Abstract
Tumor respons på behandling vurderes primært i klinikken ved overvåkings reduksjoner i tumorstørrelse. Imidlertid mangler denne tilnærmingen følsomhet for i mange tilfeller flere uker kan gå før det er tegn på svulst krymping. Det er derfor et behov for å utvikle ikke-invasiv avbildningsteknikker for overvåkning av tumorbehandlingsrespons i klinikken. Her vurderte vi pre-klinisk nytte av
18F-ICMT-11 positronemisjonstomografi – en metode for påvisning av caspase 3/7 aktivering – i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
18F-ICMT-11 opptak ble sammenlignet med molekylære biokjemiske tiltak av celledød i PC9 og A549 NSCLC celler etter behandling med karboplatin
in vitro Hotell og
in vivo
. Karboplatin-indusert apoptose i ERCC1 lav /mutant
EGFR
PC9 celler ble preget av tid og doserelatert økt caspase-3/7 aktivisering, poly-ADP-ribose polymerase cleavage og Annexin V farging.
18F-ICMT-11 opptak ble dermed økes opp til 14 ganger på 200 mikrometer carboplatin i forhold til kjøretøy behandlede celler (
P
0,01). I motsetning til nekrose var den dominerende dødsmekanismen i ERCC1 høy /vekt
EGFR
A549 celler og ingen endring i
18F-ICMT-11 opptak ble oppdaget.
In vivo
, histologisk analyse av PC9 tumorxenotransplantater indikert høy pre-terapi nekrose. En 4,6-ganger økning i kløyvde caspase-3/7 ble målt i ikke-nekrotiske områder av PC9 svulster på 48t post carboplatin terapi. Gjennomsnitt PET-avledet tumor
18F-ICMT-11-opptaket var ufølsom for endringer i apoptose i nærvær av vesentlig pre-eksisterende nekrose. PET-baserte voxel intensitet sortering imidlertid identifisert intra-tumor regioner med høy
18F-ICMT-11 opptak, slik at nøyaktig vurdering av apoptose og derfor terapi respons. I A549 svulster som manglet høy pre-terapi nekrose, carboplatin indusert veksthemming som var bare minimal assosiert med apoptose, og dermed ikke kan påvises ved
18F-ICMT-11 PET
Citation. Witney TH, Fortt RR , Aboagye EO (2014) Preklinisk Vurdering av karboplatin behandlingseffekten hos Lung Cancer av
18F-ICMT-11-positron Emission Tomography. PLoS ONE 9 (3): e91694. doi: 10,1371 /journal.pone.0091694
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 20 desember 2013; Godkjent: 12 februar 2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Witney et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen som fører til disse resultatene har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking (www.imi.europa.eu) under tilskuddsavtalenummer 115151, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7 /2007-2013 ) og EFPIA selskapenes tingsinnskudd. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for den høyeste kreftrelatert dødelighet [1]. Adaptive randomisering av pasienter til ulike behandlingsformer på grunnlag av biopsi informert svulst profilering streker potensielle nytten av biomarkører i å forutsi effekten av behandlingen (BATTLE rettssaken [2]). Eksistensen av ulike resistensmekanismer i NSCLC inkludert de drevet av
EGFR
,
ELM-ALK
, og
AXL
(mutant) genprodukter innebærer imidlertid at forhånd pasientutvelgelse for terapi er problema [3]. Terapi kan føre til rask utryddelse av sensitive kloner men like aggressive kloning utvidelse fører til forbigående remisjon og tilbakefall [4]. I denne sammenheng flere resistensmekanismer som involverer deregulert apoptose banene er blitt identifisert [3]. Med et begrenset antall «livsforlengende» behandlinger og en ufullstendig forståelse av legemiddelresistensmekanismer, er det mulig at tidlig vurdering av effekt kan tillate mer betimelig bryteren til alternative behandlingsformer. Det er imidlertid sparsomt med tidlige effekt biomarkører. Når det gjelder bildeeffekt biomarkører, en gjennomgang av Zhao og medarbeidere fremhevet nytten av molekylær avbildning inkludert positronemisjonstomografi (PET) i kombinasjon med anatomisk avbildning, som en måte å vurdere effektiviteten i biopsi-utilgjengelige lesjoner [5], og overlegen til klinisk vurderingen av Response evalueringskriterier i solide svulster (RECIST) alene [6].
en av de godt beskrevet sti biomarkører knyttet til både medfødt og ervervet resistens i NSCLC er apoptose pathway [3]. Apoptose, eller programmert celledød, er en viktig prosess som kreves for vev homeostase, embryoutvikling og eliminering av skadelige celler i kroppen. Under tumorgenesen mekanismene som styrer normal celle apoptose blitt deregulert. Noen av de mest hyppigst muterte gener som finnes i kreft, p53 og Bcl-2, diktere hvis /når cellene lever eller dør [7], [8]. For å overvinne indre svulst motstand mot normale døds stimuli, tradisjonelle cytotoksiske, strålebehandling og mekanismebaserte terapier har blitt designet for å indusere tumor-spesifikke apoptotisk celledød gjennom mange avvikende mekanismer. Disse avvikende mekanismene konvergere med aktiveringen av effektoren caspase, caspase-3, i gjennomføringsfasen av apoptotisk celledød, med påfølgende forpliktelse til DNA degradering, nedbrytningen av den cellulære cytoskjelettet, membran blebbing, dannelse av apoptotiske legemer og fjerning av celle av immunsystemet [9].
Blod biomarkører av celledød har vært utforsket i lungekreft via måling av løselig caspase-kløyvde cytokeratin 18 produkt M30 [10], selv om denne metoden verken gir informasjon om heterogen lesjon respons det er heller ikke i stand til å skille mellom tumorrespons og normalt vev toksisitet. Gitt den nesten universelle forekomsten av caspase-3/7 aktivering i programmert celledød, kan sin påvisning av bilde være en lovende biomarkør av behandlingseffekten. Vi har nylig utviklet en caspase-3/7-spesifikk probe,
18F – (
S
) -1 – ((1- (2-fluoretyl) -1H [1], [2] , [3] triazol-4-yl) metyl) -5- (2 (2,4-difluorophenoxymethyl) -pyrrolidin-1-sulfonyl) isatin (
18F-ICMT-11), for
in vivo
avbildning av terapi-indusert tumor apoptose.
18F-ICMT-11 har blitt vist av oss og andre til å være en følsom måling av både tradisjonelle cytotoksisk-indusert celledød [11] – [13], og tumor apoptose etter behandling med et lite molekyl caspase-aktivator [11] . Automatisert, lettvinte radiomerking av
18F-ICMT-11 til GMP-standarder har blitt beskrevet [14], med en første-i-mann studien rapporterer gunstig dosimetri profil [15]. NSCLC kan presentere som en kompleks lesjon inkludert pre-terapi nekrotiske komponenter; en detaljert vurdering av spesifisitet
18F-ICMT-11 mot apoptotisk celledød i forhold til terapi-indusert nekrose har ikke tidligere blitt rapportert. I denne artikkelen presenterer vi en ny strategi for påvisning av behandlingseffekt med
18F-ICMT-11 PET i prekliniske modeller for NSCLC med varierende reaksjoner på carboplatin, knyttet til unike genetiske pre-determinanter for respons.
Materialer og metoder
Cell Kultur
PC9 og A549 celler var fra LGC Standards (Teddington, Middlesex, UK). PC9 celler ble holdt i RPMI 1640 medium, med A549s dyrket i DMEM. Begge media ble supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 U.mL-1 penicillin og 100 μg.mL-1 streptomycin (Invitrogen, Paisley, Refrewshire, UK) og cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Celledød ble indusert ved tilsetning av karboplatin (Accord Healthcare Ltd., Middlesex, Storbritannia, 0-200 uM).
veksthemmende analyse
legemiddelkonsentrasjon som inhiberte 50% av cellevekst ( GC
50) ble bestemt ved hjelp av en sulphorhodamine B (SRB) teknikk som beskrevet andre steder [16]. Alle cellelinjer ble behandlet i 72 timer, 24 timer etter såing, med mindre annet er angitt
strømningscytometrisk Målinger av celledød
Cellene ble trypsinisert (0,25% trypsin, 1 mM EDTA). Og høstet ved sentrifugering (1300 g, 3 min). Frittliggende celler i media før trypsinering ble beholdt og slått sammen med trypsinisert celler. Cellepelleter (1 x 10
6 celler) ble vasket i iskald HEPES-bufret saltvann (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2, pH 7,4) og resuspendert i 100 pl av den samme buffer. Annexin V, Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ble tilsatt (5 ul /100 ul av cellesuspensjonen) i kombinasjon med 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; 20 μg.mL
1; Invitrogen), før inkubering i 10 min ved 20 ° C. Den resulterende blandingen ble vasket en gang, holdt kort på is, og deretter analysert i et LSRII cytometer (BD Biosciences, Rockville, MD), med 20.000 celler telles per hendelse. Residual celleavfall, identifisert på fremover (FS) og side lysspredning (SS) profiler, ble ekskludert fra analysen ved selektiv gating.
Western avsetninger
PolyADP-ribose polymerase (PARP) og caspase-3 cleavage ble vurdert ved hjelp av en standard western blotting protokollen [17]. Membraner ble probet ved bruk av polyklonalt kanin-anti-PARP1 antistoff (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK; 1:1000), et kanin-monoklonalt anti-ERCC1-antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA; 1:1000) og et polyklonalt kanin anti-kløyvet caspase-3-antistoff (Cell Signaling Technology, 1:1000). Et kanin anti-actin-antistoff (Sigma-Aldrich Co Ltd, 1:2000) ble anvendt som en kontroll lasting. Blotter ble skannet (Bio-Rad GS-800 kalibrerte densitometer, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og signal kvantifisering ble utført ved densitometri hjelp skanning analyseprogramvare (Antall One, Bio-Rad)
18F-ICMT-11 radiosynthesis
18F-ICMT-11 syntese og radiomerking ble utført i henhold til tidligere beskrevet metode [14]. Radiokjemisk renhet var . 98% ved utgangen av syntese med en spesifikk aktivitet på 35,1 ± 7,9 GBq /mikromol (
n
= 8)
In vitro
18F-ICMT-11 Cell opptak
Cells (1 × 10
5) ble sådd ut i 6-brønners plater natten før behandling (kjøretøy /karboplatin). På dagen for forsøket, friskt vekstmedium som inneholdt 0,74 MBq
18F-ICMT-11 ble tilsatt til individuelle brønner. Celle opptaket ble målt etter inkubasjon ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i 60 min. Deretter ble cellene trypsinisert (0,25% trypsin, 1 mM EDTA) og høstet ved sentrifugering (1300 g, 3 min). Frittliggende celler i media før trypsinering ble beholdt og slått sammen med trypsinisert celler. Cellene ble vasket 3 ganger med iskald PBS (1 ml, 1,300 g, 3 min), med 20 ul senere tatt for caspase-3/7-aktivitet vurdering (se nedenfor), før pelletering av de gjenværende celler og lysis i RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA, 1 ml, 10 min). Cellelysat ble overført til telle rør og forfall korrigert radioaktivitet ble bestemt på et gammateller (Cobra II Auto-Gamma teller, Packard biovitenskap Co, Pang, UK). Porsjoner var snap-frosset og brukes for proteinbestemmelse etter radioaktiv nedbrytning ved hjelp av en BCA 96-brønns plate analysen (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). Data ble uttrykt som prosent av total radioaktivitet per mg protein, kalibrert ved å bruke 10 mL standarder av 0,74 MBq /ml
18F-ICMT-11 stamløsning.
Caspase-3/7 aktivitetsanalyse
caspase-3/7-aktivitet ble bestemt ved å bruke Promega s caspase-3/7 analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI, USA). Cellene ble inkubert i 1 time med Caspase-Glo reagens, og den enzymatiske aktivitet av kaspase-3/7 ble målt ved anvendelse av en TopCount NXT mikro luminescens teller (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) og normalisert til proteininnhold (BCA). Data ble uttrykt som en fold-økning i caspase-3 aktivitet over kjøretøyet kontrollceller.
In vivo
Tumor Modeller
Alle dyreforsøk ble utført av lisensierte etterforskere i samsvar med Storbritannia Home Office Veiledning om driften av Animal (Scientific Procedures) Act 1986 under prosjektet lisens 70/7177, og i løpet av de publiserte retningslinjer for velferd og bruk av dyr i kreftforskning [18]. Svulstceller (2 x 10
6 og 5 x 10
6 for PC9 og A549, henholdsvis) ble injisert subkutant på baksiden av BALB /c nakne mus (alder 6-8 uker, Charles River), med dyr behandlet med kjøretøy eller carboplatin når xenografter nådde ~ 100 mm
3 (se nedenfor for behandling tidsplan). Tumor Dimensjonene ble målt periodisk ved hjelp av en kaliper og tumorvolumene ble beregnet ved ligningen:. Volum = (π /6) x en x b x c, hvor a, b og c representerer tre ortogonale akser av tumor
PET imaging studier
Dynamic
18F-ICMT-11 bilde skanner ble utført på en dedikert lite dyr PET skanner (Siemens Inveon PET modul, Siemens Medical Solutions USA, Inc.) etter en bolus
iv
injeksjon av ~3.7 MBq av radiomerkings inn i tumorbærende mus [19]. Dynamiske skanninger ble kjøpt i listemodus format i løpet av 60 min. De innsamlede dataene ble deretter sortert i 0,5 mm sinogram spannene og 19 tidsrammer for bilde gjenoppbygging (4 × 15 s, 4 × 60 s og 11 × 300 s), som ble gjort av iterativ rekonstruksjon (2D-OSEM). Siemens Inveon Forskningsarbeidsplass programvare ble anvendt for visualisering av radiotracer opptak i tumoren; 30-60 min kumulative bilder av dynamiske data ble brukt for å definere tre-dimensjonale (3D) regioner av interesse (Rois). Telle tettheter ble midlet for alle ROIs ved hvert tidspunkt for å oppnå en tids versus radioaktivitet kurve (TAC). Tumor kvoter ble normalisert til injisert dose, målt ved hjelp av en VDC-304 dosekalibratoren (Veenstra Instruments), og uttrykt som prosent injisert dose pr ml vev, ved hjelp av kalibreringsfaktoren bestemt for Inveon PET-skanneren. For image visualisering, ble 3D-OSEM rekonstruksjon utført og presentert som summeres 30-60 min rammer.
In vivo
Carboplatin Treatment Schedule
For behandling-responsstudier, mus med størrelse matchet ca 100 mm
3 xenografttumorer ble behandlet ip med enten bærer (saltoppløsning; 0,012 ml /g kroppsvekt) eller karboplatin (Accord Healthcare Ltd .; 120 mg /kg; 0,012 ml /g kroppsvekt). 24 timer etter injeksjon, karboplatin behandlet og kjøretøy kontroll mus ble fotografert av
18F-ICMT-11 PET. En annen kohort av mus fikk to doser med enten bil eller carboplatin, med den andre injeksjonen administreres 24 timer etter den første dosen. Disse musene ble deretter fotografert av
18F-ICMT-11 PET 48 timer etter den første dosen.
PET-basert voxel Intensitet Sortering Histograms
De intensiteter av alle lydelementer innenfor kreft Rois ble beregnet og sortert i henhold til deres intensitet frekvens for å gi PET-baserte voxel intensitet sortering (PVIS) histogrammer [11]. For hver ROI, alle volumelementer, 30-60 minutter etter radiotracer tillegg og tilhørende intensitet ble hentet (~300 voxel per ROI). De voxel intensiteter fordelinger ble videre behandlet gjennom en statistisk analyse (Prism v5.0 programvare, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Innenfor smalt spekter av apoptose sett, vilkårlig valgte vi en 95
persentil cut-off for biologisk beskrive 5% høyeste intensitets voxel-sannsynlighet for å inneholde apoptotiske celler – i stedet for, for eksempel, på bakgrunn av mottakeren opererer karakteristiske analyse.
aktiv Caspase-3 og TUNEL Immunohistochemistry analysen
etter PET imaging studier, ble tumorvev skåret, fast i formalin, innstøpt i parafin, seksjonert (5 mikrometer stykker) og behandlet for aktiv caspase-3 og DNA degradering terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) fluorescerende gjenkjenning analyser ved hjelp av kløyvde caspase-3 (Asp 175) monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology) kombinert med Alexa Fluor 594 geit anti-kanin (Invitrogen) og In Situ celledød Detection Kit (Roche), henholdsvis. Den forlenge Gold Antifade monteringsløsning (Invitrogen) inneholdende 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble tilsatt til vevssnittene forut for montering av dekkglass. Den TUNEL assay ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, med caspase-3 farging utført ifølge [11], [13]. Alternative seksjonene ble kontra med hematoxylin og eosin (H E) farging. 10 tilfeldige «non-nekrotiske» felt per seksjon (400 × forstørrelse) ble tatt med et Olympus BX51 fluorescerende mikroskop for hver svulst og farging intensitet (% farging per totale FOV) ble bestemt ved hjelp av ImageJ programvare (National Institutes of Health) . For PC9 seksjoner, ble tilfeldig FOV valgt fra regioner som mangler omfattende nekrose.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Betydningen av sammenligningen mellom to datasettene ble bestemt ved bruk av Students to-halet t-test. ANOVA ble brukt for multiple sammenligninger (Prism v5.0 programvare for Windows, GraphPad Software). Forskjeller mellom grupper ble betraktet som signifikant hvis P≤0.05.
Resultater
Differensial Mekanismer av Carboplatin-indusert Death in PC9 og A549-celler
PC9 og A549 humane NSCLC-celler ble valgt for sine unike genetiske pre-determinanter for svar: Den tidligere er preget av lav DNA-skade reparasjon protein ERCC1 uttrykk og en mutasjon i
EGFR plakater (15 bp del av ekson 19), med både egenskaper uavhengig stand sensibiliserende celler til platina-basert terapi [20], [21]. I motsetning til A549 celler har høy ERCC1 uttrykk (lav- og høy-uttrykke for PC9 og A549 henholdsvis Online Resource 1) og har vekt
EGFR
. Celledød ble indusert
in vitro
i PC9 og A549 humane NSCLC celler etter karboplatin behandling (0-200 mm). Doseavhengig veksthemming evaluert ved 72 timer etter behandling av en sulforhodamin B-analyse (SRB) viste halv maksimal veksthemming (GC
50) på 71,6 ± 9,5 mikrometer og 136 ± 31,6 mikrometer for PC9 og A549 henholdsvis (
n
= 3; fig. 1A). Apoptotisk celledød ble evaluert ved western blotting. Nivåer av spaltede kaspase-3 og spaltingen av sin nedstrøms substrat, PARP, viste en doserelatert økning i PC9 celler, mens ingen endringer ble observert med A549 (fig. 1B). Flowcytometrisk målinger bekreftet en apoptotisk mekanisme celledød i PC9s (Fig 1C.), Med nekrose den primære mekanismen for døden i A549s (fig 1D.)
A:. Carboplatin-indusert veksthemming i PC9 og A549 celler ved hjelp av en sulforhodamin B analysen 72 timer etter behandling. B: Western blot-analyse av innholdet av uspaltede PARP, spaltes PARP og spaltet (aktiv) kaspase 3 72 timer etter behandling karboplatin (0-200 pM) i PC9 og A549-celler. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. C, D: Flow-cytometrisk analyse av PC9 (C) og A549-celler (D) som ble behandlet med karboplatin (100 uM) eller bærer. Apoptotiske celler ble identifisert ved Annexin V-Alexafluor488 (λ Ex /Em = 495/519 nm) og nekrotiske celler ved 7-AAD (λ Ex /Em = 546/647 nm). Befolknings Q4 representerer levedyktige celler, mens befolkningen Q3 representerer apoptotiske celler som har lave 7-AAD fluorescens og flekken med Annexin V. befolkningen Q2 representerer sekundære apoptotiske /nekrotiske celler.
18F-ICMT- 11 Cell opptak korrelerer med caspase-3 Activation
in vitro
endringer doseavhengig.
Karboplatin-indusert celledød ble først evaluert med
18F-ICMT- 11
in vitro plakater (fig. 2A). Karboplatin behandling av PC9 celler resulterte i en doseavhengig aktivering av kaspase-3/7-aktivitet (Caspase-Glo-analysen, Fig. 2B), opp til 87 ± 19-fold på 200 um (
P
= 0,001
n
= 3). Disse data støtter videre resultater oppnådd ved western blot og strømningscytometri (Fig. 1 B og C henholdsvis). Endringer i caspase-3/7 aktivitet ble ikke oppdaget i A549 på tilsvarende legemiddelkonsentrasjoner (Fig 2B.)
A:. Kjemisk struktur av
18F-ICMT-11. B: Doseavhengig endringer i caspase 3/7 aktivitet følgende carboplatin behandling. C: Doseavhengige endringer i
18F-ICMT-11 opptak i celler etter karboplatin behandling. D: Sammenheng mellom caspase 3 aktivitet og
18F-ICMT-11 opptak i PC9 celler
Tilsetting av 0,74 MBq (20 pCi)
18F-ICMT-11 til celler 72h legg. karboplatin behandling (0-200 pM) resulterte i påvisbare opptak og retensjon av radiomerkings følgende 1 time puls-chase med radiotracer. En økning i cellulært opptak, proporsjonal med carboplatindosen ble målt i PC9 celler; nådde statistisk signifikans på 100 mikrometer, og økte fra 28,8% ± 6,7% radioaktivitet /mg protein for kjøretøy behandlet kontroller til 414,4% ± 20,1% radioaktivitet /mg protein på 200 mikrometer (
n
= 3; P 0,01 ), en 14,4-dobling (fig. 2C). Det var en utmerket sammenheng mellom mobil caspase-3/7 aktivitet og
18F-ICMT-11 opptak i denne linjen (Fig 2D;. R
2 = 0,954). Ingen vesentlig endring i
18F-ICMT-11 opptak ble oppdaget med A549 celler følgende tillegg av karboplatin (Fig. 2C).
Tid løpet av apoptotisk celledød.
Tidsforløpet av apoptotisk celledød ble ytterligere evaluert ved 50 uM carboplatin, en dose nær den GC
50 av PC9 celler (fig. 1A). Utbruddet av apoptose i PC9s kunne påvises etter 48 timer etter behandlingen, målt ved en 7,8 ± 4,6 ganger økning i caspase-3/7 aktivitet (
P
= 0,03;
n
= 4 fig. 3A), med caspase-3 og PARP-spaltning også tydelig av western blot (fig 3B (ii.)). En tidsmessig økning av spaltede caspase-3 ble funnet opp til 96 timer post-behandling i PC9 celler, men det var en reduksjon av caspase-3 aktivitet mellom 72 timer og 96 timer, falt fra 19,1 ± 3,4 ganger til 11,1 ± 0,8 gangers øke over baseline (
n
= 4;
P
= 0,036). Størrelsen av apoptotisk respons var 7,9 ganger lavere med celler behandlet med 50 uM i 96 timer i forhold til en konsentrasjon på 200 uM på samme tidspunkt.
18F-ICMT-11 intracellulær akkumulering speilet tinning økning på spaltet caspase-3 i denne cellelinjen (fig. 3B, C), opp fra 15,8% ± 4,2% radioaktivitet /mg protein til 64% ± 8,1% radioaktivitet /mg protein i celler behandlet ved 50 uM i 96 timer sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (
P
= 0,009). Til tross for utmerket korrelasjon mellom celle spaltet caspase-3 og
18F-ICMT-11 opptak i denne cellelinje, korrelasjon mellom
18F-ICMT-11 opptak og caspase-3/7-aktivitet var mindre godt definert (fig. 3D R
2 = 0,3314). Til tross for detektering av svake bånd svarende til spaltet caspase-3 og PARP med A549-celler behandlet enten 48 timer eller 72 timer (fig. 3B (ii)), var det ingen økning i detekterbar caspase-3/7-aktivitet (Fig. 3A) . Parallelt var det ingen signifikant endring i
18F-ICMT-11 over helheten av dette tidsforløpet (Fig 3C.)
A:. Tid løpet av endringer i caspase 3/7 aktivitet etter carboplatin behandling. B: Western blot-analyse av innholdet av uspaltede PARP, spaltes PARP og spaltet (aktiv) kaspase 3 stolpe 50 uM karboplatin behandling (0-96 h) i PC9 (i) og A549-celler (ii). C: Temporale endringer i
18F-ICMT-11 opptak i celler etter karboplatin behandling. D: Sammenheng mellom caspase 3 aktivitet og
18F-ICMT-11 opptak i PC9 celler
18F-ICMT-11 kan skille apoptotiske fra Necrotic Cell Død
in vivo.
tidsmessige endringer i behandlingsrespons.
PC9 og A549 svulster ble dyrket som xenografter, med kaliper målinger av tumorstørrelse målt etter kjøretøy, 24 timer og 48 timer carboplatin behandling (120 mg /kg ip daglig) og sammenlignet med baseline. For begge svulster, carboplatin behandling resulterte i vekst arrest. For PC9 tumorer, ble en signifikant forskjell i tumorvolum målt 48 timer etter karboplatin behandling i forhold til bærerkontroller, som økte til 143 ± 18% baseline volum, med karboplatin-behandlede tumorer gjenværende på 96 ± 13% baseline volum (
P
= 0,013;
n
= 4, fig. 4A). En betydelig forsinkelse i tumorvekst ble målt både i 24 timer og 48 timer etter behandling carboplatin i A549-tumorer sammenlignet med bærerkontroller (figur 4B.); senere tidspunkter ble ikke målt
A, B:. Tumor volumene registrert av kaliper målinger av PC9 (A) og A549 tumorer (B) før og etter carboplatin behandling som angitt. Viste data er gjennomsnitt ± SD av% volum sammenlignet med baseline (
n
= 4). *,
P
0,05; **
P
0,01. C, D: Representant aksial PET-CT-bilder (30-60 min oppsummerte aktivitet) for PC9 (C) og A549 (D) svulster. Tumor marginer, angitt fra CT-bilde, er skissert i rødt. Mean ± SD (
n
= 4-6 dyr per gruppe). E, F: Tumor TAC representerer gjennomsnittstellinger fra en dynamisk 60 minutter til skanning for PC9 (E) og A549-xenotransplantater (F) etter karboplatin behandling (kjøretøy, 24 timer eller 48 timer karboplatin-behandlede;
n =
4-6 dyr per gruppe).
neste vurderes
18F-ICMT-11 som en sensitiv markør for tumor celledød
in vivo
. Tumor-forbundet
18F-ICMT-11 radioaktivitet ble bestemt ved dynamisk 60-minutters PET billeddiagnostikk. Representative aksiale bilder som viser tumor-assosiert
18F-ICMT-11 er illustrert i figurene 4C og 4D for PC9 og A549-tumorer, respektivt. 3D-regioner av interesse ble definert for både PC9 og A549 svulster, med gjennomsnittlig tellinger brukes til å få en tid versus radioaktivitet kurve (ROI, henholdsvis figur 4E og 4F.). For begge tumorlinjer, var det ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig tumorassosiert
18F-ICMT-11 radioaktivitet etter 24 timer og 48 timer etter behandling carboplatin i forhold til bærerkontroller som er definert ved arealet under TAC (30-60 min) eller normopptak verdier ved 60 min post radiotracer injeksjon (% ID /ml
60).
forundrer svulst heterogenitet.
Axial bilder av 30-60 min summert aktivitet avslørt en heterogen mønster av
18F-ICMT-11 fordelingen i PC9 svulster (fig. 4C), mens A549 radioaktivitet var mer homogen i sin distribusjon (fig. 4D). Selv om den partielle volumeffekten kan bidra til denne tilsynelatende heterogenitet, voxel-messig analyse av PET-dataene etter PVIS (30-60 min) bekreftet ikke-ensartet fordeling av
18F-ICMT-11 tumor radioaktivitet (Fig. 5A og 5B for PC9 og A549 henholdsvis). For PC9s, var det en klar forskyvning i PVIS histogrammer over 48 timer tidsforløpet, med et 1,5-gangers gruppe gjennomsnittlig økning i antallet voksler med høy intensitet i PC9 tumor ROIs av karboplatin injiserte mus i forhold til kjøretøyet, som vist ved de 95
th persentil (
P
= 0.01 fig. 5C). Ingen signifikant forskjell voxel intensiteter eller distribusjon ble observert i A549 svulster over behandlingstiden kurs (Fig. 5D).
De intensiteter av alle lydelementer innenfor kreft Rois ble beregnet og uttrykt som histogram plott av normalisert voxel intensitet versus antallet voksler. A, B: Typiske data fra tre representative dyr (kjøretøy, 24 timer eller 48 timer karboplatin-behandlede) for PC9 (A) og A549 (B) er vist. C, D: Den statistiske sammenligning av 95
th persentil voxel intensiteter for PC9 (C) og A549 (D) ble utført ved bruk av Prism v5.0 programvare (GraphPad). Mean ± SD (
n
= 4-6 dyr per gruppe) *,
P
. 0,05; **
P
. 0,01
H E farging av formalinfikserte svulster bekreftet PC9 svulst heterogenitet, preget av store områder av pre-eksisterende nekrose før behandling ( fig. 6A) var i overensstemmelse med den til humane lungekreftpasientprøver [22]. I den ikke-nekrotiske, «sunn» regioner av PC9 tumorer, karboplatin behandling betydelig økt apoptose, definert ved en økning i spaltede caspase-3 og TUNEL-farging (fig. 6B og 6C henholdsvis). Kløyvet caspase-3 farging av PC9 tumorsnitt var 5,4 ganger høyere etter karboplatin behandling, fra 0,76% ± 0,22% i kjøretøykontroller, til 4,11% ± 0,88% farging 24 timer etter karboplatin behandling (
P
= 0,002 ); 3,5% ± 0,70% kløyvet caspase-3 farging ble målt 48 timer etter behandling, betydelig høyere enn kjøretøykontroller (4,6 ganger økning;
P
= 0,0003, Fig. 6B). I forhold til kjøretøybehandlet kontroll PC9 svulster, TUNEL flekker var 3,5 ganger høyere 24 timer etter behandling, stiger fra 0,49% ± 0,17% farging til 1,74% ± 0,17%, (
P
= 0,047; fig. 6C). Ingen signifikant endring i TUNEL farging ble målt 48 timer etter behandlingen på grunn av store variasjoner i tilfeldig utvalgte FOVs. I A549-tumorer, karboplatin behandlingen resulterte i tap av celledannelse, definert ved H øker fra 0,14% ± 0,05% til 0,87% ± 0,02% i kjøretøy og 24 h karboplatin-behandlede svulster, henholdsvis (
P
= 0,0015, Fig. 6A 6C). En liten høyde i kløyvet caspase-3 farging ble målt 48 timer etter carboplatin behandling i A549 svulster, øker fra 0,34% ± 0,07% i kjøretøy-behandlede svulster til 0,70 ± 0,13% (2 ganger økning;
P
= 0,02;. fig. 6B)
Tumor vev ble fjernet etter PET avbildning scan, bearbeidet for histologisk analyse og farget for aktiv (spaltet) caspase-3, og DNA-fragmentering (TUNEL-analysen) deteksjon i forbindelse med H E farging. A: Representative bilder av histologiske tumorsnitt vises. Flekker intensiteter for spaltede kaspase 3 (B) og TUNEL (C) ble bestemt ved bruk av ImageJ programvare og uttrykt som prosent flekker per felt. Dataene er gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; ***,
P
0,001.
n
= 3 kreft seksjoner med fem tilfeldig FOV per seksjon. Fotografiske bilder av H E-fargede seksjoner ble kjøpt til 100 ×, med alle andre bilder ervervet 400 ×. Scale bar = 200 mikrometer. Forkortelser: N, nekrotisk; V, levedyktig.
Diskusjoner
Platinum-basert terapi er fortsatt den mest effektive behandlingsregime for avansert NSCLC med responsrate på 15-30% i uselekterte pasienter (median overlevelse, 10- 12 måneder) [23]. Flere mekanismer har blitt beskrevet å underst medfødt og ervervet resistens til platina-basert terapi som involverer endringer i nucleotide excision reparasjon [21]. ERCC1 uttrykk spiller en sentral rolle i disse DNA skadet-mediert reparasjon trasé [24]. Flere nylig, andre mekanismer som involverer
EGFR
er beskrevet. Spesielt epistatisk interaksjoner mellom FANCD2 og mutant
EGFR
celler har vist seg å svekke homolog rekombinasjon reparasjon og sensibilisere celler til platinabasert terapi [20].
