Abstract
androgen reseptor (AR) er den viktigste terapeutiske målet i prostatakreft. For de siste 70 årene har androgen deprivasjon terapi (ADT) vært den store terapeutiske fokus. Men noen pasienter ikke nytte, og de svulster som i utgangspunktet reagerer på ADT slutt fremgang. En nylig beskrevet mekanisme av en slik effekt er vekst og overlevelsesfremmende virkninger av AR som utøves uavhengig av AR ligander, testosteron og dihydrotestosteron. Men spesifikke ligand-uavhengig AR målgener som står for denne effekten var ikke godt karakterisert. Vi viser her at
c-myc, etter noe som er en viktig formidler av prostatakreft vekst ligand-uavhengig, er en viktig ligand-uavhengig AR target genet. Ved hjelp av microarray analyse, fant vi at
c-myc Hotell og AR uttrykk nivåer sterkt korrelert med hverandre i svulster fra pasienter med kastrering resistent prostatakreft (CRPC) utvikler seg til tross for ADT. Vi bekreftet at AR direkte regulerer
c-myc
transkripsjon i en ligand-uavhengig måte, at
AR Hotell og
c-myc
undertrykkelse reduserer ligand-uavhengig prostatakreft cellevekst og at ektopisk ekspresjon av c-myc demper den anti-vekstvirkningene av AR undertrykkelse. Viktigere, behandling med bromodomain inhibitor JQ1 trykt c-myc funksjon og undertrykte ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse. . Våre resultater definere en ny kobling mellom to viktige proteiner i prostatakreft – AR og c-myc – og demonstrere potensialet i AR og c-myc-rettet terapi for å forbedre prostatakreft kontroll
Citation: Gao L, Schwartzman J, Gibbs A, Lisac R, Kleinschmidt R, Wilmot B, et al. (2013) androgen Receptor Fremmer ligand-uavhengig prostatakreft Progresjon gjennom c-myc Oppregulering. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10,1371 /journal.pone.0063563
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: Oktober 30, 2012; Godkjent: 02.04.2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne publikasjonen ble gjort mulig med støtte fra Oregon klinisk og translasjonell Research Institute, gir antall KL2 RR024141 fra Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences av National Institutes of Health (JA). Dette arbeidet ble også støttet av Pacific Northwest Prostate Cancer SPORE /National Cancer Institute (P50CA097186) (JA, PN, IC), Department of Defense (PC093509) (PSN), en flyvertinne Medical Research Institute Young Clinical Scientist Award (JA ), en Wayne D. Kuni Joan E. Kuni Foundation Kuni Scholar Award (JA), og en Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award (JA). Med spesiell takk til Platt Electric, Bruce Burns, og The Burns Family Fund of Oregon Fellesskapet Foundation for sitt filantropiske støtte til dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn i USA med 241,740 nye tilfeller forutsett dette året [1]. Til tross for screening og tidlig behandling, prostatakreft ofte gjentar seg, er og 28,170 mennesker spådd å dø av prostatakreft i år [1]. Nesten alle disse prostata kreft dødsfall skyldes metastatisk, kastrering resistent prostatakreft (CRPC) som har kommet til tross for androgen deprivasjon terapi (ADT) -. Den vanligste behandlingen for pasienter med tilbakevendende eller avansert prostatakreft
ADT virker ved å redusere nivåene av den potente AR ligander testosteron og dihydrotestosteron (DHT) eller interfererer med binding av androgen-ligander til androgenreseptoren (AR) protein, det viktigste terapeutiske målet i prostatakreft [2]. Til tross for ADT, inkludert nye og mer potente behandlinger, alle prostatacancere til slutt videre [3], [4]. Ved progresjon, er AR overalt uttrykt [5], [6].
Det er flere mulige forklaringer på AR-avhengige mekanismer for progresjon til tross for undertrykkelse eller interferens med androgen ligander. Disse inkluderer intratumoral androgen-syntese, dannelse av konstitutivt aktive AR transkripsjons varianter, AR genamplifikasjon, aktiverende mutasjoner AR, eller aktivering av AR ved vekstfaktorer [7] – [16]. Det er også nå klart at AR protein kan fremme aktivering av AR ligand-uavhengig trasé distinkte fra AR er kanoniske ligand-aktiverte baner i CRPC [17]. Men kritiske nedstrøms AR målgener av denne typen som står for AR avhengige, ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse er ikke fullstendig klarlagt. Studiet av slike AR målgener og mekanismer som AR regulerer deres uttrykk vil forbedre vår forståelse av kastrering-motstand og føre til identifisering av viktige AR avhengige proteiner hvis virksomhet kan styre vekst og overlevelse av CRPC celler. Slike mål og trasé vil naturligvis bli høyt prioritert for legemiddelutvikling.
For å forstå gener som kan forklare at effekten, fokuserte vi på
c-myc
. Dette er fordi: 1)
c-myc
overekspresjon fremmer prostatakreft utvikling [18]; 2)
c-myc
er oppregulert i androgen ligand avhengig prostatakreft og videre oppregulert i CRPC [19], [20]; og 3) tidligere rapporter har vist at c-myc, for eksempel AR, bidrar til ligand-uavhengig prostatacancer-cellevekst [21]. Vår gjennomgang av tidligere data som lokaliserte AR bindingssteder i hele genomet av kromatin immunoprecipitation (chip) viste at AR lokaliserer til en enhancer element i
c-myc
genet [17]. Men det var uklart om
c-myc
var en direkte AR target gen og om androgen ligander var nødvendig for AR regulering av
c-myc
uttrykk.
Vi er fast bestemt at
c-myc
oppregulering i menneskelige CRPC svulster korrelerer med
AR
oppregulering, og vi bekreftet at
c-myc
er en direkte AR target gen ved hjelp av kromatin immunpresipitering (ChIP ) analyser.
c-myc
undertrykkelse oppnår de samme samlede effektene som
AR
undertrykkelse, og
c-myc
overekspresjon demper anti-vekstvirkningene av
AR
undertrykkelse. Mens AR fremmer
c-myc
uttrykk, behandling med androgen ligander økte ikke
c-myc
uttrykk. Dermed fremmer AR uttrykk for
c-myc
i en ligand-uavhengig måte, og
c-myc
er en nøkkel AR målet genet.
Til slutt, vi behandlet prostata kreft celler med BET bromodomain inhibitor JQ1 som undertrykker c-myc uttrykk [22], [23]. Behandling med JQ1 oppnådd samme samlede effekten som
c-myc
RNAi og redusert prostata kreft celle overlevelse i androgen ligand-utarmet forhold.
Våre studier avklare at
c-myc
er en nøkkel androgen ligand-uavhengig AR målgen som bidrar til androgen ligand-uavhengige men AR-avhengig prostata cancer celleoverlevelse. Våre resultater viser også potensialet i AR-rettet terapi eller c-myc-rettet behandling i prostatakreft som supplement til ADT.
Resultater
AR og
c-myc
er Concordantly Uttrykt i metastatisk CRPC
både AR og c-Myc er kritiske overlevelse trasé i prostatakreft, og uttrykk nivåer av både
AR Hotell og
c-myc
er vanligvis økt i menneskelige CRPC svulster som utvikler seg til tross for ADT [24], [25]. Det var imidlertid ukjent om overekspresjon av
AR Hotell og
c-myc
ble koblet med den andre i menneskelige CRPC svulster. Derfor har vi bestemt uttrykket nivåer av
AR Hotell og
c-myc
hjelp genekspresjon mikromatriser i 140 menneskelige CRPC tumorer versus 15 normale prostataprøver. Deretter undersøkte vi sammenslutning av
AR
oppregulering og
c-myc
oppregulering i den menneskelige CRPC svulster.
AR
mRNA nivåer i CRPC prøver ble sterkt assosiert med
c-myc
mRNA nivåer (Pearson korrelasjons = 0,3698, 95% konfidensintervall: 0,2172 til 0,5048, tosidig p-verdi 0,0001 ) (figur 1A). Vi har også beregnet odds ratio for
c-myc Hotell og
AR
oppregulering i disse CRPC prøver. Det var en statistisk signifikant sammenheng med
AR
oppregulering og
c-myc
oppregulering (OR = 3,528, 95% konfidensintervall: 1,347 til 9,240, p-verdi: 0,0108 av Fishers Exact Test) (figur 1B).
A) Z-score (til normal prostata eksemplarer) av
AR
versus
c-myc
mRNA uttrykk over 140 mennesker CRPC metastaser. Pearsons korrelasjonskoeffisient, lineær regresjon, og F-test for vesentlig null skråning ble utført for hvert par av gener. B) Fishers eksakte test og odds ratio på beredskaps bordet analysere Samtidig forekomst av svulster med
AR
eller
c-myc
z-skårer høyere enn 2.
AR Suppression reduserer veksten av AR ligand-avhengige og AR ligand-uavhengig kastrering-resistente prostata kreft celler
Vi trykkes uttrykk for
AR
med RNAi i prostatakreftceller dyrket i trekull-strippet, androgen ligand-utarmet serum.
AR
RNAi redusert cellevekst både androgen ligand-avhengig LNCaP celler og deres CRPC derivater kalt LNCaP-abl (figur 2A). Av notatet, begge disse cellene bare uttrykke full-lengde AR transkripsjon.
AR
undertrykkelse med RNAi i 22RV1 CRPC cellelinje som uttrykker både full-lengde AR og en AR transkripsjon variant oppnådd samme effekt (figur 2A). I alle cellelinjer, AR undertrykkelse redusert cellevekst uten å indusere apoptose (data ikke vist), noe som tyder på en mangel ved spredning. Derfor, til tross androgen ligand utarming,
AR
undertrykkelse ytterligere reduserer prostatakreft cellevekst.
A) LNCaP, abl og 22RV1 celler ble transfektert med 50 nM av ikke-målrettede kontroll (NTC) eller
AR
RNAi oligonukleotider. Celler ble byttet til trekull-strippet serum på dagen for transfeksjon. Cellevekst ble bestemt 5 dager senere for LNCaP og 6 dager senere for abl og CRPC 22RV1 med trypanblått eksklusjon metoden. B) Immun for AR uttrykk. De nedre bånd i den AR immunoblot i 22RV1 celler gjenspeiler tilstedeværelsen av en AR-transkript variant [7]. B) LNCaP, abl og 22RV1 celler ble transfektert med 50 nM av NTC eller
c-myc
RNAi oligonukleotider. Celler ble byttet til trekull-strippet serum på dagen for transfeksjon. Cellevekst ble bestemt 5 dager senere for LNCaP celler og 6 dager senere for abl og 22RV1 med trypanblått eksklusjon metoden. Immunoblot for c-Myc proteinekspresjon. C) LNCaP celler med stabil overekspresjon av tom vektor (EV) eller c-myc ble generert. Disse cellene ble transfektert med 50 nM av ikke-målrettet kontroll (NTC) eller AR siRNA oligonukleotider. Cellevekst ble bestemt 6 dager senere ved hjelp av trypanblått-utelukkelse metode. Immunoblot for AR og c-Myc proteinekspresjon. De høyere band på den c-Myc immunoblot i c-Myc-overekspresjon celler representerer ectopically-uttrykkes c-Myc. * Angir p. 0,05 sammenlignet med NTC
c-myc Suppression rekapitulerer effekten av AR Suppression, og c-myc Overuttrykte Demper Anti-tumor aktivitet av AR Suppression
Å avgjøre om c-myc også påvirket prostatakreft cellevekst uavhengig av androgen ligander, vi undertrykt
c-myc
hjelp RNAi. Som
AR
downregulation,
c-myc
nedreguletrykt ligand-uavhengig vekst av LNCaP, abl, og 22RV1 celler (figur 2B). Videre vi samtidig undertrykt
AR Hotell og
c-myc
med RNAi. Co-undertrykkelse av både proteiner ikke redusere cellevekst mer enn undertrykkelse av enten
AR
eller
c-myc
av seg selv (figur S1).
Vi har også vist at
c-myc
overekspresjon konferert ligand-uavhengig vekst til ligand-avhengig LNCaP cellene formert langsiktig i kastrat forhold, som er konkordant med en tidligere rapport (figur S2) [21]. Neste, vi undertrykt
AR
med RNAi i LNCaP celler som overuttrykker tom vektor eller
c-myc Hotell og kvantifisert cellevekst.
c-myc
overekspresjon var beskyttende mot vekst undertrykkende effekten av
AR
RNAi (figur 2C). Dette viser at
c-myc
minst delvis bidrar til AR effekter på å fremme ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse.
AR men ikke Androgener fremme c-myc Expression
c-myc
onkogen er ofte oppregulert i prostatakreft, og
c-myc
oppregulering fremmer ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse [21]. Men
c-myc
uttrykk på AR hadde ikke etablert avhengigheten av. Følgelig vi undersøkt tidligere utgitt ChIP microarray data som lokaliserte AR hele genomet til androgen ligand-avhengig LNCaP celler og deres Abl CRPC derivater [17]. AR ble rapportert å være bundet til en enhancer element i
c-Myc
genet i begge disse cellelinjer. Derfor vi neste brukte chip for å bekrefte disse resultatene.
Først vokste vi celler i kull-strippet, androgen ligand-utarmet serum og bestemmes effekten av behandling med androgen ligand R1881 på AR belegg og histon acetylering, et tegn på aktiv transkripsjon, på
c-myc
enhancer element ved hjelp av chip. Vi målte også effekten av R1881 behandling på godt beskrevet, ligand-aktiverte genet
KLK3
. AR og høye nivåer av histone acetylering var til stede på
c-myc
Enhancer selv når cellene ble dyrket i ligand-utarmet serum (figur 3A). Videre fikk tillegg av R1881 til kultur ikke forbedre AR belegg eller histone acetylering på
c-myc plakater (figur 3A). Dette i motsetning til effekten av R1881 på
KLK3
genet enhancer- økt berikelse av AR og histon acetylering (figur 3A).
LNCaP, abl, og 22RV1 celler ble dyrket i kull-strippet serum i 72 timer og deretter behandlet med 10 nM R1881 (eller etanol kjøretøy) i 4 timer. A) Chromatin immunoprecipitation ble utført for å bestemme berikelse av AR og histon H3 acetylering (AcH3) på
c-myc Hotell og
KLK3
forsterkerelementer. B) QRT-PCR ble utført for å bestemme mRNA nivåer av
KLK3 Hotell og
c-myc
forhold til aktin. C) Immunoblotting ble utført for å bestemme protein nivåer av AR, c-Myc, og aktin. * Betyr p 0,05 sammenlignet med kjøretøy
neste fastsatte effekten av R1881 behandling på uttrykk for
c-myc
eller
KLK3
.. R1881 behandling økt
KLK3
uttrykk (Figur 3B). Imidlertid gjorde R1881 behandling ikke øke
c-myc
uttrykk. Figur 3B, C).
Deretter behandlet vi prostata kreft celler med MDV3100, en potent, ny androgen antagonist [26]. MDV3100 behandling trykkes uttrykk for
KLK3
men ikke påvirke uttrykk for
c-myc
. (Figur S3). Disse resultatene støtter videre tanken om at androgen ligander ikke fremme uttrykk for
c-myc
.
For å finne ut om AR var i stand til å regulere
c-myc
i en ligand-uavhengig måte, brukte vi RNAi å undertrykke uttrykket av
AR Hotell og målt
c-myc
uttrykk. RNAi-formidlet hemming av
AR
redusert c-myc mRNA og protein ekspresjon (figur 4A, B). Vi utførte chip analyser og bekreftet at
AR
RNAi redusert AR og histone acetylering fra
c-myc
forsterker (Figur 4C). Dette var mest betydningsfulle i 22RV1 cellelinje, selv om sterke trender ble også sett i LNCaP og Abl celler. Dermed
c-myc
er en direkte AR mål genet, og
AR
RNAi undertrykker
c-myc
uttrykk i det minste delvis gjennom nedbryting av AR og histone acetylering fra
c-myc
forsterker. Vi har også overexpressed AR i M12 prostatakreft cellelinje som normalt ikke uttrykke AR. AR overekspresjon økt c-myc mRNA og protein uttrykk (figur S4). Dette underbygger at AR aktiveres videre
c-myc
uttrykk i en ligand-uavhengig måte.
LNCaP, abl og 22RV1 celler ble transfektert med 50 nM av ikke-målrettede kontroll (NTC) eller AR RNAi oligonukleotider. Cellene ble deretter dyrket i trekull-strippet serum i 96 timer. Ved slutten av behandlingen, ble cellene høstet for å ekstrahere mRNA og protein. A) QRT-PCR ble utført for å bestemme nivåene av
c-Myc
i forhold til
aktin
. B) Immunoblotting ble utført for å bestemme nivået av AR, c-Myc og aktin. C) Parallelle behandlinger ble utført og cellene ble kryssbundet og behandlet for prosessoren til å bestemme AR og histon H3 acetylering (AcH3) berikelse på
c-myc
forsterker. * Betyr p 0,05 sammenlignet med NTC
AR Suppression rekapitulerer effekten av c-myc Suppression
Vi neste fastslått om RNAi-mediert hemming av
AR
. rekapitulert effekten av RNAi-mediert undertrykkelse av
c-myc
på ekspresjon av vel beskrevne
c-myc
målgener (figur 5) [27], [28]. Begge
c-myc
RNAi og
AR RNAi
redusert uttrykk for
c-myc
-aktivert genet
E2F1
; omvendt,
c-myc Hotell og
AR
RNAi både økt uttrykk for
c-myc
-repressed genet
CDKN1A plakater (figur 5). Nye rapporter viser at mitotiske gener, inkludert
KIF11
,
AURKB
, og
TPX2
, er viktige c-myc målgener [29] – [31].
AR
RNAi rekapitulert effekten av c
-Myc
RNAi og også redusert uttrykk av disse genene (Figur 5). Dette viser at AR undertrykkelse forstyrrer c-myc funksjon og uttrykk for veletablerte c-myc målgener.
LNCaP og abl celler ble transfektert med 50 nM av ikke-målrettede kontroll (NTC) og enten A)
AR
eller B)
c-myc
RNAi oligonukleotider. Celler ble byttet til trekull-strippet serum på dagen for transfeksjon og høstet 96 timer senere. QRT-PCR ble utført for å bestemme nivåene av de angitte
c-myc
målgener i forhold til
aktin
. * Betyr p 0,05 sammenlignet med NTC
BET Bromodomain Inhibitor JQ1 Undertrykker c-myc Funksjon og Reduserer AR ligand-uavhengig Prostate Cancer Cell Survival
Våre resultater viser at
c-myc
er en viktig AR målet genet men at
c-myc
«s uttrykk er ikke aktivert av androgene ligander. Foreløpig terapi for å undertrykke AR uttrykk er ikke tilgjengelig ennå. Men nyere arbeider viser at en BET bromodomain hemmer kalt JQ1 undertrykker c-myc uttrykk og c-myc funksjon fordi
c-myc
er en bromodomain target gen [22], [23]. Derfor, vi behandlet prostata kreft celler med JQ1. JQ1 behandling redusert mRNA og proteinnivåer av c-Myc (figur 6A, B) og undertrykket c-Myc funksjon som målt ved hjelp av c-myc-genekspresjon target (figur 6B). Til slutt, som
c-Myc
RNAi, JQ1 behandling med nanomolare konsentrasjoner redusert ligand-uavhengig prostatacancer celleoverlevelse (figur 6C).
LNCaP, abl, og 22RV1 celler ble dyrket i charcoal- strippet serum og behandlet med bærer, 50 nM, 250 nM eller 500 nM JQ1 hver 24. time i 72 timer. A) Immunoblotting ble utført for å bestemme protein nivåene av c-Myc. B) QRT-PCR ble utført for å bestemme mRNA nivået av
c-myc Hotell og c-myc rettet gener
KIF11, CDKN1A, TPX2
, og
AURKB
forhold til
aktin
. * Betyr p 0,05 sammenlignet med kjøretøy. C) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved slutten av behandlingen med trypan blå eksklusjon metode. p. 0,01 for 250 nM og 500 nM doser kontra kjøretøy i alle tre cellelinjene
Diskusjoner
Det er godt forstått at AR er en kritisk driver av prostata kreft celle overlevelse og at AR står for progresjon til dødelig CRPC til tross for behandling med ADT [24]. I mange tilfeller androgener vedvarer intracellulært innenfor CRPC tumorer til tross for kastrering serumnivåer av androgener [24], [32]. Imidlertid har androgen ligand-uavhengige men AR-avhengige mekanismer som også fremmer overlevelse av CRPC celler er rapportert. Disse inkluderer aktivering av AR ved IL-6, AR genamplifikasjon, og AR transkripsjons varianter som mangler androgen ligandbindende domene [7] – [9], [15]. Alle disse mekanismene kan bidra til prostatakreft progresjon tross ADT siden ingen er direkte målrettet av ADT.
Nylig ble det vist at AR protein fremmer uttrykk av et gen program skiller seg fra sin kanoniske androgen ligand styrt mål i CRPC celler [17]. Et slikt eksempel er den AR målgenet
UBE2C
som fremmer ligand-uavhengig prostatacancer spredning [17]. Hvilke av de andre AR-indusert genprodukter er kritisk for ligand-uavhengig prostatacancer celleoverlevelse har vært uklar. Vårt arbeid viser at
c-myc
onkogen er slik en ligand-uavhengig AR målet genet.
c-myc
er ofte oppregulert i prostatakreft, og
c-myc
overekspresjon forvandler normale prostata epitelceller i genmanipulerte musemodeller av prostatakreft og overfører ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse, men avhengigheten av
c-myc
uttrykk på AR var uklart [18], [20], [21], [33]. Vi viser her at
AR Hotell og
c-myc
blir ofte oppregulert i CRPC, og vi bekreftet at
AR Hotell og
c-myc
oppregulering sterkt korrelert med hverandre i en stor serie av metastatiske CRPC pasient tumorer (figur 1).
Vi har bekreftet at
AR
undertrykkelse fører til tap av c-myc uttrykk i prostatakreftcellelinjer som uttrykker fullt -Lengde AR (LNCaP og Abl) og i en annen CRPC cellelinje 22RV1 som uttrykker både full-lengde AR og en AR transkripsjon variant. Selv om vi ikke kan utelukke en rolle for AR transkripsjon variant også fremme
c-myc
uttrykk, våre resultater med AR RNAi i LNCaP og Abl og våre resultater med AR overekspresjon i M12 celler viser at full-lengde AR er stand til å aktivere
c-myc
uttrykk (Figur 4, Figur S4).
Som
AR
RNAi,
c-myc
RNAi redusert prostatakreft celle overlevelse i androgen ligand-utarmet forhold mens co-undertrykkelse av
AR Hotell og
c-myc
var ikke mer effektiv enn undertrykkelse av enten protein alene (Figur 2, Figur S1).
c-myc
overekspresjon overfører ligand-uavhengig overleve prostata kreft celler (figur S2), som samsvarer med en tidligere rapport [21]. Vi viste også at
c-myc
overekspresjon dempes anti-tumor aktivitet av
AR
undertrykkelse med RNAi (figur 2C). Således, c-Myc bidrar til AR største virkninger på å fremme ligand-uavhengig prostatacancer celleoverlevelse.
Til tross for det faktum at AR fremmer ekspresjon av
c-Myc
, behandling med androgen ligand ikke økte
c-myc
uttrykk (figur 3). I tillegg behandling med androgen ligander ikke forbedre AR belegg på
c-myc
forsterker (figur 3). Dette i motsetning til effekten av androgen stimulering på uttrykk for
KLK3
genet, en godt beskrevet androgen-aktivert genet, og AR belegg på
KLK3
forsterker (figur 3). For ytterligere å bekrefte at AR fremmer uttrykk for
c-myc
i en ligand-uavhengig måte, behandlet vi prostata kreft celler med nye, potent androgen antagonist MDV3100 [26]. Behandling med MDV3100 i en fersk randomisert, placebokontrollert klinisk fase III studie forbedret total overlevelse av pasienter med CRPC [34]. Men i noen pasienter er det ingen tumorrespons, og ved progresjon AR forblir i kjernen [3], [6], [34]. Mens MDV3100 behandling redusert uttrykk for
KLK3
, MDV3100 behandling hadde ingen effekt på
c-myc
uttrykk (Figur S3). Disse dataene støtter videre oppfatningen at AR fremmer
c-myc
uttrykk i en ligand-uavhengig måte.
c-Myc
er en kritisk faktor i ligand-uavhengig prostatacancer progresjon (figur 2, figur S2) [21]. Derfor, i fremtiden, vil det være viktig å måle
c-myc
uttrykk og funksjon i CRPC pasientsvulster utvikler seg til tross for mer komplett androgen interferens med medikamenter som MDV3100.
På grunn av viktig av
c-myc
som en nedstrøms bidragsyter til AR effekter på ligand-uavhengig prostatakreft celleoverlevelse, behandlet vi prostata kreft celler med BET bromodomain inhibitor JQ1, et stoff som er kjent for å undertrykke uttrykk for bromodomain målgener; fremst blant disse var
c-myc product: [22], [23]. I tidligere studier, JQ1 behandling in vitro og in vivo trykt c-myc uttrykk og funksjon og undertrykte tumorvekst uten vesentlig toksisitet [22], [23].
Vi har bekreftet at JQ1 behandling av prostatakreftceller ved hjelp nanomolar konsentrasjoner oppnådd de samme samlede effekter som RNAi-formidlet hemming av
c-Myc
– c-myc mRNA og protein uttømming, undertrykkelse av c-myc-funksjon, og undertrykkelse av ligand-uavhengig prostatacancer celleoverlevelse (Figur 6 ). I lys av involvering av
c-myc
i kritiske fysiologiske prosesser, rettet mot c-myc protein generelt i flere celletyper gjennom langsiktig forvaltning kan være uønsket [35], [36]. Kliniske forsøk vil være nødvendig for å bestemme sikkerheten av bromodomain inhibering. Men resultatene hittil, inkludert våre egne, tyder på at dette er et lovende anti-tumor-strategi for behandling av CRPC (figur 6) [22], [23].
Til slutt, for at AR kontrollene uttrykk for sine mål gener som
c-myc
i en vev bestemt måte antyder at den ideelle middel for undertrykkelse av
c-myc
uttrykk i prostatakreftceller spesifikt vil målrette AR, selv. Faktisk våre studier klargjøre at androgen ligand-uavhengige men AR-avhengig
c-myc-genet
oppregulering er en mekanisme ved hjelp av hvilken AR-protein fremmer ligand-uavhengig overlevelse av prostatakreftceller. Våre studier støtter verdighet i arbeidet med å undertrykke AR er ligand-uavhengig funksjon og uttrykk av viktige ligand-uavhengig AR målgener som
c-myc plakater (figur 7). Legemidler som kan undertrykke AR uttrykk er først nå begynner å gå inn testing. Disse stoffene omfatter selektive AR degraders og AR anti-sense oligonukleotider [37] – [40]. Vi avvente resultatene fra disse kliniske studier for å vurdere sikkerhet, spesifisitet, og effekten av disse midlene hos menn med prostatakreft.
Foreløpig androgen deprivasjon terapi som forstyrrer androgen ligandaktivering av AR er primært brukt til behandling av denne sykdommen. Disse behandlingene undertrykke AR sin androgen ligand avhengig funksjon og undertrykke uttrykk for androgen ligand-avhengig (AD) AR målgener. Men til tross for disse behandlingene prostata kreft progresjon er uunngåelig. AR fremmer også uttrykk for androgen ligand-uavhengig trasé som
c-myc
.
c-myc
genet er ofte oppregulert i prostata kreft og bidrar til androgen ligand-uavhengig prostatakreft progresjon. Denne modellen tyder på at AR eller c-myc-rettet terapi vil utfylle dagens androgen deprivasjon strategier.
Metoder
Cell Culture
LNCaP og 22RV1 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i 10% trekull-strippet føtalt bovint serum for alle forsøk. Abl celler, en CRPC derivat av LNCaP, var en slags gave fra Zoran Culig, PhD og ble dyrket i RPMI med 10% trekull-strippet føtalt bovint serum. M12 prostata kreft celler uttrykker tom vektor eller AR var en slags gave fra Stephen R. Plymate, PhD, og dyrket som beskrevet tidligere [9].
For RNAi eksperimenter, LNCaP og abl celler ble transfektert med RNAi oligonukleotider (
AR
: 5′-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 «, og
c-Myc
: 5′-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3′) ved hjelp av DharmaFECT 3 (Dharmacon) transfeksjon reagens for en endelig konsentrasjon på 50 nM [41]. 22RV1-celler ble transfektert med siRNA oligonukleotider ved hjelp av Lipofectamine2000 (Life Technologies) transfeksjon reagens for en endelig konsentrasjon på 50 nM. Celler ble høstet ved angitte tidspunkter etter transfeksjon.
R1881 (Sigma) ble resuspendert i 100% etanol. MDV3100 ble kjøpt (Selleckchem) og resuspendert i DMSO. JQ1 ble innkjøpt fra Sigma og resuspendert i DMSO. Cellevekst ble bestemt ved slutten av behandlingen med trypanblått eksklusjon metoden (Life Technologies) etter produsentens instruksjoner. Alle cellekultur eksperimenter ble utført med biologiske triplikate prøver og bekreftet i gjentatte forsøk.
LNCaP-celler med stabil overekspresjon av c-myc eller tom vektor ble samlet ved å transfektere LNCaP-celler med pcDNA-DEST40-
c- myc product: (vennlig levert av Rosalie Sears, PhD) eller pCMV6-AN-His (Origene) og velge med G418.
Colony-formasjon analysen
200000 LNCaP celler med stabil overekspresjon av tom vektor (EV) eller
c-myc
ble sådd ut i 10 cm retter. RPMI med 10% trekull-strippet føtalt bovint serum supplert med 300 ug /ml G418 og 10 pg /ml bikalutamid behandling ble tilsatt til cellene annenhver dag i 14 dager. Deretter ble cellene fiksert med 4% formaldehyd og farget med syto60 (Invitrogen). Bilder ble tatt med Licor Odyssey avbildningssystem.
Immunoblotting
immunblotting eksperimenter ble utført som beskrevet tidligere [42]. Endelige bilder ble oppnådd med Licor Odyssey imaging system. Primære antistoffer ble brukt var: AR (N-20, Santa Cruz); aktin (Sigma) og c-Myc (Epitomics). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Licor.
QRT-PCR
RNA ble ekstrahert fra celle pellets lagret i RNAlater reagens (Life Technologies) med en MagMAX Total RNA Isolation Kit (Life Technologies) eller Trizol ( Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop). 250 ng-1 ug RNA (normalisert for hvert forsøk) ble revers-transkribert ved hjelp av en High-Capacity cDNA revers transkripsjon kit (Life Technologies) med tilfeldige primere. Realtime (QRT) -PCR ble utført ved anvendelse av en 7500 Fast termo (Life Technologies) med følgende sykkel program: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 sek dissosiasjon, 60 ° C i 1 min avspenning /påbygg /lese. 10 mL singleplex rtPCR reaksjoner inneholdt 1X Taqman universell standard Mastermix, 1X Taqman hydrolyse sonde, og 10 ng RNA-ekvivalent cDNA mal. Humane beta-aktin (# 4326315E) ble anvendt som en endogen kontroll. Primer informasjon er inkludert i tabell S1.
