Abstract
Bakgrunn
konstitutivt aktiv androgen reseptor varianter (AR-V) mangler den ligandbindende domene (LBD) kan fremme utvikling av kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Ekspresjonen av AR-Vs i klinisk viktigste metastatisk området, ben, har imidlertid ikke blitt godt dokumentert. Vårt mål var derfor å sammenligne nivået av AR-Vs i hormon-naive (HN) og CRPC benmetastaser i forhold til primær PC og ikke-ondartet prostatavevet, så vel som i forhold til AR-protein expression, hel-genom transkripsjon profiler og pasient overlevelse.
metodikk /hovedfunnene
hormon-naive (n = 10) og CRPC benmetastaser prøver (n = 30) ble oppnådd fra 40 pasienter ved metastasekirurgi. Ikke-maligne og maligne prostataprøver ble kjøpt fra 13 prostatectomized menn. Nivåer av full lengde AR (ARfl) og AR-Vs kalt AR-V1, AR-V7, og AR-V567es mRNA ble målt med RT-PCR og hel-genom transkripsjon profiler med en Illumina Beadchip array. Protein nivåer ble undersøkt ved Western blotting og immunhistokjemi. Transkripsjoner for ARfl, AR-V1, og AR-V7 ble påvist i de fleste primære svulster og metastaser, og nivåene var signifikant økt i CRPC benmetastaser. AR-V567es avskrift ble påvist i 23% av CRPC benmetastaser bare. En undergruppe av CRPC benmetastaser uttrykt LBD-avkortede AR-proteiner på nivåer sammenlignbare med den ARfl. Påvisbare AR-V567es og /eller AR-V7 mRNA i øvre kvartil, sett i 1/3 av alle CRPC benmetastaser, var assosiert med en høy kjernefysisk AR farging score, forstyrret cellesyklus regulering og kort overlevelse.
Konklusjon /Betydning
uttrykk for AR-Vs økes CRPC forhold til HN benmetastaser og forbundet med en særdeles dårlig prognose. Videre studier er nødvendig for å teste om pasienter uttrykker slik AR-Vs i sine benmetastaser mer nytte av legemidler som virker på eller ned-stream av disse AR-Vs enn fra terapier som hemmer androgen syntese
Citation. Hornberg E, Ylitalo EB, Crnalic S, Antti H, Stattin P, Widmark A, et al. (2011) Uttrykk for androgen receptor spleisevarianter i prostatakreft skjelettmetastaser er assosiert med Kastrering-motstand og Short Survival. PLoS ONE 6 (4): e19059. doi: 10,1371 /journal.pone.0019059
Redaktør: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 25 februar 2011; Godkjent: 23 mars 2011; Publisert: 28 april 2011
Copyright: © 2011 Hornberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det svenske Kreftforeningen, Vetenskapsrådet, Lions Cancer Research Foundation og Nord-Sverige Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Androgener regulere normal prostata vev vekst og differensiering, gjennom aktivering av androgen reseptorer i epitel og stroma celler, og spiller også en viktig rolle i alle faser av prostatakreft (PC) vekst. Standardbehandling for pasienter med avansert PC er derfor å redusere androgener, enten ved kirurgisk eller medisinsk kastrering. Etter en periode med innledende remisjon svulster slutt tilbakefall, hovedsakelig i bein, og blir deretter kalt kastrering-resistent PC (CRPC). Mekanismene som styrer CRPC vekst i benmetastaser er imidlertid i stor grad ukjent og sjelden utforsket ved å faktisk undersøke slike metastaser hos pasienter.
Interessant, androgen reseptor (AR) er ofte aktive i CRPC tross kastrat nivåer av sirkulerende testosteron [1 ], [2] og intens atom AR immunofarging i CRPC benmetastaser er relatert til et spesielt kort overlevelse [3]. Forskjellige mekanismer er blitt foreslått for å bidra til AR aktivering i CRPC, inkludert intracrine syntese av androgener, genetiske og epigenetiske endringer av AR som gjør det mer følsomt for aktivering av androgener eller andre ligander [1], [4], [5] og ekspresjon av konstitutivt aktive AR-varianter (AR-V, se nedenfor). Disse funnene tyder på at CRPC kan bli vellykket behandlet med nye medisiner nå i kliniske studier som blokkerer androgen syntese eller AR i metastaser (anmeldt i [6]), men at konstitutivt aktive reseptorer kan fortsatt være et problem. Studier er derfor nødvendig for å undersøke om disse AR-Vs er ofte uttrykt i CRPC benmetastaser eller ikke.
Strukturelt menneske
AR
genet består av åtte eksoner som koder et 110 kDa protein som består av en NH
2-terminal trans-aktiveringsdomene (NTD), et DNA-bindende domene (DBD), en hengselsregion og COOH-terminale domene (CTD) som også er den ligand-bindende domene (LBD) [7]. LBD, kodet av exoner 4-8, er ikke avgjørende for transkripsjonen aktivitet [8]. Avkortet AR-Vs mangler LBD og foreslått å være konstitutivt aktive reseptorer har blitt oppdaget i PC-cellelinjer så vel som i kliniske prøver, inkludert Godartede, ondartede og metastatisk vev, som resultatene fra alternativ spleising eller non-sense mutasjoner av den menneskelige
AR-genet
[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Økte nivåer av AR spleisevarianter som er registrert i CRPC sammenlignet med hormon-naive (HN) PC [13], [14], [16]. Disse studiene inkluderte CRPC eksempler hentet fra primærsvulster ved kirurgi eller bløtdelsmetastaser og noen benmetastaser innsamlet ved obduksjon. Uttrykket av AR-Vs i klinisk mest relevante metastatisk stedet, bein, ikke har blitt godt dokumentert.
Hensikten med denne studien var derfor å analysere uttrykk for full lengde AR (ARfl) og klinisk mest vanlige spleisevarianter her betegnet AR-V1, AR-V7 [14] (også referert til som AR3 [13], [17], og AR-V567es [16] i HN og CRPC skjelettmetastaser i forhold til ekspresjon i primære PC og i ikke-ondartet prostatavevet. Videre AR transkripsjonsnivåer var relatert til AR protein uttrykk, hel-genom transkripsjon profiler og klinisk utfall.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien ble godkjent av den lokale etikk gjennomgang styret i Umeå universitet og deltakerne ga skriftlig eller muntlig samtykke.
Pasient
skjelettmetastaser ble hentet fra en serie av fersk frossen og formalinfiksert parafin innebygd biopsier innhentet fra pasienter med PC operert for metastatisk ryggmargskompresjon eller patologiske frakturer ved Umeå universitetssykehus (2003-2009). Disse pasientene har blitt grundig beskrevet i [3] og kliniske karakteristika og terapier er oppsummert i tabell 1. Studien inkluderer også 13 pasienter som ble behandlet med radikal prostatektomi ved Umeå Universitetssykehus, mellom februar 2005 og september 2006. Median alder for pasientene var 60 år (48-68 år) og median PSA var 6,6 ng /ml (variasjon 3,5 til 24 ng /ml). Elleve av de pasientene hadde svulster gradert som Gleason score (GS) 7 og to som GS 8. Fire av svulstene var i stadium T2 og ni i scene T3. Umiddelbart etter kirurgisk fjerning av prostata ble brakt til Pathology avdeling og skjær i 0,5 cm tykke skiver. Fra disse skiver 20 prøver ble stanset ut av hver prostata ved å bruke en 0,5 cm stålsylinder og frosset på -70 ° C i løpet av 30 minutter etter kirurgi. Prostata skiver ble så fiksert i 4% formaldehyd i 24 timer, dehydrerte, innebygd i parafin, skåret i 5 mikron tykke seksjoner og farget med hematoksylin-eosin. Naturen av de frosne vevsprøver (ikke-ondartede eller ondartede) ble bestemt ved deres plassering i hele monterte seksjoner, men også verifisert ved lysmikroskopi av hematoksylin /eosin-fargede kryostatsnitt fra hver av de vevsprøver som ble analysert som beskrevet nedenfor . I disse delene andelen av svulstvev ble kvantifisert og svulsten GS bestemt.
Tissue forberedelse og RNA ekstraksjon
Representative deler av skjelettmetastaser, primære PC og ikke-ondartet prostatavevet ble cryo-seksjonert i ekstraksjonsrør og RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol-protokollen (Invitrogen, Stockholm, Sverige). Prosentandelen av tumorceller i prøvene varierte mellom 25-95%. RNA-konsentrasjonene ble kvantifisert ved absorbans-målinger ved hjelp av et spektrofotometer (ND-1000 spektrofotometer; Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). RNA kvalitet ble analysert med 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og bekreftet å ha en RNA integritet nummer ≥6.
Real time RT-PCR
To- hundre (200) ng av RNA ble reverstranskribert med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et totalt volum på 10 pl. Den påfølgende PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaksjonene ble gjort i en 20 mL volumet ved hjelp av IQ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories). Følgende primersett ble brukt; ARfl: 5′-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 «og 5′-AGCTTCTGGGTTGTCTCCTCAGTGG-3′, AR-V1: 5»-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 «og 5′-CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT-3′, AR-V7: 5»-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 «og 5»-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3 «, og AR-V567es: 5′- CCAAGGCCTTGCCTGATTGC og 5′-TTGGGCACTTGCACAGAGAT-3′, noe som resulterer i amplikonene av 143, 145, henholdsvis 125 bp, som tidligere beskrevet [14], [16]. Primere for husholdningsgenet RPL13A (5»-GTACGCTGTGAAGGCATCAA-3 «og 5′- GTTGGTGTTCATCCGCTTG-3») amplifisert et 125 bp fragment. Hver prøve ble kjørt i duplikat og justert for tilsvarende RPL13A nivåer. Smelting kurve-analyse bekreftet de amplifiserte produkter, som ble også analysert ved 1% agarosegelelektroforese for å bekrefte den forventede størrelse (data ikke vist).
Western blot-analyse
ferskt frosset benmetastaser og prostata prøver ble Cryo-seksjonert og proteiner ble hentet fra 20 seksjoner (10 mikrometer hver) ved hjelp av AllPrep Mini kit, i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Hilden, Tyskland). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce Chemical Co., IL, USA). 22RW1 celler ble opprettholdt i henhold til produsentens instruksjoner (ATCC) og proteinene ble ekstrahert som tidligere beskrevet [18].
Prøver (20 pg protein) ble separert ved 7,5 SDS-PAGE under reduserende betingelser og deretter overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Membranene ble farget med Ponceau rødt for å bekrefte lik prøve laste- og overførings (resultater ikke vist). Membranene ble deretter blokkert i 5% melk, etterfulgt av anti-AR antistoff-inkubasjoner; N-20 (fortynnet 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) eller PG-21 (fortynnet 1:1000, Upstate, Lake Placid, New York) for å detektere ARfl og AR-Vs, og C-19 (Santa Cruz) for å påvise ARfl men ikke AR-Vs mangler LBD. Primære antistoffer ble fortynnet i 1% melk /PBST og inkubert i 4 ° C over natten. Den sekundære anti-kanin-IgG (Dako, Glostrup, Danmark) antistoff (fortynnet 1:20 000 i 2,5% melk) ble påført etter vasking i PBST og inkubert i 1 time i romtemperatur. Protein uttrykket ble visualisert etter omfattende vask med ECL Avansert målesett (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og kvantifisert med en ChemiDoc skanneren og Antall One 4 programvare (Bio-Rad Laboratories).
Immunohistochemistry
de benmetastaser undersøkt i denne studien er tidligere immunostained for AR, Ki67 (celledeling), aktivert caspase 3 (apoptotiske celler) og PSA antigener (tabell 2) følgende protokoller beskrevet før [3]. Nuclear AR og cytoplasmiske PSA immunfarging ble bedømt i henhold til intensitet (0, 1, 2 eller 3) og fraksjon av fargede celler (0, 1, 2, 3 eller 4). En totalscore (som varierer fra 0-12) ble oppnådd ved å multiplisere de fargeintensitet og fraksjons score. Totalt AR score på 8 eller høyere (median og over) ble tidligere definert som høy og funnet å være assosiert med en kortere overlevelse etter ortopedisk metastasekirurgi enn en AR total score under 8 [3]. En PSA score på 8 og nedenfor (median og under) var forbundet med en ugunstig utfall i CRPC pasienter [3]. Fraksjonene (%) av Ki67 og aktiv caspase 3 fargede tumorceller ble bestemt tidligere og funnet ikke å bli assosiert med utfallet i denne pasientmateriale [3].
genekspresjonsanalyser
To hundre-femti (250) ng av total RNA per prøve ble anvendt for produksjon av cRNA Illumina TotalPrep RNA-amplifikasjon sett (Ambion Inc, St. Austin, TX, USA) i henhold til den angitte protokoll. Kvaliteten på cRNA ble evaluert ved hjelp av RNA 6000 pico kit (Agilent Technologies) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Totalt 750 ng cRNA ble brukt for hybridisering til en menneskelig HT12-v3 Illumina Beadchip genuttrykk array (Illumina, San Diego, CA, USA), inkludert 48803 prober og 37846 kommenterte gener, i henhold til produsentens protokoll. Arrays ble skannet og fluorescens signaler innhentet ved hjelp av Illumina Bead Array Reader (Illumina, San Diego, CA, USA). Array dataanalyse ble utført med GenomeStudio programvare (versjon 2009.1, Illumina). Prøvene ble normalisert ved cubic spline algoritme og sonder med alle signaler lavere enn to ganger gjennomsnittsbakgrunnsnivåene ble ekskludert fra analysen. Differensielt uttrykte gener ble identifisert med Mann-Whitney differensiell ekspresjon algoritme (
P
0,05) og definert til å ha en fold endring i mellom gruppene er større enn 1,5. Gene ontologi analyse ble gjort med Metacore programvare (GeneGoInc. St. Joseph, MI, USA).
Statistisk analyse
Korrelasjon mellom variabler ble analysert ved hjelp av Spearman rank test. Gruppene ble sammenlignet med Mann-Whitney U test for kontinuerlige variabler og Chi-kvadrat test for kategoriske variabler. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført med døden til PC som hendelse og oppfølging tid som tiden mellom metastasekirurgi og den nyeste oppfølgningen. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap, SPSS 17,0 programvare (SPSS, Inc, Chicago, USA). En P-verdi mindre eller lik 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Høy mRNA nivåer av AR spleisevarianter i CRPC benmetastaser
transkripsjoner for normal ARfl og de mest tallrike AR spleisevarianter hittil kjente [16]; AR-V1, AR-V7, og AR-V567es, ble oppdaget og deres nivåer kvantifisert i ikke-maligne og GS7-8 vev deler av primær prostatakreft og benmetastaser prøver, ved hjelp av real-time RT-PCR-analyse. Som vist i tabell 3, ble det ARfl, AR-V1, og AR-V7-transkripter påvist i de fleste av de ikke-ondartede, primær tumor og metastaser prøvene undersøkt, mens AR-V567es transkript ble påvist i 7 (23%) av CRPC benmetastaser bare.
Det var en tendens til høyere nivåer av ARfl, AR-V1, og AR-V7 mRNA i HN benmetastaser enn i primær PC vev, men forskjellene var ikke- signifikant (figur 1). Tydelig forhøyet ARfl, AR-V1 og AR-V7 transkripsjonsnivåer ble imidlertid sett i CRPC skjelettmetastaser, som viste 8, 44, henholdsvis 120 ganger høyere median nivåer enn de HN metastaser (
P
≤0.001, figur 1). Den ARfl, AR-V1, og AR-V7 mRNA-nivåene i ikke-maligne prostata prøvene var sammenlignbare med nivåene i primær prostatatumorer (figur 1).
Alle mRNA-nivåer ble justert for tilsvarende husholdningsgenet ( RPL13a) mRNA nivåer, normalisert til medianverdien for de primære svulster prøvene, og forvandlet av den naturlige logaritmen. Nivåer i ikke-ondartet prostatavevet (
n
= 13), primær prostata tumor (
n
= 13), hormon-naive benmetastaser (
n
= 10) og kastrering-resistente skjelettmetastaser (
n
= 30) prøvene er vist i hvitt, lys grå, mørk grå og svart, henholdsvis. Målbare nivåer er ikke angitt, men representert av søyler som symboliserer laveste målbare nivå i RT-PCR analyse av hver transkripsjon variant.
Uttrykk for LBD-avkortet AR proteinvarianter i CRPC benmetastaser
Proteiner nivåer av AR-Vs ble undersøkt ved hjelp av Western blot analyse av 13 prøver av CRPC benmetastaser tilfeldig valgt til å representere tilfeller med høy AR-V7 mRNA nivåer (nivå i øvre kvartil, Q4), saker med lave og middels nivå av AR-V7 mRNA (nivåer i den laveste, Q1, og mellomliggende, Q2-Q3, kvartiler henholdsvis) så vel som påviselige /ikke-påvisbare nivåer av AR-V567es mRNA (figur 2). Den 22Rv1 cellelinje kjent for å uttrykke AR-V7 variant [13], men også ytterligere spleisevarianter [15] tjente som en positiv kontroll. En primær prostata prøve med undetectable AR-V7 mRNA fungert som en negativ kontroll (figur 2). Protein band med de forventede molekylvekter på 110 kDa (ARfl) og 80 kDa (presumingly AR-V1, AR-V7 eller -V567es) ble påvist i CRPC skjelettmetastaser, av antistoffer rettet mot N-terminale domenet til AR, mens 80 kDa AR-Vs ikke ble påvist ved anvendelse av antistoff rettet mot den C-terminale domene LBD (figur 2A). De mest intense 80 kDa bånd ble påvist i prøver med Q4 AR-V7 mRNA nivåer, mens CRPC benmetastaser med lavere AR-V7 mRNA nivåer viste lavere til ikke målbare nivåer uavhengig av tilsvar AR-V567es mRNA nivåer (figur 2B). Basert på blot intensiteter, at AR variantproteinene er innsatt i median 32% av det ARfl proteinnivå (0 til 95%,
n
= 13, data ikke vist). Dette var i motsetning til tilsvarende forholdstall på RNA-nivå hvor AR-V7 og AR-V567 transkripter som er representert i median bare 0,4% (området 0,03 til 7%, data ikke vist) og 1,0% (området 0,3 til 1,2%, data ikke vist), henholdsvis av ARfl mRNA-nivået, i henhold til forskjellen i RT-PCR-ct nivåer. Våre resultater indikerer således at AR-Vs mangler LBD domenet er mulig post-transcriptionally stabilisert i CRPC benmetastaser i forhold til ARfl.
A) Antistoffer (N-20 og PG-21) rettet mot N- terminal domene (NTD) av AR har oppdaget ARfl og AR-varianter (AR-V; presumingly AR-V1, AR-V7, og /eller AR-V567es). Antistoff C-19 rettet mot LBD oppdaget ARfl av ~110 kDa, men ikke de LBD-avkortede AR varianter av ca ~80 kDa. B) Analyse av CRPC benmetastaser som representerer prøver med høye nivåer av AR-V7 mRNA (-nivåer i det høyeste kvartil, Q4, ifølge RT-PCR-analyse), så vel som prøver med AR-V7 mRNA-nivåer i Q1, Q2, og Q3, ved å bruke N-20-antistoff. 22Rv1 celleekstrakt tjente som positiv kontroll for ARfl og ~80 kDa AR varianter og en primær prostatakreft prøve (P) tjente som negativ kontroll for AR varianter.
Uttrykk for AR-V7 og AR- V567es mRNA er assosiert med dårlig prognose
De AR-V1, AR-V7, og ARfl mRNA nivåer ble korrelerte i alle undersøkte prøvene (data ikke vist,
n
= 66) og i undergruppen av CRPC benmetastaser (AR-V1 vs. AR-V7;
Rs
= 0,91,
P
0.001, AR-V1 vs. ARfl;
Rs
= 0,47,
P
0,01, og AR-V7 vs. ARfl;
Rs
= 0,58,
P
0,001,
n
= 30). Benmetastaser med påvisbare AR-V567es mRNA hadde omtrent tre ganger høyere ARfl median mRNA nivå enn de andre CRPC metastaser (
P
= 0,004).
Pasienter med AR-V7 mRNA nivåer i Q4 hadde signifikant kortere cancer-spesifikk overlevelse etter kirurgi metastase enn de andre CRPC pasienter, og et lignende resultat ble sett hos pasienter med påvisbare nivåer av AR-V567es sammenlignet med resten (figur 3A-B). Ti pasienter med skjelettmetastaser ble CRPC enten inkludert i AR-V7 Q4 sub-gruppe og /eller hadde påvisbare nivåer av AR-V567es, og blir ytterligere betegnet som AR-V høye pasienter. De AR-V høye pasientene hadde en median overlevelse etter metastasekirurgi på bare to måneder, sammenlignet med 8 måneder for resten av CRPC pasienter (Figur 3C). Ingen sammenheng ble funnet mellom ARfl eller AR-V1 mRNA nivåer og overlevelse etter metastasekirurgi (data ikke vist).
Pasienter med A) AR-V7 [14] mRNA nivåer i høyeste kvartil (Q4), B ) påvisbare AR-V567es [16] mRNA nivåer, og C) påvises AR-V567 og /eller AR-V7 Q4 (AR-V høy) mRNA nivåer hadde kortere overlevelse enn andre pasienter med CRPC sykdom.
metastaser med høye nivåer av AR spleisevarianter viser intens atom AR farging
som vi tidligere har funnet at høy AR farging score var assosiert med et spesielt kort overlevelse etter metastasekirurgi og nå som AR-V høye pasienter hadde en dårlig prognose, ønsket vi å undersøke om høy AR farging Poengsummen ble assosiert med nivåer av AR-Vs. De AR-V høye metastaser hadde høy AR fargings score sammenlignet med andre CRPC benmetastaser som viste variabel flekker alt fra svak til sterk (tabell 2,
P
= 0,02).
Dess , AR-V høye metastaser viste signifikant lavere PSA farging score (tabell 2,
P
= 0,038) og tendenser til å ha høyere fraksjoner av prolifererende og apoptotisk kreft epitelceller (
P
= 0,12 og
P
= 0,085, henholdsvis) enn andre CRPC metastaser (tabell 2).
uttrykk for AR spleisevarianter er forbundet med forstyrret cellesyklus kontroll
genuttrykket profil undergruppen av AR-V høy benmetastaser ble sammenlignet med profilen til andre CRPC benmetastaser, ved hjelp av en Illumina basert cDNA utvalg inkludert 48803 gener. Om 17 700 prober ble definert til å gi signaler ovenfor bakgrunn i PC benmetastaser. Ett hundre og nittifem (195) prober ble uttrykt forskjellig mellom AR-V høy benmetastaser og andre CRPC benmetastaser ifølge en fold-endring på minst 1,5 i-mellom gruppene (
P
0,05) og ytterligere med i ontology analyse for vurdering av anriket prosesser. Mange (60) av de unike genprodukter ble foreslått direkte å kommunisere via AR, C-MYC, og CDK1 proteiner (figur 4 og tabell S1). C-MYC og CDK1 er to viktige regulatorer av cellesyklus og følgelig topp 5 beriket prosessnettverk funnet i AR-V høy benmetastaser var; Cellesyklus Core, cellesyklus S-fasen, cellesyklus Mitosis, cytoskjelettet spindel mikrotubuli og cellesyklus G2-M. C-MYC og CDK1 er også pro-overlevelse faktorer som hemmer apoptose og i tillegg fant vi økt transkripsjonsnivåer av de anti-apoptotiske proteiner Survivin og BCL2L12 i AR-V høy sammenlignet med de andre CRPC benmetastaser (figur 4). Spesielt, men nivåene av andre viktige regulatorer av apoptose, for eksempel død-reseptorer, BAX, BCL2 og caspaser ble ikke vesentlig endret og, videre, apoptose-relaterte prosessnettverk ble ikke signifikant anriket i våre data (data ikke vist). Flere gentranskriptene er kjent for å være positivt regulert av AR ble funnet i høye konsentrasjoner i de AR-V høyt metastaser, slik som CDK1, CYCLINA2, HSP27, C-MYC, UGT2B17, CDC20, UBE2C, mens andre, så som KLK3 (PSA) , KLK2, NKX3-1, FKBP5 og TMPRSS2 var ikke (figur 4).
Røde sirkler indikerer høyere og blå sirklene indikerer lavere transkripsjonsnivåer i AR-V høy enn i andre CRPC benmetastaser. Legg merke til at mange av de unike genprodukter er direkte samspill via AR, C-MYC og CDK1.
Diskusjoner
Dette notatet beskriver, for første gang, uttrykket mønster av LBD-avkortet AR spleisevarianter AR-V1, AR-V7 [14] og AR-V567es [16] i PC benmetastaser hos pasienter, og dessuten at nivåene av disse variantene er økt i CRPC skjelettmetastaser, og at ekspresjonen av AR -V567es og /eller meget høye nivåer av AR-V7 er funnet i personer med spesielt dårlig prognose.
Flere strukturelt forskjellige, er konstitutivt aktive AR-Vs blitt identifisert hittil i kliniske prøver PC [10], [11], [13], [14], [16], [17], og vi her viser anrikning av LBD-avkortet AR spleisevarianter i PC benmetastaser. I motsetning til Sun og medarbeidere, som fant AR-V567es å være den mest tallrike spleisevariant undersøkt [16], fant vi AR-V7 til å være mer vanlig uttrykk enn AR-V567es i CRPC. Dette misforholdet kan muligens være teknisk forklares med ulik følsomhet av RT-PCR teknikker som brukes, men kan muligens også reflektere hetrogeniteter i AR spleisevariant uttrykk mellom ulike vev opprinnelse som vi undersøkte CRPC i beinet mens Sun et al inkluderte CRPC fra ulike nettsteder. Vi har også viktigere bemerkes at flere av de undersøkte CRPC benmetastaser (AR-V høye tilfeller) uttrykte LBD-avkortet AR proteiner på nivåer sammenlignes med de ARfl protein nivåer, selv om de tilsvarende AR variant transkripsjoner ble funnet ved relativt mye lavere nivåer enn det ARfl mRNA. En post-transcriptional stabilisering av AR spleisevarianter i forhold til ARfl i selektive CRPC skjelettmetastaser er derfor sannsynlig, selv om mekanismen for dette er ikke kjent.
dårlig prognose for pasienter med CRPC metastaser uttrykker AR- V567es og /eller høye nivåer av AR-V7 transkripsjoner er sannsynligvis relatert til den postulerte konstituerende aktivitet av disse variantene. AR-V567es inneholder kjernen lokaliseringssekvensen (NLS) av hengselregionen i exon 4 [16] og AR-V7, i motsetning til AR-V1, har blitt postulert til å inneholde en NLS i sin kryptiske ekson [14]. Følgelig AR-V7 og AR-V567es har vist seg å translocate inn i kjernen, for å binde AR-responsive bestanddeler, og aktiverer /undertrykke gentranskripsjon
in vitro
uten behov for ligandbinding [14], [ ,,,0],16], [17]. Interessant, Watson og medarbeider viste nylig en umiddelbar økning av AR-V7 og AR-V1 mRNA-nivåer i xenograft-modeller for PC etter kastrering, så vel som en reduksjon etter androgen supplementering, hvilket indikerer at noe AR-Vs kan bli direkte regulert av androgener og således sannsynligvis fremkalt hos pasienter kort tid etter kastrering terapi [17]. Det er fristende å spekulere i at de og andre AR-Vs vil bli valgt for også under utviklingen av kastrering-resistent sykdom og dermed bidra til tilbakefall fra terapi tar sikte på å redusere steroidnivåer eller ligand binding til normal AR. Følgelig har vi funnet høyere nivåer av AR spleisevarianter i CRPC enn i HN benmetastaser. De AR-V1 og AR-V7 transkripsjoner ble imidlertid påvist også i en vesentlig del av de ikke-maligne og maligne radikal prostatektomi prøver, men på et lavere nivå enn i skjelettmetastaser, og andre har vist at nivåene av AR-V7 ( AR3) i primær prostatakreft var forutsigbar for utfallet etter radikal prostatektomi, med kortere tid til kjemisk tilbakefall hos personer med høyere nivåer [13], [14]. Årsaken til dette er ikke kjent, men indikerer at konstitutivt aktiv AR-Vs kan være en del av den normale prostata fysiologi og at et utvalg av disse variantene oppstår under PC progresjon.
anriking av strukturelt forskjellige, konstitutivt aktiv AR-Vs under utviklingen av metastaser CRPC påpeker komplekse og heterogene molekylære hendelser som ved forskjell betyr synes å sikre AR aktivering i fravær av testikler androgener. Pasienter uttrykker konstitutivt aktiv AR-Vs vil på lang sikt trolig ikke dra nytte av anti-androgen terapi tar sikte på å redusere steroid syntese, slik som kirurgisk kastrering, LHRH analoger, eller den nylig introduserte agenten abiraterone som hemmer CYP17 og dermed steroid syntese ikke bare i testis, men også i binyrene og i tumorvev [19], [20]. Overraskende er det nye AR antagonist MDV3100 rettet mot den LBD av ARfl og for tiden i kliniske forsøk for CRPC [21], [22], ble funnet å hemme kastrering-resistente vekst indusert ved ekspresjon av konstitutiv AR-V7 i en dyremodell for PC [17]. Dette er oppmuntrende som roman AR antagonister hemme reseptor trans inn i kjernen og dermed kan ha terapeutiske effekter også hos pasienter uttrykker konstitutivt aktiv AR-Vs. Ikke alle CRPC pasienter har imidlertid svare til abirateron og MDV3100 narkotika, og selv de som senere tilbakefall i løpet av få måneder [20], [22]. Hvis denne typen terapi motstand er knyttet til uttrykk for konstitutivt aktiv AR-Vs i skjelettmetastaser (det primære målet for terapi) er foreløpig ikke kjent og kan ikke fastsettes før kliniske studier begynner å ta biopsi fra benmetastaser. Videre er terapeutiske midler som inhiberer de AR-Vs eller deres nedstrømseffekter må utvikles [23], [24]. En annen mulig forklaring for resistens mot kastrering terapi er tilstedeværelsen av AR negative tumorceller, og således AR by-pass i løpet av tumorprogresjon [25]. Fullstendig mangel på AR uttrykk finnes bare i en liten sub-populasjon av CRPC benmetastaser, men AR negative kreftceller spredt mellom positive finnes i de fleste CRPC benmetastaser [3], og dermed vekt behovet også for terapi ikke bare stole på en funksjonell AR.
i de kliniske undersøkte prøvene i denne studien, påvisbare nivåer av AR-V567es og /eller høye nivåer av AR-V7 transkripsjoner ble assosiert med deregulerte nivåer av kjente AR-kontrollerte gener , men spesielt ikke av noen klassiske androgen regulert gener som KLK3 (PSA), TMPRSS2, og FKBP5 som ble forårsaket av over-uttrykk for AR-V7 eller AR-V567es i LNCaP celler
in vitro product: [14] [16]. Følgelig AR-V høye tilfeller viste mindre PSA farging enn andre CRPC metastaser. I stedet har vi funnet genet transkripsjonsnivåer som differensiert AR-V høy skjelettmetastaser fra andre CRPC benmetastaser ved å indikere høy C-MYC og CDK1 aktivitet, og en forstyrret cellesykluskontroll om G1-S samt G2-M overgang til tross for en ikke- betydelig økning i Ki67 merking. Utviklingen av CRPC har vært preget av en ubalansert proliferasjon til apoptose grad og motstand mot apoptotiske stimuli [26], [27]. På slutten stadium av sykdommen undersøkt i denne studien gjorde vi imidlertid ikke, med noen få unntak, finne noen klare tegn til endret uttrykk for apoptose regulerende gener eller en ytterligere deregulering av apoptotiske prosessen i AR-V høy sammenlignet med andre CRPC benmetastaser. Basert på våre data, er vi ikke i stand til å diskriminere hvis forstyrret cellesykluskontroll funnet i AR-V høy benmetastaser er virkelig relatert til uttrykk av AR-Vs, den ARfl, eller bare forbundet med spesielt avansert sykdom i de CRPC tilfeller.
