Abstract
Prosessen med mobil transformasjon innebærer kaskader av molekylære endringer som er modulert gjennom endret epigenetisk, transkripsjon, post-translasjonell og protein regulatoriske nettverk. Dermed kan identifisering av transformasjons-assosiert protein endringer gir et innblikk i de store regulatoriske trasé aktiveres under sykdomsprogresjon. I den foreliggende proteinekspresjon profilering tilnærming, identifiserte vi differensial sett av proteiner i en to-dimensjonal gelelektroforese skjerm av en serøs ovarial adenokarsinom progresjon modell. Funksjonsbasert kategorisering av proteiner utelukkende forbundet med pre-transformerte celler identifisert fire cellulære prosesser som RXR-γ er kjent for å modulere cellulær differensiering og apoptose. Vi undersøkt dermed den funksjonelle relevansen av RXR-γ uttrykk og signalering i disse to banene i løpet av tumorprogresjon. RXR-γ ekspresjon ble observert å modulere cellulær differensiering og apoptose i steady-state pre-transformerte celler. Interessant nok var retinoid behandling funnet å forbedre RXR-γ uttrykk i transformerte celler og bevisstgjøre dem mot apoptose
in vitro
, og også redusere veksten av xenografter avledet fra transformerte celler. Våre funn understreker at tap av RXR-y-nivåer synes å gi mekanistiske fordeler til transformerte celler mot oppkjøpet av resistens mot apoptose kjennetegn på kreft, mens effektive retinoid behandling kan utgjøre en levedyktig tilnærming til sensibilisering av tumorceller til apoptose gjennom induksjon av RXR- γ uttrykk
Citation. Kalra RS, Bapat SA (2013) Expression Proteomics Spår Tap av RXR-γ i løpet av progresjon av ovarialcancer. PLoS ONE åtte (8): e70398. doi: 10,1371 /journal.pone.0070398
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 08.02.2013; Godkjent: 18 juni 2013; Publisert: 6. august 2013
Copyright: © 2013 Kalra, Bapat. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi, Government of India, New Delhi til SAB [Grant no. BT /PR7186 /MED /14/965/2006]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en moderne syn på tumorigenesis er transformasjons resultatene som en flertrinnsprosess som involverer genetisk, epigenetisk, mobilnettet og vev-tilknyttede endringer [1], [2], [3]. Disse effekt endringer i flere regulatoriske og funksjonelle nettverk i cellen som fører til en progressiv oppkjøp av evnene til selvforsyning i vekstsignaler, ufølsomhet for anti-vekstsignaler, ubegrenset replicative potensial, unndragelse av apoptotiske signaler, vev invasjon og metastasering, og vedvarende angiogenese [4]. Mer i det siste, har energiomsetningen omprogrammering og unndra immune ødeleggelse fått anerkjennelse som ytterligere kjennetegnene ved transformasjon [5].
ovarialcancer (EOC) er anerkjent som den femte vanligste kreftformen og den høyeste årsaken til kreft-relaterte dødsfall blant kvinne [6], [7]. En begrensning i EOC studier er mangelen på identifisering av pre-neoplastiske lesjoner som fører til hurtig og aggressiv metastase, ved hvilket stadium av sykdommen oftest diagnostisert. Dette blir ytterligere gjort mer komplekse fra nylige funn som antyder høy grad EOC å stamme i egglederen epitel, i motsetning til den klassiske meningen av ovarian overflate epitel blir cellen opprinnelses [8], [9]. Selv om moderne proteom- analyser tilveiebringe en dynamisk og effektiv kilde for identifikasjon av tumordempere, onkogener, kreftdiagnostikk og terapeutiske midler [10], [11], [12], [13], et utvidet forståelse av den flertrinns transformasjon hendelser i EOC vis-a-vis endrede molekylære uttrykk blant transformert og pre-transformerte celler gjenstår å løses.
Denne studien er basert på proteomikk profilering av en
in vitro
modell av serøs eggstokkene adenokarsinom ( SeOvCa) etablert tidligere i vår lab [14]. Kort fortalt, vi hadde etablert flere encellede klone avledet kulturer fra de ondartede ascites av en grad IV serøs eggstokkene adenokarsinom pasient. Nitten av disse gjennomgikk spontan immortalization og ble etablert som sammenhengende linjer. A4 klon ble en av disse klonene. I sin innledende passasjer, ble det sett på som slow-sykling og ikke-tumorigent; Men rundt passasjen 20-25 det forvandlet til et aggressivt tumorigent klone med metastaserende evner. Disse dataene tyder på at tidlige A4 celler, selv om de mangler tumorigenecity hadde allerede kjøpt noen av funksjonene i transformasjon. Derav referert til disse som pre-transformert (A4-P), mens de transformerte celler avledet fra A4-P-celler ble betegnet som A4-T. Dette har gitt oss en passende progresjon modell av to funksjonelt atskilte cellegrupper avledet fra en enkelt klon i tumoren. Proteome profiler av denne A4 progresjon modellen løst gjennom to-dimensjonal gel elektroforese (2DE) etterfulgt av MS (MALDI-TOF /TOF) førte til avledning av spesifikke protein grupper basert på deres eksklusive og differensial uttrykk mønstre.
karakterisering av de funksjonelle nettverk som er definert av slike proteiner gitt et klart innblikk i endret cellulær funksjonalitet og større stier involvert i eggstokkene celle transformasjon. Av disse RXR-γ modulert cellulær differensiering og apoptose var eksklusivt til de forhåndstransformerte celler. Modulering av retinol stoffskiftet har blitt foreslått i forbindelse med EOC progresjon [15], [16] som reduserte nivåer av CRBP1 (mobil retinol-bindende protein-1) er regnet som en viktig skritt i utviklingen av transformasjonsprosessen [17]. Imidlertid gjenstår den nøyaktige betydningen av RXR-γ signale stor grad uncharacterized. Vi har løst funksjonell rolle i de transformerte cellene i vår modell progresjon gjennom induksjon av ekspresjon ved behandling med selektive retinoider, inkludert 9
Cis
-Retinoic syre (CRA), Adapalane (ADA) og 4 – [(E) – 2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftalenyl) -1-propenyl] benzosyre (TTNPB). Slik modulering av cellulær differensiering og apoptose av RXR-γ i SeOvCa utvider ytterligere vår nåværende forståelse av cellulær transformasjon.
Resultater
Comparative protein uttrykk analyse av A4-P og A4-T epitelial eggstokkreft progresjon modell
de funksjonelt forskjellige A4-p og A4-T epitelceller eggstokkreft celler viser en distinkt fenotype, med den tidligere vesen spindel-formet mens sistnevnte vises epitel-aktig i morfologi (fig. 1a). 2-DE geler ble fremstilt ved bruk av proteomet prøver av A4-P og A4-T-celler. To teknisk sett av 2-DE analytiske geler ble fremstilt fra hver fenotype i hvert forsøk, som ble utført i triplikat (totalt 6 replikater) og sølv-farget. Skannede bilder ble behandlet ved hjelp PDQuest og proteiner med differensial uttrykk ble kommentert. En gjennomsnittlig, 400-500 differensial protein flekker ble dermed avgrenset. Annotering av flekker førte til avledning av protein sett basert på deres uttrykk mønstre i hver celletype. Mot identifisering av differensial protein uttrykk, ble valgt protein flekker fordøyd og massespektra ble generert i MS /MS analyser. GPS Explorer programvare (v.3.6) ble brukt til å sende den kombinerte MS og MS /MS-data fra MALDI-TOF /TOF til Mascot mot SwissProt database. For alle proteiner dermed analysert, fornuftig rekkefølge dekning, lav indeks av masse feil og høy konfidensintervall (CI ≥95%) ble oppnådd.
A. Morfologiske forskjeller mellom A4 pre-transform (A4-P) og A4 transform (A4-T) celler (Bar 100μ). B, Analytisk rør; Lavere Panel-representant gel bilder som viser utelukkende uttrykte proteiner i A4-P-celler (venstre – EEx) og A4-T-celler (høyre – LEX). C, Venn-diagram som viser proteiner kategorisert under alle 4 undergrupper. D.i-ii, Pie diagram som viser molekylære funksjonalitet og veier i forbindelse med identifiserte henholdsvis A4-P og A4-T proteiner. E, Kvantitativ protein uttrykk for vimentin, Cytokeratin-8 og Cytokeratin-18; Dataene som vises er representative for 3 separate eksperimenter avbildet som gjennomsnitt ± SEM *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0.00.
avledning av protein grupper basert på uttrykk mønster
MS /MS basert protein identifikasjon førte til avledning av to grupper av forskjellig uttrykt proteiner (fig. 1B).
Gruppe I
består av proteiner som ble uttrykt kvalitativt (utelukkende) i enten A4-P eller A4-T (betegnet som EEx og Lex proteiner henholdsvis), mens
Gruppe II
inkluderer proteiner uttrykt på kvantitativt forskjellige nivåer (minimum to-ganger forskjell ekspresjon mellom de to celletyper). Begge gruppene ble videre delt inn i to undergrupper basert på deres uttrykk i respektive celletyper. Annotering av kvalitative og kvantitative uttrykk ble utført innenfor hver replikasjons sett A4-P og A4-T-celler. Totalt 10 og 34
Gruppe I
proteiner og, 31 og 48
Gruppe II
proteinene ble identifisert som blir uttrykt i henholdsvis A4-P og A4-T-celler (figur 1C;. Tabell S1). Tabell 1 2 lister de identifiserte
Gruppe I
og
Gruppe II
proteiner med spesifikke stikk tall, molekylær og funksjonsbeskrivelse sammen med detaljene i kamp peptider, proteiner poengsum, sekvens dekning (%) og relative uttrykk fold-endring.
Kategorisering av funksjonelle trasé basert på innrapporterte ontologier og uttrykk validering
Gene ontologi analyserer videre identifiserte forskjellige molekylære funksjoner og stier knyttet til de identifiserte proteinprofiler i de to celletyper (fig. 1D.i). Dermed flere cellulære reguleringsmekanismer inkludert proteinsyntese, cytoskjelettet organisasjon, signaltransduksjon, regulering av apoptose og protein degradering ble i stor grad beriket med og bidro til funksjonaliteten til A4-P-celler. Disse ble foreslått til å ha en cross-talk med andre veier som protein og energi metabolisme, RNA metabolisme, celledifferensiering og redoksreaksjoner.
Motsatt, funksjonell gruppering av proteiner i A4-T-celler består trasé i forbindelse med de klassiske kjennetegnene på kreftceller
nemlig
. resistens mot apoptose, energiomsetning, celleproliferasjon, angiogenese og invasjon og metastaser (fig. 1D.ii). Således molekyler som er involvert i forbindelse med proteinsyntese, bretting og transportere styre dynamisk prosess av proteinmetabolisme i transformerte celler overfor søker sin proliferative aktiviteter.
Mot bekrefter verdiene av noen av de identifiserte proteiner, deres uttrykk ble validert mellom A4-P og A4-T-celler gjennom immunoblotting (fig 1E;. fig. 2A, B, C, D). SeOvCa er unikt ved at det er transformasjonen assosiert med ekspresjon av epitel-markører [21]. Forbedret vimentin uttrykk i A4-P-celler foreslår mesenchymale mens forhøyede nivåer av Cytokeratin 8 og 18 i A4-T-celler korrelerer med epitelceller funksjoner henholdsvis (Fig. 1E), foruten å være i samsvar med sin celle morfologi og den rådende hypotesen.
Kvantitativ validering av uttrykket og brett endring av noen proteiner, som er identifisert i begge grupper; Gruppe I proteiner, A, utelukkende uttrykt i A4-P og B, i A4-T-celle henholdsvis; mens D, gruppe-II proteiner kvantitativt oppregulert i A4-P-celler og E, i A4-T. E. Relativ ekspresjon av RXR-γ og β-aktin i CRA, ADA eller TTNPB retinoider behandlet A4-P (P) og A4-T (T-celler) bekreftet ved hjelp av immunblotting. F. Kvantifisering av relativ RXR-γ ekspresjon i A4-P og A4-T-celler. Statistisk analyse viser test av betydning (* -kontroll A4-P og retinoider behandlede celler; $ – kontroll A4-P og retinoider behandlede celler) .Den data som vises er representative for tre separate eksperimenter og avbildet som gjennomsnitt ± SEM *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
. 0,001
Funksjonell karakterisering av RXR-y en eksklusiv gruppe i protein
ti gruppe i proteiner ble uttrykt utelukkende i A4-p-celler (EEX proteiner). Litteraturbasert funksjonell annotering førte til deres categorizat ion i fire funksjonelle grupper
nemlig
Cell differensiering og apoptose –
RXR-γ, PRDX4;.
Celleproliferering
– GNA11, PIBF-en, ANXA5, Cathepsin D (CTSD);
Mitose og cytokinese
– KLH9;
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT).
– TPM1, ANXA5
Mens alle de ovennevnte funksjoner er relevante i ferd med transformasjon, vi fokusert på å studere funksjonaliteten til cellulær differensiering og apoptose som er kritisk for å opprettholde vev homeostase og kjent for å bli regulert av RXR-γ på transkripsjonsnivået ved dimerisering med retinsyre eller retinsyre X-reseptorer (henholdsvis RAR eller RXR) eller andre ettergivende heterodimer partnere som PPAR-γ [22], [23 ], [24]. Vi besluttet derfor å undersøke hvilken rolle RXR-γ i vår ovarialcancer progresjon modell.
RXR-y-interaksjoner med kjernefysiske reseptorer og modulering av celledifferensiering i A4-P-celler ved retinoider behandling
Retinoid behandling forbedrede RXR-y-nivåer i A4-P-celler; og interessant, gjenopptatt betydelig uttrykk i A4-T-celler i tillegg (Fig. 2E, F). CRA og ADA individuell behandling forhøyet RXR-y-nivåer i begge celletyper, selv om dette induksjon var mindre effektiv i kombinasjon med TTNPB. Mot validering av RXR-y-interaksjoner med andre nukleære reseptorer, co-immunopresipitering og immunoblotting ut akseptert interaksjoner med PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α og RAR-α i pre-transformerte celler (fig. 3A, B). Evaluering av RXR-γ involvert i cellulær differensiering ble oppnådd gjennom profilerings epitel-markører E-cadherin (E-CAD), Cytokeratin 18 (CK-18) og mucin-1 (Muc-1) ved genekspresjon og proteinnivåer, i steady state og ved eksponering for naturlig
nemlig
. CRA og syntetiske retinoider (ADA og TTNPB) (Fig. 3C). Ved steady state ble lavere uttrykk for E-Cad observert i A4-P-celler. Uttrykk for E-Cad ytterligere økt med CRA og også med ADA; CRA ble gitt alene eller i kombinasjon med ADA og TTNPB. Nivåer av E-Cad, CK18 og Muc-en var endogent høyere i A4-T-celler. Syntetisk retinoid ADA alene eller i kombinasjon med CRA oppregulert CK18 ekspresjon i begge celletyper. Selv om spesifikke rollen TTNPB i cellulær differensiering er ukjent, TTNPB behandling resulterte i mindre oppregulering av differensieringsmarkører. Alle tre markører ble forbedret som følge av retinoid eksponering i A4-P-celler og dermed som bekrefter involvering av RXR-γ i modulering av celledifferensiering. Retinoid behandling i A4-T-celler resulterte i induksjon av RXR-γ uten noen signifikante endringer i nivåene av disse epitelial differensiering markør på genekspresjon og proteinnivåer (fig. 3D, 3E).
A. Co-Immunpresipitasjon (Co-IP) med RXR-γ viser elueres immun av sølvfarging. B. Validering av RXR-γ indikerer samhandling i Co-IP med RXR-γ med PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α og RAR-α i A4-P-celler validerte gjennom immunoblotting. C. Expression profilering av CK-18, Muc-1 og E-cadherin på transcriptional (Tr) og protein (Pr) utført av semi-kvantitativ RT-PCR og immunoblotting i CRA, ADA eller TTNPB retinoider behandlet A4-P (P) og A4-T (T-celler). D. kvantifisering av mRNA uttrykk for E-Cad, CK18 og MUC1 epitelial differensiering markører i A4-P (P; linje) og A4-T-celler (T; stiplet linje) på retinoider behandling validert gjennom RT-PCR. E. kvantifisering av protein uttrykk for E-Cad, CK18 og MUC1 stakere i A4-P (P; linje) og A4-T-celler (T; stiplet linje) på retinoider behandling validert gjennom immunoblotting. Viste data er representative for tre separate forsøk avbildet som gjennomsnitt ± SEM *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001.
Retinoid indusert RXR-y-nivåer bevisst forvandlet cellene mot apoptose via indre vei
Role of RXR-γ i formidling apoptose som svar på naturlige og syntetiske retinoider ble evaluert (fig . 4A). Ved steady state, apoptose var betydelig lavere i A4-T-celler i forhold til A4-P-celler som indikerer oppkjøpet av resistens mot apoptose under transformasjonsprosessen. Apoptose ble forbedret i begge celletyper for eksponering av CRA og ADA – enten alene eller i kombinasjon (Fig.4B). Mens TTNPB i seg selv ikke klarte å indusere celledød, i kombinasjon med ADA og cra sensibilisert det A4-T-celler til apoptose. Retinoid-mediert aktivering av RXR-γ ekspresjon ble også funnet å korrelere direkte med høyere nivåer av apoptose (Fig. 2E, F). Vi profilert uttrykk for transkripsjonsfaktoren Snail (som motvirker p53-mediert pro-overlevelse signalering gjennom aktiv undertrykkelse av pro-apoptotiske molekyler PUMA /BBC3, minibank og PTEN i eggstokkreft celler under stress, [19]) for å evaluere effekten av RXR-γ ledede apoptose på den. Caspase 9, en markør for indre apoptose vei, oppregulert i løpet av RXR-γ og PPAR-γ induksjon og Bcl-2 som markører for apoptose [25]. Snail og BCL-2 uttrykk ble redusert, mens signifikant forhøyet uttrykk for RXR-γ, PPAR-γ og caspase 9 var tydelig på retinoid behandling (fig. 4C, 4D, 4E). Ekspresjonen av disse molekylene ble ytterligere forbedret på kombinatorisk retinoid behandling. Vi har undersøkt ytterligere effekter av retinoider for cellesyklus-profiler (fig. S1A, 1B). Som forventet, steady state A4-T-celler ha høyere sample- G2 /M populasjoner enn A4-P-celler som indikerer aktiv spredning. CRA behandling forbedrer apoptose sammen med G2 /M arrest i A4-P-celler mens ADA og TTNPB indusere bare G2 /M arrest. I kombinatoriske behandlinger, CRA med ADA eller tilstedeværelse av alle tre retinoider induserte en G1 /S ble arrestert i transformerte celler.
A. Annexin V-FITC analysedata som viser apoptose i A4-P og A4-T-celler på ulike retinoider behandlingsregimer; hvor jeg. har ingen retinoid behandling, ii. behandlet med CRA, iii. med ADA og iv. med både å ha alternativ behandling av en annen syntetisk retinoid dvs. TTNPB. B. Statistisk analyse av apoptose-analyse viser signifikant apoptose hos begge celletyper i forskjellige sett av retinoid behandling. C. Ekspresjon analyser av RXR-γ, PPAR-γ, Bcl-2, caspase 9 og snegle ved transcriptional (Tr.) Og proteinnivå (Pr.) Ved RT-PCR og immunoblotting respektivt. D. Kvantifisering av mRNA uttrykk, jeg. ekspresjon av RXR-γ, PPAR-γ, caspase 9, Bcl-2 og snegl på retinoider behandling i A4-P-celler mens, ii. viser deres nivå i A4-T-celler på validering gjennom RT-PCR. E. Kvantifisering av proteinekspresjon, i. uttrykk for RXR-γ, PPAR-γ, caspase 9, Bcl-2 og snegl i A4-P-celler mens, ii. viser deres nivå i A4-T-celler ved retinoider behandling validert gjennom immunoblotting.
In vivo retinoid behandling redusere xenograft vekst i NOD-SCID mus gjennom RXR-γ mediert sensibilisering av transformerte celler mot apoptose
Vi har utvidet den ovenfor re-sensibilisering av RXR-y-nivåer i A4-T-celler effekter oppnås ytterligere
in vitro
til eksperimentelle tumorer (fig. 5A). Gjennomsnittlig tumorvolum (fig. 5B, 5C) ved hvert punkt langs behandling med gjennomsnittlig tumorvolum og vekt på syvende uke (fig. S1C, S1D) viste signifikant reduksjon i retinoid-behandlede mus tumorer sammenlignet med de i DMSO behandlede kontroller. Samlet er kombi retinoid behandling var mest effektive. De utpreget oppregulert RXR-y uttrykk i retinoid-behandlede svulster sterkt at sensibilisering av transform A4 celler til apoptose. Kombinert virkning av retinoider ble funnet å være mest dødelige for tumorvekst gjennom gjenopptatt RXR-γ mediert apoptose av tumorceller
in vivo
. RXR-y-nivåene ble funnet signifikant høyere i alle 5 sett inkludert CRA, CRA TTNPB, ADA, ADA TTNPB og CRA, ADA TTNPB; i forhold til DMSO bærerkontroll. Dette er en definitiv sammenheng med RXR-γ stimulering og induksjon av apoptose i disse cellene
in vitro plakater (Fig.5D).
A. Eksperimentell prosedyre illustrerer retinoider behandling regimet i NOD-SCID mus. Musene ble observert opptil tre uke til tumorstørrelse vokser 25-30 mm
3, behandling av DMSO, CRA, CRA + TTNPB, ADA, ADA + TTNBP og CRA + ADA + TTNBP startet på 4
th uke og gikk videre opptil 7
th uke. B. grafisk fremstilling som viser tumor-volum av kontroll og retinoider behandlede NOD-SCID-mus ved forskjellige tidspunkter. C. Sammenlignende tumorstørrelser på kontroll og retinoider behandlede tumorer. D. Kvantitativ uttrykk for RXR-γ i kontroll- og retinoider behandlet svulster validerte gjennom immunoblotting. Viste data er representative for tre separate forsøk (n = 6 for
in vivo
eksperimenter) og avbildet som gjennomsnitt ± SEM *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
. 0,001
Diskusjoner
eksistensen av flere histologiske sub-typer som korrelerer med annen celle (r) -av-opprinnelse i eggstokkreft [26] er fortsatt et hinder i etablering av representative progresjonsmodeller i denne sykdommen. Dette er i motsetning til andre ondartede sykdommer slik som prostatacancer, hvor slike modeller har blitt anvendt i løpet av de siste to tiår på å belyse molekylære mekanismer for sykdoms [1], [27], [28], [29]. I denne studien, detaljert eksklusive og differensial protein profilering av en progresjon modell etablert tidligere i vår lab gitt ny innsikt i endrede molekylære mønstre under SeOvCa progresjon. A4-P-celler med replicative udødelighet representerer en pre-neoplastisk scenen mens A4-T-celler med aggressive og metastatiske egenskaper er representative for transformasjon og utvikling av sykdommen.
Våre data bekrefter at de to funksjonelle tilstander av modellen er forbundet med forskjellige proteinprofiler. Innenfor gruppen av proteiner eksklusive til A4-P-celler, karakterisering av rollen RXR-γ avdekket en sensitivitet på pre-transformerte celler til apoptose og differensiering som beskrevet tidligere [30]. Kompromitterte RXR-y-nivåer er også rapportert i flere maligniteter inkludert ikke-småcellet lungekreft [31]; hvor det også har blitt rapportert at epigenetisk stanse av RXR-γ korrelert med redusert total overlevelse av pasienter [32]. I vår pre-transformerte celler samarbeider RXR-γ med PPAR-γ, RAR-γ, RAR-α og RXR-α for å danne funksjonelle heterodimere komplekser, der RXR-γ med PPAR-γ koordinater cellular apoptose gjennom indre vei bekreftet med forhøyet Caspase-9 nivåer. Videre observerte vi at RXRγ aktivering i transformerte celler gjen sensitizes dem til apoptose som en synergistisk effekt av agonister som medierer cytotoksiske effekter
in vitro
så vel som i eksperimentelle tumorer (fig. 6). Dette er en viktig identifikasjon mot anvendelse av retinoid-baserte terapier. I denne studien karakteriseres vi pleotropic natur RXR-γ signalisering i vår SeOvCa-progresjon modellsystem. Tap av RXR-y-nivåene angitt å lette mekanistiske fordeler til transformerte celler mot oppkjøpet av resistens mot apoptose; følgelig retinoid-sensibilisert kreftceller oppregulere RXR-y-nivåer fører til betydelig celledød.
A. RXR-γ modulasjon ved steady state i pre-transformerte celler; retinoider behandling forbedrer RXR-y nivåer og skalere opp apoptose (på RXR-γ interaksjon med PPAR-γ) og uttrykk for epitelial differensiering spesifikke markører (på RXR-y-interaksjoner med RAR-γ, RXR-α og RAR-α). B. Mangel på RXR-γ gir fordelene av resistens mot apoptose i transformerte celler; retinoid behandling indusert RXR-y-nivåer bevisstgjøre disse cellene mot betydelig apoptose.
Den nåværende proteomikk tilnærmingen er en første redegjørelse for endringer i SeOvCa som reflekterer på ulike transformasjons-forbundet funksjonelle veier. Betydelig, kan RXR-γ signalering være en potensiell gateway i å forebygge sykdomsprogresjon. Klarlegging av RXR-γ signale strekker moderne tilnærminger til mobil transformasjon i SeOvCa som nå kan utnyttes videre i utvikling og evaluering av nye behandlingsformer.
Materiale og metode
Etikk uttalelse
Alle dyr arbeidet ble utført med Nasjonalt senter for Cell Science (NCCer) Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) godkjennelse av eksperimenter i NCCer Experimental Gjengen (EAH) Facility, og ble utført i henhold til de normer, lover og retningslinjer fastsatt av komiteen.
Cell kultur, behandlinger og transfections
avledning av A4 progresjon modell av pre-transformerte og transform SeOvCa celler (A4-p og A4-T-celler) er beskrevet tidligere [14], [18]. Retinoid (RXR-γ ligand) behandling ble utført ved hjelp av enten naturlig retinoid
nemlig
. 9
Cis
Retinsyre (CRA, 10 mm) eller syntetiske retinoider Adapalene (ADA, 2 mikrometer, RAR-agonist) eller 4 – [(E) -2- (5,6,7,8 -Tetrahydro – 5,5,8,8 tetramethyl – 2 naphthalenyl) – en -propenyl] benzosyre Arotinoid syre (TTBPB, 10 uM, RXR og RAR-agonist) for 48t
Prøvepreparering, to-dimensjonal elektroforese (. 2DE) og bildeanalyser
Cell pellets (10
7) av A4-P og A4-T ble suspendert i 500 mL ml urea lysisbuffer inneholdende 8 M urea, 2 M Thiourea, 100 mM DTT , 2% CHAPS og 0,2% amfolytter med protease-inhibitor cocktail (Amersham USB-standarden). Celleekstrakt ble tillatt å blandes i minst 15 minutter og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur for å lette riktig protein solublisation. Proteinprøver ble ytterligere sentrifugert (110,000g i 1 time ved 4 ° C) og suspensjonen ble oppsamlet. Proteinkonsentrasjonen ble estimert med 2DE Quant kit (GE Healthcare) ved 480 nm (Bekman Coulter). Forberedt prøvene ble kjørt på første dimensjonen (PI), etterfulgt av av andre dimensjonen i denaturering SDS-PAGE (Mw). I alt 350 pg hel celleprotein lysat ble tatt på 18 cm immobiliserte pH-gradient (IPG) strimmel (pH 4-7) og rehydrert over natten. En tre trinns IEF spenning programmet ble klargjort i henhold til strimler på en Protean IEF celle (Bio-Rad): 50 V for 20 minutter, 10 000 V i 2 timer minutter og 10 000 V for 45 000 V-hr. Strimlene ble ytterligere redusert ved inkubasjon i likevekts /nedsettelse buffer (6 M urea, 0,375 M Tris pH 8,8, 2% SDS, 20% glyserol, 2% (w /v) DTT (Sigma)) og deretter alkylert den samme buffer, men inneholdende 2,5% (w /v) Jodacetamid (Sigma) i stedet for DTT. Den andre dimensjon ble utført ved å kjøre IPG strimler på 1,0 mm tykk på 10% – (vekt /volum) – SDS-PAGE. Geler ble farget med massespektrometri kompatibel endret Coomassieblå (Pierce, Thermo-Fisher) og sølvfarge. Bilde oppkjøp av protein gel ble oppnådd ved bruk Antall One® programvare VersaDocTM system (Bio-Rad Laboratories, USA) med like para verdier. Bildeanalyse og flekk deteksjon ble utført på PDQuest 2-DE-analyseprogramvare avansert versjon 8,0 (Bio-Rad). For kvantitativ og kvalitativ flekk sammenligning på tvers av både gels, kamp-sett (Master sett) av seks replikater av A4-P og A4-T 2de-geler ble utarbeidet og analysert. Programvare letter annotering av hvert enkelt sted, ble unike identiteter gitt til hver protein flekker av replikere gel. En analyse sett av proteiner er utarbeidet for å identifisere områder som er vesentlig forskjellige. Analyse satt ble gjort på bakgrunn av identifiserte proteiner ble unik for A4-P og A4-T og vanlige flekker blant to replikere grupper med en 2,0 gangers mengde variasjon terskel. Totalt estimat av matchede og umatchede flekker var forberedt på å endelig bilder og differensial proteiner ble identifisert i mellom to celletyper representative gels.
I-gel fordøyelse og protein identifikasjon ved hjelp av MALDI-TOF /TOF
Protein flekker i 2DE viser differensial uttrykk og som tilfredsstiller de statistiske kriterier ble valgt ut og skåret for i-gel fordøyelse og videre MS analyser. Spot eksisjon ble utført manuelt ved hjelp av sterile skarpe sted cutter. Kort sagt ble gelen skivene avfarves i 25 mM ammoniumbikarbonat, påfølgende dehydrert med en 02:01 blanding av 50 mM ammoniumbikarbonat: 100% acetonitril (ACN) for gjentatt 3 ganger hver 5 minutter. Gel Skivene ble redusert med 10 mM DTT ved 60 ° C i 1 time. Etter avkjøling ble gel skivene inkubert i 15 minutter ved værelsestemperatur med 50 mM jodeddiksyre. Etter vasking og dehydratisering gel skiver med 25 mM ammoniumbikarbonat og ACN i 10 minutter, de ble vakuumtørket og tryptisk fordøyelse utført med 50 mM ammonium-bikarbonat inneholdende 20 ug /ml modifisert proteomikk karakter trypsin (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjoner og holdt på is i 30 min. Ytterligere 25 mM ammonium-bikarbonat ble tilsatt, og fordøyelse ble fortsatt over natten ved 37 ° C. Hentet peptider ble helt tørr med en speedvac og re-suspendert i 10 mL av 20% Ammoniumbikarbonat og 1% maursyre løsning.
Etter bearbeiding gjennom Zip-Tip pipettespisser (Millipore, USA), peptid blandinger ble oppløst med matriseoppløsningen. Matrisen som brukes for MALDI-analyse var a-cyano-4-hydroxycinnamic syre (Sigma) ved 20 mg /ml i 50% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre. Like volumer av peptid og matriseoppløsning ble blandet, og 1 ul av den resulterende løsning ble oppdaget på en rustfri stål MALDI prøveplaten. Spectra av fordøyd peptider ble kjøpt på en 4800 MALDI-TOF /TOF massespektrometer (AB Sciex, Framingham, MA) knyttet til 4000-serien explorer (versjon 3.5.3). Produserte massespektra ble tatt opp i en reflektor modus i et masseområde 800-4000 Da, ved anvendelse av en Nd: YAG laser 355nm. Den akselerasjonsspenning og uttrekks-spenning ble satt på 20 kV og 18 kV respektivt. Seks poeng kalibrering av instrumentet ble utført med peptid standard kit (AB Sciex). Alle MS-spektra ble oppnådd fra akkumulering på 900 skudd. MS /MS spektra ble kjøpt med en total opphopning av 1500 laser skudd og kollisjonsenergi på 1kV. Ved fullføring av MS undersøkelsen skanner, ble dataene behandlet for å generere en liste over forløperionene for avhør av MS /MS. De kombinerte MS og MS /MS-topp listene ble undersøkt ved hjelp av GPS
TM Explorer programvare versjon 3.6 (AB Sciex). Protein identifikasjon ble utført av MS /MS ion søk ved hjelp MASCOT (versjon 2.1) (https://www.martixscience.com) søkemotor mot SwissProt database.
