Abstract
Bakgrunn og Aim
Aberrant hypermethylation av kreftrelaterte gener har dukket opp som en lovende strategi for utvikling av diagnostiske, prognostiske og prediktive biomarkører i kreft hos mennesker, inkludert tykktarmskreft ( CRC). Målet med denne studien var å utføre en systematisk og omfattende analyse av et panel av CRC-spesifikke gener som potensielle diagnostiske, prognostiske og prediktive biomarkører i en stor, populasjonsbasert CRC kohort.
Pasienter og metoder
Metylering status for
SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4 og miR137
gener ble undersøkt ved kvantitativ bisulfite pyrosekvensering i en populasjonsbasert kohort av 425 CRC pasienter.
Resultater
metylering nivået for alle de gener som ble analysert var signifikant høyere i tumorvev sammenlignet med normal slimhinne (p 0,0001); Men kreft-assosiert hypermethylation ble hyppigst observert for
miR137 plakater (86,7%) og
IGFBP3 product: (83%) i CRC pasienter. Metylering analyse ved hjelp av kombinasjonen av disse to genene vist største nøyaktighet for identifisering av tumorer i kolon (sensitivitet 95,5%; spesifisitet 90,5%). Lave nivåer av
IGFBP3
promoter metylering dukket opp som en selvstendig risikofaktor for å forutsi dårlig sykdomsfri overlevelse i stadium II og III CRC pasienter (HR = 0,49, 95% KI: 0,28 til 0,85, p = 0,01). Våre resultater tyder også på at stadium II III CRC pasienter med høye nivåer av
IGFBP3
metylering ikke dra nytte av adjuvant 5-FU-basert kjemoterapi.
Konklusjon
Ved å analysere et stort, populasjonsbasert CRC årsklasse, vi demonstrere potensialet kliniske betydningen av
miR137 Hotell og
IGFBP3
hypermethylation som lovende diagnostiske biomarkører i CRC. Våre data viser også at
IGFBP3 hyper
metylering kan fungere som en uavhengig prognostisk og prediktiv biomarkør i stadium II og III CRC pasienter
Citation. Perez-Carbonell L, Balaguer F, Toiyama Y, Egoavil C, Rojas E, Guarinos C, et al. (2014)
IGFBP3
Metylering er en roman diagnostisk og prediktiv Biomarker i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (8): e104285. doi: 10,1371 /journal.pone.0104285
Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA
mottatt: 04.04.2014; Godkjent: 07.07.2014; Publisert: 15 august 2014
Copyright: © 2014 Perez-Carbonell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet av tilskuddet R01 CA72851 og CA181572 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health og midler fra Baylor Research Institute. Lucia Perez-Carbonell er en mottaker av en 2012 postdoktorstipend fra Fundación Alfonso Martín Escudero. Francesc Balaguer er en mottaker av tilskudd fra Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). CIBEREHD er finansiert av Instituto de Salud Carlos III. Carla Guarinos er en mottaker av tilskudd fra Generalitat Valenciana (Vali + D ACIF /2010/018). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Ajay Goel er en PLoS ONE Editorial Board Member. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformene i vestlige land, og er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos voksne [1]. Samle bevis indikerer at epigenetiske forandringer spille en viktig rolle i patogenesen av CRC. Avvikende DNA-metylering representerer en av de mest studerte epigenetisk endring, og det er velkjent at tumorsuppressorgener blir ofte brakt til taushet ved metylering av CpG øyer som vanligvis ligge i den 5 «regioner av omkring halvparten av alle humane gener [2], [3- ], [4]. Transcriptional stanse av tumorsuppressorgener har dukket opp som et viktig skritt i trinnvis prosess for kolorektal kreftutvikling. Epigenetiske endringer, spesielt DNA hypermethylation, kan anvendes for tidlig påvisning av premaligne lesjoner, inkludert adenomatøse polypper i tykktarmen, og er til stede i de ikke-neoplastiske vev tilstøtende til adenomatøse polypper og kreft i tykktarmen [5], [6] . I tillegg til deres bruk som diagnostiske biomarkører, epigenetiske endringene viser lovende som determinanter for kreft prognose, samt biomarkører for svar på spesifikke chemotherapies [7], [8].
I CRC, systema genom-wide tilnærminger har identifisert flere gener som viser tumorspesifikk promoter hypermethylation som potensielt kan utvikles til klinisk relevante diagnostiske, prognostiske og prediktive biomarkører. I sammenheng med CRC, har flere slike biomarkører nylig blitt beskrevet som potensielt lovende diagnostiske biomarkører, inkludert:
SEPT9 plakater (Septin 9), et medlem av septin familien involvert i cytokinese og cellesykluskontroll [9], [10], [11];
ALX4 plakater (Homeobox protein aristaless-lignende 4), en transkripsjonsfaktor som er involvert i skallen og lem utvikling [12], [13];
TWIST1 plakater (Twist homolog 1), en antiapoptotic og pro-metastatisk transkripsjonsfaktor [14], [15];
IGFBP3 plakater (insulinlignende dyrket faktorbindende protein 3), et medlem av den insulin-lignende vekstfaktorbindende protein familien [16];
GAS7 plakater (vekststans spesifikk 7), som spiller en antatt rolle i neuronal utvikling [17], [18]; og
miR137
, en ikke-kodende mikroRNA som er innleiret i et CpG øy [17], [19], [20], [21]. Men til dags dato, ingen av disse metylering markørene har gjennomgått en systematisk validering i en stor kohort av CRC pasienter til fullt fastslå deres potensial som klinisk anvendelige diagnostiske, prognostiske eller prediktive biomarkører. Av denne grunn, vi tar sikte på å utforske den diagnostiske, prognostiske og prediktive verdien av
SEPT9, TWIST1, ALX4, IGFBP3, GAS7
, og
miR137
promoter hypermethylation i et stort, godt karakterisert, populasjonsbasert CRC kohort. Videre undersøkte vi assosiasjoner mellom metylering status av individuelle markører og deres kombinasjon med clinicopathological funksjoner i disse primær CRC, og for første gang rapporten at
IGFBP3
hypermethylation er en lovende diagnostisk og prediktiv biomarkør i CRC pasienter.
Materiale og metode
pasienter
Denne studien inkluderte 425 CRC pasienter som ble rekruttert som en del av Epicolon-i prosjektet, som er en populasjonsbasert studie av CRC som tidligere beskrevet [22], [23], [24]. Siden denne studien forsøkte å bestemme den prognostiske og prediktive potensialet metylering biomarkører, ble pasientprøver som inngår i denne studien tilfeldig valgt fra en tidligere beskrevet kohort av pasienter som oppfølgingsdata var tilgjengelig [7], [25], [26 ]. Demografiske, kliniske, og tumorrelaterte karakteristika for probands, samt en detaljert familiehistorie, ble oppnådd ved bruk av en tidligere etablert spørreskjema [22]. Clinicopathological og molekylære funksjoner i pasienter som er inkludert i disse studiene er beskrevet i tabell S1. Studien ble godkjent av etisk komité av alle deltakende sykehus i EPICOLON kohort (Hospital 12 de Octubre, Madrid, Hospital Clinic, Barcelona, Hospital Clínico Universitario, Zaragoza, Hospital Cristal-Pinor, Complexo hospitalario de Ourense, Parc de Salut Mar, Barcelona, Hospital Donostia, CIBERehd, University of Country Basque, San Sebastian, Hospital Generelt Universitario de Alicante, Hospital General de Granollers, Hospital General de Vic, Hospital Generelt Universitario de Guadalajara og Fundación para la Formación e INVESTIGACION Sanitarias Murcia, Hospital Generelt Universitario de Valencia), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Promotoren metylering status av seks gener (
SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4
og
MIR-137
) ble analysert i alle 425 CRC-pasienter, så vel som i normal kolon mukosa fra 21 friske personer med en normal koloskopi.
DNA-ekstraksjon og bisulfite modifikasjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra parafin-embedded svulstvev (FFPE) eksemplarer i Epicolon-i studien. Under oppsyn av studien patolog, ble vevssnitt nøye undersøkt, tumor-beriket regioner identifisert og nøye dissekert for DNA-ekstraksjon. Etter parafin fjerning av xylen, ble DNA isolert ved hjelp QiaAmp DNA Mini kits, i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Valencia, CA). Den resulterende genomisk DNA ble modifisert med natrium-sulfitt hjelp av EZ Metylering Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA).
DNA Metylering analyse
Bisulfite pyrosekvensering ble utført for kvantitativ metylering analyse som tidligere beskrevet (figur S1) [7], [25], [26]. Primere som brukes ble utformet ved hjelp PyroMark 1.0 design software på, og pyrosekvensering analysene ble kjørt på sulfitt-modifiserte DNA (tabell S2 og informasjon S1). Gjennomsnittlig prosent metylering for alle CpG områder i hver analyse ble beregnet for hvert gen /markør. Metylering cut-off-verdier ble bestemt for hver markør basert på gjennomsnittlig metylering nivåene observert i normal tarmslimhinnen fra friske individer mer enn 2 standardavvik. Tilleggs bekreftende metylering analyse for
IGFBP3
ble også foretatt av en kvantitativ MSP (qMSP) assay for arrangøren /exon1 CpG island hjelp av primere og PCR-forhold som tidligere beskrevet [27].
CpG Island Methylator Phenotype (CIMP) og mikro Ustabilitet (MSI) status
CIMP status for CRC prøver fra Epicolon-i kohorten ble tidligere retningslinjer bisulfite pyrosekvensering av CIMP markører
CACNAG1
,
SOCS1
,
RUNX3
,
NEUROG1
, og
MLH1
, som rapportert tidligere [7]. En CRC ble ansett CIMP-positiv hvis minst 3/5 arrangører ble metylert [7]. Mikro ustabilitet (MSI) testing ble utført ved hjelp BAT26 og NR24 quasimonomorphic markører som tidligere beskrevet [28]. Svulster ble klassifisert som MSI-positive når enten markør ble mutert, og ble ansett som mikro stabil (MSS) når verken markør påvist noen bevis for genetisk ustabilitet.
BRAF
mutasjon
Nærvær
V600E BRAF
mutasjon i CRC prøvene ble oppdaget ved hjelp av TaqMan prober og en ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA), med alleliske diskriminering, som tidligere beskrevet [29].
Statistical Analysis
Kontinuerlige variabler er rapportert som gjennomsnitt + standardavvik (SD), mens kategoriske variabler er nevnt som frekvens eller prosenter. Statistiske forskjeller fra grunnlinjetrekk mellom grupper ble analysert ved anvendelse av χ
2-test for kategoriske data, etterfulgt av påføring av Yates korreksjon og Mann-Whitney U-test for kvantitativ analyse av data. Den primære resultatene av denne studien var total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS). Analyser av begge resultatene ble utført for hele CRC kullet, og separat i den undergruppe av scene II og III CRC pasienter for spesifikt å evaluere effekten av metylering status på prognose og respons på adjuvant kjemoterapi. OS ble definert som tiden fra påmelding til døden, og DFS ble definert som tiden fra påmelding til død uansett årsak eller den første tilbakefall. Data om OS og DFS ble sensurert på 1100 dager fra datoen for kreftdiagnose. CRC svulster ble kategorisert i høye og lave metylering statusgrupper som bruker Receiver Operating Kjennetegn kurve (ROC) analyse. Kaplan-Meier analyse ble utført for å beregne fordelingen av DFS og OS i stadium II og III pasienter. Overlevelses distribusjoner ble sammenlignet med log rank test. En multivariat analyse for bestemmelse av hazard ratio for død eller tumorresidiv ble utført ved hjelp av flere variabler, blant annet, lymfeknutemetastase, TNM stadium, MMR status, tumor differensiering klasse, alder og adjuvant kjemoterapi. Ytterligere analyser ble utført ved anvendelse av Cox proporsjonal farer regresjon på en trinnvis måte for å teste effekten av metylering status for et gitt gen /markør med DFS og dets interaksjon med kjemoterapi. Hazard ratio og 95% konfidensintervall (95% KI) for død ble beregnet ved hjelp av Cox overlevelse modellering. Alle rapporterte p-verdiene er tosidig, og p-verdiene 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle beregninger ble utført ved hjelp av SPSS 10.0 eller GraphPad Prism 4.0 statistisk programvare.
Resultater
I vår serie av 425 CRC tilfeller gjennomsnitt ± SD alder av pasientene var 70,4 + -11 år, og det var flere mannlige pasienter enn hos kvinner (252/425; 60,3%). Av de 425 tumorer, ble 117 (27,9%) som befinner seg i den proksimale kolon, 151 (36,2%) var i den distale colon, og 150 (35,9%) ble plassert i endetarmen. Omtrent 12,8% av tilfellene var stadium I, 33,7% stadium II, 39,7% fase III, og 13,7% stadium IV svulster. Vi fant ut at 35/425 (8,2%) CRC var MSI, 90/303 (29,7%) var CIMP-positive, og 21/191 (10,9%) hadde en somatisk V600E mutasjon i
BRAF
genet. Som forventet, ble det CIMP-positive fenotype mer ofte forbundet med MSI og nærværet av
BRAF
V600E mutasjon (22,3% vs. 2,3%, p 0,0001 for MSI fenotype, og 31% mot 1,5% , p 0,0001 for
BRAF
V600E mutasjon)
Diagnostisk betydning av metylering markører i CRC
de gjennomsnittlige metylering nivåer for hvert gen i primær CRC vev var. 23.8 % for
SEPT9
, 50,5% for
TWIST1
, 44,9% for
IGFBP3
, 50,2% for
GAS7
, 36,5% for
ALX4
, og 35,3% for
miR137
. Som vist i figur 1, metylering nivåer av hvert gen var betydelig høyere i CRC kontra normal slimhinne fra friske individer (
p
0,0001 til
p
0,0005 for alle sammenligninger). Disse resultatene viser at kreft-spesifisitet for hypermethylation av disse genene og etablere en begrunnelse for deres utnyttelse som potensielle diagnostiske biomarkører for CRC, med tanke på at alle 6 markører demonstrert hypermethylation i alle faser av CRC (figur 2).
Bisulfite pyrosekvensering resultater for metylering av
SEPT9 product: (A),
TWIST1 plakater (B),
IGFBP3 product: (C),
ALX4 product: (D),
GAS7 product: (E) og
miR137 product: (F) gener sammenligne normal slimhinne fra friske kontrollpersoner (N-N) og primærsvulster fra CRC pasienter.
Bisulfite pyrosekvensering resultatene av metylering av
sept9 product: (a),
twist1 plakater (b),
IGFBP3 product: (c),
alx4 plakater (d),
gas7 product: (e) og
mir137 product: (f) å sammenligne normal slimhinne fra friske pasienter (NN) og primærsvulster fra CRC pasienter i alle TNM stadier i-iv. n (antall individer); median på metylering (%).
For å vurdere ytelsen til hver metylering markør individuelt for CRC diagnose, ble metylering resultatene analysert som en kategorisk variabel. Følgelig ble hvert gen klassifisert som denaturert når gjennomsnitts metylering nivåene var høyere enn 7,1% for
SEPT9
, 35,7% for
TWIST
, 27,5% for
IGFBP3
, 53,5% for
GAS7
, 28,5% for
ALX4
, og 11,9% for
miR137
. Basert på disse analysene, de hyppigst metylert markører i CRC vev var
MIR-137
genet (302/344, 87,7%), etterfulgt av
IGFBP3 plakater (289/348, 83% ),
TWIST1 plakater (269/356, 75,6%),
SEPT9 plakater (244/346, 70,5%),
ALX4 plakater (214/350, 61,1%), og
GAS7 plakater (164/378, 43,3%). For å vurdere nærmere om en kombinasjon av markører vil ytterligere forbedre den diagnostiske nøyaktigheten av analysen, analyserte vi kombinasjon markør paneler og funnet at
miR137
+
IGFBP3
kombinasjon ga en diagnostisk nøyaktighet på 86% etterfulgt av
TWIST1
+
IGFBP3 plakater (82,7%) og
TWIST1
+
miR137 plakater (78,5%). Videre fant vi at kombinasjonen av
miR137
+
IGFBP3
+ TWIST1 metylering hadde høyest diagnostisk nøyaktighet, 92%, som vist i tabell 1.
clinicopathological funksjoner knyttet til metylering biomarkører
Vi neste undersøkt forholdet mellom ulike clinicopathological og molekylære funksjoner og deres tilknytning til avvikende metylering av alle seks gener analysert i denne studien. De clinicopathological variabler inkludert alder, kjønn, TNM staging og svulsten plassering, og de molekylære faktorer inkludert MMR status, CIMP fenotype og
BRAF
mutasjonsstatus. Tumor plassering og TNM stadier ikke forbinder med metylering status for noen av genmarkører. Merkelig,
SEPT9
metylering var signifikant assosiert med mannlige kjønn (p 0,05, tabell S3). Når metylering ble analysert som en kontinuerlig variabel, observerte vi en trend for høyere metylering av
TWIST1
,
IGFBP3, ALX4
, og
GAS7 product: (p 0,05) og eldre pasienter med CRC; Men vi fant ikke en positiv korrelasjon mellom normal tarmslimhinnen metylering i disse genene og alder hos friske individer. (figur 3 4)
Med hensyn til molekylære foreninger,
TWIST1
metylering nivåene var høyere i MSS sammenlignet med MSI CRC (51% vs. 40,3%; p 0,05) (tabell 2). Metylering av fire gener,
ALX4, IGFBP3, GAS7
, og
miR137
, var signifikant korrelert med CIMP-positive svulster (p 0,001). Videre, som vist i tabell 2, CRC med
ALX4 Hotell og
IGFBP3
metylering ble oftere assosiert med en somatisk
BRAF
V600E mutasjon (13,5% vs. 1,8%, p 0,05 for
ALX4
, og 12,4% vs. 0%, p 0,05 for
IGBFP3
)
Aberrant hypermethylation av gener og dens innflytelse på. CRC pasient prognose
median oppfølging for serien av 425 pasienter inkludert i denne studien ble 1268 dager (3,4 år; range 0-2204 dager). På slutten av oppfølgingsperioden hadde 169 pasienter døde (39,7%), og median oppfølging for denne gruppen var 671 ± 513 dager (1,8 ± 1,4 år). Informasjon om dødsårsaken var tilgjengelig i 99 pasienter; 67,7% (67/99) døde som følge av komplikasjoner av tumorprogresjon, 18,2% (18/99) døde som følge av komplikasjoner av kjemoterapi, og 14,1% (14/99) falt for død av andre årsaker, inkludert postoperative komplikasjoner. Tumorresidiv ble observert i 116/370 pasienter (31,3%), med en median varighet av 644 ± 448 dager (1,7 ± 1,2 år) etter operasjonen.
For å finne den prognostiske betydningen av metylering status for hvert gen, alle CRC ble kategorisert i to grupper basert på deres metylering nivåer (høy versus lav), og dose-respons-sammenheng mellom graden av metylering og overlevelse ble undersøkt av ROC kurven analyse. Totalt sett høye nivåer av metylering av
GAS7 plakater (prognose cut-off verdi = 52,62%, high-metylering: 43,3%, lav-metylering: 56,7%; χ
2 p = 0,03) og
ALX4
gener (prognose cut-off verdi = 25,8%, high-metylering: 67,1%, lav-metylering: 32,9%; χ
2 p = 0,005) assosiert med dårlig DFS i CRC pasienter (data ikke vist). I motsetning til dette lave nivåer av
IGFBP3
metylering demonstrerte en forbindelse med betydelig dårligere DFS ifølge ujustert analyse (prognose cut-off-verdi = 53,1%; høy-metylering: 30,9%, lav-metylering: 69,1%; χ
2 p = 0,01; figurene 5A og B). Etter multivariat Cox regresjonsanalyse der flere variabler ble analysert, bare lave nivåer av
IGFBP3
metylering dukket opp som en selvstendig risikofaktor for dårlig DFS i stadium II og III CRC pasienter (HR = 0,49, 95% KI: 0.28- 0,85, p 0,01). Videre metylering status for
IGFBP3
genet var den eneste statistisk signifikant risikofaktor for trinn II CRC, etter justering for andre prognostiske faktorer som alder, adjuvans 5-FU (5-Fluorouracil) kjemoterapi eller MSI status (HR = 0,28, 95% KI: 0,12 til 0,70, p = 0,006, Tabell 3)
(a) Sykdomsfri overlevelse av pasienter med stadium II og III CRC, i henhold til
IGFBP3
metylering status (høy metylering, n = 73, (30,3%) lav metylering, n = 168, (69,7%). (b) Sykdomsfri overlevelse av pasienter med stadium II sykdom, i henhold til
IGFBP3
metylering (høy metylering, n = 45, (32,4%). lav metylering, n = 94, (67,6%) (c) sykdom overlevelse av pasienter med stadium iI og iII sykdom, i høy
IGFBP3
metylering tumorer basert på hjelpekjemoterapi (kjemoterapi, n = 20, (22,5%). ingen kjemoterapi, n = 69, (77,5%) (d) sykdom overlevelse av pasienter med stadium iI og iII sykdom, i svakt
IGFBP3
metylering svulster etter adjuvant kjemoterapi (Chemotherapyc n = 83, (52,7%); NO Kjemoterapi, n = 74, (47,2%).
Aberrant genet hypermethylation og dens innflytelse på pasientens overlevelse etter cellegiftbehandling
kjemoterapeutisk behandling ble gitt til 257/425 pasienter (60,5%), hovedsakelig ved hjelp av 5-FU + folinsyre (236; 91,8% av pasientene). Blant hele kullet, 315 pasienter (74,1%) hadde enten et stadium II eller III sykdom, og 155 (49,2%) av disse fikk 5-FU-basert adjuvant kjemoterapi. Kun 9 stadium II og III pasienter fikk andre kjemoterapeutiske behandlinger, og ble ekskludert fra videre analyse. Etter en median oppfølging av 1221 dager (3,3 år), 92 (31,2%) pasienter med stadium II og III viste svulst tilbakefall, og ved slutten av oppfølgingsperioden, 101 (34,2%) pasienter fra disse gruppene hadde døde
Adjuvant kjemoterapi gitt en betydelig forbedring i OS i stadium II og III CRC pasienter sammenlignet med pasienter som ikke fikk kjemoterapi (cellegift: 49,1%, no-kjemoterapi. 50,9%, χ
2 p = 0,0001). Disse forskjellene i OS var også til stede i multivariat analyse som kontrollerer for alder, kjønn, lymfeknutemetastase, MMR, og CIMP fenotype status. (HR = 0,55, 95% KI: 0,36 til 0,85, p = 0,007)
Interessant, blant alle 6 metylering markører undersøkt, bare
IGFBP3
metylering nivåene var prediktiv av responsen til 5-FU-baserte kjemoterapi. Ifølge våre resultater, pasienter med lav
IGFBP3
metylering nivåer hadde lengre OS (p = 0,0007) og DFS (p = 0,05) når de fikk kjemoterapi. Omvendt kan pasienter med høy
IGFBP3
metylering, adjuvant kjemoterapi ble ikke bedre OS (p = 0,4) eller DFS (p = 0,3, figur 5C og D). Ved hjelp av multivariat Cox regresjonsanalyse (tabell 4), hos pasienter med lav
IGFBP3
metylering, adjuvant kjemoterapi uavhengig spådd bedre OS (HR = 0,49, 95% KI: 0,29 til 0,80, p = 0,004); Men det gjorde ikke signifikant påvirke DFS (p = 0,08). På den annen side, MMR status var den eneste variable som uavhengig er forutsagt OS (p = 0,05) og DFS (p = 0,04) i pasienter med høy
IGFBP3
metylering (tabell 4). I pasient kohort behandlet med 5-FU adjuvant kjemoterapi,
IGFBP3
metylering status ikke uavhengig forutsi OS og DFS. I kontrast, ble DFS positivt påvirket av
IGFBP3
metylering status hos pasienter som ikke fikk adjuvant kjemoterapi. (HR = 0,41, 95% KI: 0,18 til 0,91, p = 0,02)
diskusjon
i de senere årene har en rekke lovende genet metylering baserte diagnostiske biomarkører inkludert
SEPT9, TWIST 1, IGFBP3, GAS7, ALX4
, og
miR137
har blitt foreslått for tidlig deteksjon av tykktarms neoplasi. Men de fleste av disse markørene har vært begrenset til første småskala oppdagelse studier, og har ikke blitt utviklet til klinisk praksis som de ikke har blitt systematisk validert i store, uavhengige kohorter av CRC pasienter. I lys av dette gapet i kunnskap, vi laget denne studien å bekrefte den diagnostiske potensialet i disse biomarkører, og for å fastslå deres prognostiske og prediktive verdier i CRC. I tillegg var vi interessert i å undersøke sammenhengen mellom avvik hypermethylation av disse genene og clinicopathological funksjoner ved å analysere et stort, godt karakterisert, populasjonsbasert kohort av CRC-pasienter.
Basert på vår kvantitative metylering analyse, alt seks gener avhørt oppfylte kriteriene for potensielle klinisk bruk som diagnostiske biomarkører for CRC. Disse kriteriene følger: a) metylering av hvert gen skjedde i en tumor-spesifikk måte; b) metylering nivåene av hvert gen i neoplastiske vev var signifikant høyere enn i normal kolon mukosa; og c) ingen av genene viste en aldersavhengig økning i DNA-metylering i normal tarmslimhinne [30], [31]. Metylering nivåer av hvert gen tillatt oss å klassifisere kolorektal vev som normalt eller neoplastisk. Blant alle markører undersøkt,
IGFBP3 Hotell og
miR137
metylering nivåer viste høyest diagnostisk nøyaktighet som individuelle genetiske markører for identifisering av primær CRC (83% og 78,3%, henholdsvis). Denne diagnostisk treffsikkerhet ble ytterligere forbedret ved å kombinere metylering status av to genetiske markører; særlig metylering status for
IGFBP3 + TWIST1
eller
IGFBP3
+
miR137
hadde høyest nøyaktighet verdier på 86% og 82,7% henholdsvis med sensitivitet og spesifisitet verdier 80%.
Vi undersøkte de molekylære funksjoner knyttet til tumor metylering nivåer av disse genene. Det var av spesiell interesse som molekylær klassifisering basert på MSI og CIMP status er blitt stadig viktigere [32] for sin prognostisk [33], [34], [35] og prediktiv rolle i CRC-pasienter [7], [34], [ ,,,0],36]. I denne studien ble fire av de seks gener positivt assosiert med CIMP fenotype (
ALX4, IGFBP3, GAS7
, og
miR137
). Videre, en positiv korrelasjon mellom
BRAF
V600E mutasjon og metylering av
ALX4 Hotell og
IGFBP3
gener assosiert med CIMP-high i CRC [37], [38] . Som forventet, metylering av
ALX4 Hotell og
IGFBP3
gener ble assosiert med tilstedeværelse av
BRAF
genmutasjon.
TWIST1
metylering nivåene var høyere hos pasienter med MMR-dyktige svulster i forhold til MSI svulster; men i vår årsklasse, var bare en liten andel av CRC MMR-mangel (5%), og sammenhengen mellom MMR status og metylering markører kan ha gått tapt når analysere gruppen som helhet.
I fase II og III CRC pasienter som har gjennomgått potensielt kurativ reseksjon, avhenger prognose på tilbakefall av sykdommen, som er primært knyttet til fjernmetastaser. I tillegg har nytte av adjuvant kjemoterapi, spesielt for scene II CRC pasienter forble et område av uenighet og kjemoterapeutiske motstand er fortsatt et stort problem i disse pasientene. Derfor oppdagelsen av romanen prognostisk og prediktiv biomarkører som kan bidra til å identifisere scenen II og III pasienter som har høy risiko for tilbakefall og metastasering, kan forbedre dagens strategi for CRC pasientutvelgelse og terapi ledelse. Så langt vi kjenner til, har ingen tidligere studie undersøkte sammenhengen mellom metylering av
SEPT9, IGFBP3, TWIST1, GAS7, ALX4
, og
miR137
gener med prognose hos pasienter med CRC, så vel som evne for disse markørene for å forutsi respons på 5-FU-adjuvant kjemoterapi. Basert på våre resultater i dette store, godt preget populasjonsbasert kohort, trinn II og III CRC pasienter med lave nivåer av
IGFBP3
arrangøren metylering hadde dårligere OS og DFS i forhold til de med høye nivåer av DNA hypermethylation. Med hensyn til respons på kjemoterapi, var da 5-FU basert adjuvant kjemoterapi gis til scenen II og III CRC pasienter, bare de pasienter med lave nivåer av
IGFBP3
metylert svulster ble positivt påvirket, noe som resulterer i lengre DFS og OS ganger, noe som indikerer at fordelen med kjemoterapi var begrenset til denne gruppen av CRC pasienter. Merkelig, denne effekten av
IGFBP3
metylering var uavhengig av CIMP status. Likevel er det viktig å påpeke at selv om
IGFBP3
metylering status dukket opp som den eneste uavhengige faktoren som spådd dårlig DFS sannsynlighet blant stadium II CRC pasienter, er flere uavhengige kliniske studier er nødvendig for å bevise at
IGFBP3
metylering nivåer i CRC kunne representere en potensiell rutinetest for forutsigelse av CRC pasienter, og i å forbedre behandling av pasienter med lokalisert sykdom i kombinasjon med nåværende clinicopathological og molekylære verktøy.
Andre studier har observert en sammenheng mellom høyt nivåer av
IGFBP3
metylering og dårlig klinisk resultat i lunge og eggstokkreft [39], [40], og mer nylig i CRC pasienter [27]. Avvikende rapporter ved hjelp av metylering markører kan skyldes bruk av ulike metoder og analyse av ulike sekvens steder i CpG-øyene. I denne studien brukte vi bisulfitt pyrosekvensering for metylering analyse, som er en pålitelig kvantitativ tilnærming for robust DNA-metylering analyse sammenlignet med den konvensjonelle Metylering Spesifikke PCR (MSP), som mangler den kvantifisering leveres av bisulfat pyrosekvensering [27], [39], [40]. I tillegg, for å ytterligere sikre nøyaktigheten av våre metylering resultater, gjennomførte vi også en kvantitativ-MSP (qMSP) analyse innenfor CpG island regionen tidligere studert i CRC [41]. Som vist i figur 6, bekreftet vi at bisulfitt pyrosekvensering metylering resultater ble positivt korrelert til de resultater som ble oppnådd i det CpG øya region tidligere studert [27], [39], [40].
(a) Skjematisk oversikt over insulin-like dyrket faktorbindende protein 3 (IGFBP3) genet. eksoner er representert med blå bokser, introner med blå linjer, og arrangøren regionen med blå stiplede linjer.
IGFBP3
genet har øya en cytosin-fosfat-guanin (CPG) på i promoter-regionen og exon1 understreker potensialet til å modulere genekspresjon ved hjelp av CPG hypermethylation, og dette er representert ved en grønn boks. vi utført to forskjellige analyser som dekker både CPGs øyer (angitt med grønne piler) ved hjelp av to kvantitative metoder: pyrosekvensering og qmsp for å korrelere metylering nivåer av disse to stedene. (B) Lineær regresjonsanalyse sammenligne
IGFBP3
metylering nivåer ved pyrosekvensering (% metylering) i 348 pasientprøver og qmsp (PMR) analyser i CRC vev (n = 197).
selv om det er noen forskjeller mellom denne studien og tidligere publiserte studier, tror vi dette arbeidet er mer robust og omfattende, som vår sysselsetter den største pasientmateriale, er populasjonsbasert, og inkluderer en kontrollgruppe av ikke-behandlede CRC pasienter for sammenligning. Den biologiske rolle og timing av
IGFBP3
metylering i CRC er dårlig forstått,
