Ca
2+ veien (og ikke β-catenin sti) er aktivert i prostatakreft celler (iv) Signa via Wnt /Ca
2 + pathway aktiverer CaMKII (v) CaMKII aktivitet, mest sannsynlig via mellommann signale involverer actin bindende proteiner, fører til en større omorganisering av cytoskjelettet i kreftceller ved å redusere lengden og hyppigheten av bot , filopodia som aktin strukturer. (Vi) cytoskeletal remodeling på grunn av CaMKII fører til en økning i celle motilitet. Målretting av Wnt /Ca
2 + signalering, spesielt CaMKII kan være et nyttig verktøy i prostata kreft terapi.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige prostata epitelcelledifferensiering line1542-NPTX og-CP 1542 prostatakreft cellelinje
3TX [43] (avledet fra normal og prostatakreft vev fra samme pasient [43]) ble hentet fra SL Topalian, National Cancer Institute, NIH, USA, opphavsmenn av disse cellelinjene. Prostata kreft cellelinje PC3 ble innhentet fra M E Kaighn opphavet til denne cellelinjen [44]. DU145 ble innhentet fra cellen bank vedlikeholdt av Jørgen Fogh ved Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA, fra et innskudd gjort av opphavsmannen til denne cellelinjen [45]. PC3 og DU145 ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) medium som inneholder 5 mM L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) og 1542-NPTX og 1542-CP
3TX ble opprettholdt i keratinocyte-SFM (KSFM) medium og kosttilskudd ( Invitrogen) med 5% FBS og KSFM kosttilskudd (Invitrogen).
Kvantitativ real Time PCR
Fluorescent real-time PCR (TaqMan, Applied Biosystems, UK) ble brukt til å bekrefte genuttrykk i 1542 -NPTX og 1542-CP
3TX opprinnelig identifisert fra microarray eksperimenter [23]. RNA-isolering er beskrevet andre steder [23]. TaqMan prober og primere for real-time PCR ble kjøpt som en pre-utviklet analysesystem; Applied Biosystems analyse IDer for probene som brukes og en kort protokoll er gitt i tabell S4.
