Abstract
Fork-head box protein A1 (FOXA1) er en «pioner factor» som er kjent for å binde seg til androgen reseptor (AR) og regulere transkripsjon av AR-spesifikke gener. Men den nøyaktige rolle av FOXA1 i prostatakreft (PC) er fortsatt ukjent. I denne studien rapporterer vi at FOXA1 spiller en avgjørende rolle i PC celleproliferasjon. Ekspresjonen av FOXA1 var høyere hos PC enn i normalt vev prostata (P = 0,0002), og, ved hjelp av immunhistokjemisk analyse, har vi funnet at FOXA1 ble lokalisert i kjernen. FOXA1 uttrykk nivåer var signifikant korrelert med både Ptil og Gleason score (P = 0,016 og p = 0,031, henholdsvis). Videre FOXA1 oppregulering var en betydelig faktor i PSA svikt (P = 0,011). Nedbryting av FOXA1 i en prostatakreft cellelinje (LNCaP) ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) betydelig hemmet AR aktivitet, førte til cellevekst undertrykkelse, og indusert G0 /G1 arrest. Den anti-proliferative effekt av FOXA1 siRNA ble formidlet via insulinlignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3). En økning i IGFBP-3, mediert ved uttømming av FOXA1, hemmet fosforylering av MAPK og Akt, og økt ekspresjon av cellesyklus regulatorer p21 og p27. Vi fant også at anti-proliferativ effekt av FOXA1 uttømming ble betydelig reversert ved samtidig siRNA uttømming av IGFBP-3. Disse funnene gir direkte fysiologiske og molekylære bevis for en rolle FOXA1 i å kontrollere cellevekst gjennom regulering av IGFBP-tre uttrykk i PC
Citation. Imamura Y, Sakamoto S, Endo T, Utsumi T, Fuse M , Suyama T, et al. (2012) FOXA1 Fremmer tumorprogresjon hos Prostate Cancer via Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 Pathway. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10,1371 /journal.pone.0042456
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 27 mars 2012; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Imamura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend-i-aid fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan (nr. 20390420, nr. 22791469). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC), den vanligste kreft hos menn, er en nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i de fleste vestlige land, og blir stadig mer vanlig i asiatiske land så vel [1]. Hormonet androgen og androgen reseptor (AR) er viktig for normal vekst, differensiering og vedlikehold av prostatakjertelen, og de spiller også en viktig rolle i utviklingen av PC [2]. Følgelig oppnås behandling av avansert PC innebærer å blokkere produksjonen av androgener eller antagonisere AR og dets målgener [1]. Men tilbakefall PC etter oppkjøpet av kastrering motstand. En fersk studie viste at et lavt nivå av intra-tumor androgen i løpet androgen ablasjon terapi fortsetter å aktivere AR, noe som fører til ytterligere progresjon av PC til metastase [3]. Derfor, selv på et avansert stadium av PC, er viktig for behandlingen av PC regulering av AR aktivitet.
Basert på en tidligere microarray analyse der vi sammenlignet genuttrykket av benign prostata hyperplasi (BPH) og PC, vi identifisert Fork-head box protein A1 (FOXA1) som et gen hvis uttrykk er vesentlig oppregulert i PC [4]. FOXA1 er en transkripsjonsfaktor som hører til det humane gaffelhodeboksen genfamilien, og FOXA1 er involvert i endodermal organogenese, metabolisme og homeostase [5]. FOXA1 bindes direkte til AR og regulerer transkripsjonen av prostata-spesifikke gener [6]. FOXA1 fungerer også som en «pioner faktor» for AR på nettstedene til transkripsjonsregulering [7], [8]. Dermed binding av FOXA1 til modifisert histone knyttet til aktiv kromatin forenkler påfølgende rekruttering av kjernereseptorer og transcriptional aktivering [7], [8]. Flere linjer av bevis har knyttet FOXA1 med prostata utvikling. Epitel FOXA1 uttrykk har blitt observert i alle faser av utvikling og differensiering av musen prostata [6], [9]. Den FOXA1-defecient mus viste tap av prostata morfogenese og differensiering [9], [10]. FOXA1 bidrar også til østrogen signalering i brystkreft, og har vært forbundet med luminal subtype og god prognose [11], [12]. Økt FOXA1 uttrykk har også blitt observert i tykktarm, lunge, skjoldbruskkjertelen, spiserørskreft og prostatakreft [13] -. [15]
Selv om FOXA1 forbundet med prostata utvikling og androgen regulering, den nøyaktige mekanismen hvordan FOXA1 bidra til PC progresjon, spesielt regulering av FOXA1 avhengige målgener i PC forbli relativt uidentifisert.
Denne studien undersøkte rollen FOXA1 i PC progresjon. Vi identifiserte insulin-like growth factor bindende protein 3 (IGFBP-3) som en roman mål av FOXA1 for regulering av celleproliferasjon i PC-celler.
Resultater
uttrykk for FOXA1 i prostata kreft Vev og dens korrelasjon med kliniske faktorer
Vi undersøkte protein uttrykk for FOXA1 i PC ved immunhistokjemisk analyse (IHC) av PC-prøver. Representative IHC Resultatene av FOXA1 protein ekspresjon i normalt tilstøtende til tumor (NAT) og i PC vev er vist i figur 1A og B. Positiv FOXA1 immunoreaktivitet ble påvist i kjernen og delvis av cytoplasma. En sterk FOXA1 immunoreaksjon ble påvist i kjernen av cellene i kreft lesjon, mens cellene i NAT viste svak farging hovedsakelig på cytoplasma. IHC score til FOXA1 farging av NAT og PC-lesjoner varierte 30,2 til 123,0 (median, 73,3) og 20,4 til 260,1 (median, 125,1), henholdsvis. IHC score til FOXA1 farging av PC lesjoner var betydelig høyere enn de av NAT (figur 1C, P = 0,0002). Ved IHC score, var 62% av PC-prøver positive for FOXA1, mens resterende 38% av prøvene var negative. Sammenhenger mellom clinicopathological karakteristikkene av pasienter med PC og status for FOXA1 protein uttrykk ved hjelp av IHC scoring system er vist i tabell 1. Disse data viste at FOXA1-positive PCer ble korrelert med PSA-verdi (P = 0,016), Gleason stillingen av PC (P = 0,031) og ekspresjonen av AR (P = 0,002) (tabell 1). PC-er som var positive for både FOXA1 og AR hadde betydelig høyere Gleason score enn PCer som var både FOXA1- og AR-negative (P = 0,027) (tabell 2).
protein uttrykk for FOXA1 i representative normal tilstøtende til tumor (NAT) vev (A) og PC vev (B), som analysert ved hjelp av IHC er vist. NAT vises lav FOXA1 protein uttrykk. FOXA1-positiv farging ble observert i tilfeller av PC. Positive FOXA1 farging ble påvist i kjernen. Original forstørrelse, × 400. (C) Kvantifisering av FOXA1 farging av NAT og PC-vev. De FOXA1 IHC Stillingen ble beregnet som følger: IHC poengsum = 1 x (antall svakt fargede celler i felten) + 2 x (antall moderat fargede celler i felten) + 3 x (antall intenst fargede celler i feltet) . De FOXA1 IHC score for normal prostata vev og for PCer varierte 30,2 til 123,0 (median, 73,3) og fra 20,4 til 260,1 (median, 125,1), henholdsvis. Oppregulert FOXA1 uttrykk (D) ble signifikant assosiert med PSA svikt (P = 0,011), men oppregulert AR uttrykk (E) var ikke (P = 0,4457). Logg rang statistikk ble brukt til å teste forskjellen i overlevelse ganger mellom gruppene. FOXA1 (+), oppregulert FOXA1; FOXA1 (-), nedregulert FOXA1. AR (+), oppregulert AR; AR (-), nedregulert AR. ** Indikerer en statistisk forskjell på P . 0,01
Survival analyse ved hjelp av Kaplan-Meier metoden viste at FOXA1 oppregulering var en betydelig faktor i PSA svikt (figur 1D log-rank test, P = 0,011) sammenlignet med AR oppregulering (figur 1E, log-rank test, P = 0,4457). Ptil feil overlevelse saker med oppregulert og nedregulert FOXA1 var 50,7 og 87,7%, henholdsvis. Ptil feil overlevelse i tilfeller med oppregulert og nedregulert AR var 58,5 og 73,8%, henholdsvis.
Evaluering av FOXA1 Protein Expression i PC-avledet cellelinjer
Vi neste undersøkt FOXA1 mRNA og protein ekspresjon i PC ved kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR-analyse) og Western blotting henholdsvis av fire PC-avledede cellelinjer, inkludert androgen uavhengig cellelinje (PC-3 og DU145), androgen sensitive celle linje (LNCaP), androgen ufølsom cellelinje (c4-2) etablert fra kastrerte rekke LNCaP og ikke-tumorigen prostata cellelinje (RWPE-1) [16] – [19] (figur 2A). Molekylvekten til FOXA1 ved Western-blotting ble 49 kDa. Både FOXA1 mRNA og protein ekspresjon var signifikant høyere i androgen-sensitive LNCaP-celler og c4-2 celler enn i de andre cellelinjer.
(A) mRNA-ekspresjon og protein ekspresjon av FOXA1 i fire PC- avledet cellelinjer (PC-3, DU-145, LNCaP, c4-2) og i ikke-tumorigent prostatacellelinje (RWPE-1) ble analysert ved hjelp QRT-PCR og Western blotting, henholdsvis. (B) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3). Etter 48 timers transfeksjon, ble RNA ekstrahert og FOXA1 mRNA ble analysert ved hjelp av QRT-PCR-analyse. FOXA1 mRNA-ekspresjon er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. Proteiner ble ekstrahert 72 timer etter transfeksjon og FOXA1 og GAPDH-protein-ekspresjon ble undersøkt ved Western blot-analyser. (C, D) LNCaP-celler ble transfektert med den pGL3-PSAP 5,8 luciferase reporter-plasmid og med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas. (# 1-3) og ble deretter dyrket i fenolrødt-fritt RPMI-1640 medium inneholdende 5% CS-FBS. (C) Etter 72 timer transfeksjon ble luciferase aktiviteter målt med Dual-luciferase reporter analysen system. Luciferase-aktiviteter er uttrykt i forhold til kontrollen, som ble gitt en verdi på 1. Proteiner ble ekstrahert 72 timer etter transfeksjon og ekspresjon av AR og GAPDH ble undersøkt ved western blot-analyse. (D) De transfekterte celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av dihydrotestosteron i 72 timer og luciferase-aktivitet ble målt som i (C). (E, F) Ikke-transfekterte LNCaP-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av dihydrotestosteron (E) eller bikalutamid (F) i 48 timer og FOXA1 mRNA ekspresjon ble deretter analysert ved anvendelse av QRT-PCR. FOXA1 mRNA-ekspresjon er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. Verdier er gjennomsnitt ± SD fra minst 3 uavhengige forsøk, hvert utført in triplo. * Og ** indikerer statistisk forskjell på P 0,05 og P . 0,01, henholdsvis
For å få cellene der FOXA1 uttrykk ble midlertidig slått ned, transfektert vi LNCaP celler med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3) plasmider eller med en negativ kontroll siRNA (nega) plasmid. Vi deretter analysert FOXA1 mRNA og protein uttrykk i disse siFOXA1-transfekterte celler ved hjelp av QRT-PCR og Western blot analyser, henholdsvis. SiFOXA1-transfekterte celler viser reduksjon av FOXA1 mRNA-nivået med nesten 90% sammenlignet med den i Nega-transfekterte celler (Nega). FOXA1 protein nivåer i siFOXA1-transfekterte celler ble også sterkt redusert sammenlignet med Nega-transfekterte celler (figur 2B).
Effekten av FOXA1 på androgen reseptor aktivitet og effekten av AR Activation på FOXA1 Expression
for å bestemme effekten av FOXA1 knockdown på AR aktivitet, transfektert vi siFOXA1-transfektert LNCaP celler med en luciferaseekspresjon plasmid drevet av prostataspesifikt antigen (PSA) promoter, pGL3PSAp-5.8. Selv om det ikke var noen forskjell i protein ekspresjon av AR i siFOXA1-transfekterte celler eller i Nega-transfekterte celler, siFOXA1-transfekterte celler viste nesten 80% reduksjon av PSA-promoter-aktivitet sammenlignet med den for Nega-transfekterte celler (figur 2C). Når styre LNCaP-celler som kun ble transfektert med pGL3PSAp-5,8 ble behandlet med den AR ligand dihydrotestosteron (DHT), ble PSA promoter-aktivitet økte på en doseavhengig måte. Imidlertid ko-transfeksjon av disse cellene med siFOXA1 reduseres betydelig PSA promoter-aktivitet etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av DHT (figur 2D). For å se på påvirkning av FOXA1depletion på endogen PSA uttrykk, som FOXA1 handlinger til oppussing kromatin, analyserte vi PSA mRNA uttrykk i siFOXA1-transfekterte celler ved hjelp QRT-PCR. Figur S1 A viser at FOXA1 utarming mediert betydelig reduksjon av PSA mRNA nivå i forhold til at det i Nega-transfekterte celler.
For å avgjøre om FOXA1 mRNA uttrykk formidles av AR aktivitet, testet vi effekten av behandling av LNCaP celler med DHT og eller med AR antagonist bikalutamid på FOXA1 mRNA uttrykk. QRT-PCR-analyse viste at det ikke var noen forskjell i mRNA-ekspresjonen av FOXA1 i androgen-følsomme LNCaP-celler etter vekst i medium innehold DHT, eller i medium inneholdende bikalutamid (figur 2E og F). Resultatene indikerte at FOXA1 medierer aktivering av AR imidlertid uttrykk for FOXA1 seg selv er ikke regulert av androgen.
FOXA1 Regulerer Cell Proliferation i PC-Cells
For å undersøke effekten av FOXA1 knockdown på celle proliferasjon, cellevekst av siFOXA1-transfekterte LNCaP-celler ble overvåket i løpet av 4 dager. De siFOXA1-transfekterte celler viste en signifikant reduksjon i cellevekst sammenlignet med Nega-transfekterte celler (figur 3A). På den annen side, FOXA1 overekspresjon celler signifikant øket cellevekst sammenlignet med Nega-transfekterte celler (figur S1C). For å undersøke effekten av FOXA1 i cellesyklusprogresjon, analyserte vi cellesyklus stadier av siFOXA1-transfekterte celler ved hjelp av flowcytometrisk analyse. Prosentandelen av siFOXA1-transfekterte celler i G0 /G1 fase var høyere enn for Nega-transfekterte celler (figur 3B), noe som tyder på at nedregulering av FOXA1 inhiberte cellulær proliferasjon ved induksjon av G0 /G1 rest.
(A) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (# 1- # 3), og ble deretter sådd på nytt inn i en 24-brønners kulturplate. Celleproliferasjon ble deretter analysert i løpet av 4 dager, ved å telle antall celler for hver transfeksjon tilstand, som angitt. (B) Den cellesyklus stadium av cellene ble analysert ved hjelp av propidiumjodidfarging og FACS-analyse 24 timer etter transfeksjon siRNA og prosentandelen av celler i hver transfektert populasjon som var i hver syklus fase ble beregnet. (C) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3). Etter 48 timers transfeksjon av IGFBP-3 mRNA-ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR. IGFBP-3 mRNA-ekspresjon er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. (D) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3). Etter 72 timer med transfeksjon, ble IGFBP-3-konsentrasjon av mediet analysert ved hjelp av ELISA. (E) Proteiner ble ekstrahert 72 timer etter transfeksjon og ekspresjon av IGFBP3, med insulinreseptoren signale relaterte proteiner (total mengde av MAPK, fosfo-MAPK, og antall Akt og fosfo-Akt), ved G0 /G1 arrest- relaterte cellesyklusregulerende proteiner (p21cip1, p27kip1) og av GAPDH ble undersøkt av western blot analyse. Protein-molekylvekter er indikert ved venstre side av panelet. Disse resultatene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. ** Indikerer en statistisk forskjell på P . 0,01
Nedbryting av FOXA1 Regulerer IGFBP-3 og IGF signale
For å få et innblikk i gener som er oppregulert ved FOXA1 uttømming av PC-celler, utførte vi genekspresjon mikromatriseanalyse av celler utarmet av FOXA1 (tabell 3 og 4). Vi identifiserte 421 gener som var sterkere uttrykt i FOXA1-utarmet celler enn i den negative kontroll-transfektanter. Clustering av oppregulert gener i funksjonelle kategorier indikerte at den høyeste andelen av oppregulert genene var knyttet til celleproliferasjon, etterfulgt av respons på såret, muskel system prosesser, forsvar svar, inflammatoriske responser, negativ regulering av celleproliferasjon, svar på hypoksi og cellemodning (tabell 3). Up-regulerte gener som er relatert til negativ regulering av celleproliferasjon er angitt i tabell 4. Av disse opp-regulerte gener, vi undersøkt ytterligere insulinlignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3), siden dette genet er et godt vitskape tumor-undertrykkende genet i PC [20] – [23]
for å bekrefte oppregulering av IGFBP-3 i LNCaP celler ved FOXA1 utarming som ble angitt av microarray. data, analyserte vi IGFBP-3 mRNA og protein ekspresjon i LNCaP-celler transfektert med plasmider siFOXA1 eller med den negative kontrollen siRNA plasmid, ved å bruke QRT-PCR og Western blot analyser, respektivt. Figur 3C viser at IGFBP-3 mRNA-ekspresjon i siFOXA1-transfekterte celler var signifikant høyere enn den i Nega-transfekterte celler. IGFBP-3 protein nivåer i siFOXA1-transfekterte celler ble også økt kraftig sammenlignet med nivået i Nega-transfekterte celler (Figur 3E). Dessuten, for å evaluere endringer i nivåene av utskilte IGFBP-3, utførte vi ELISA. Figur 3D viser at IGFBP-3-konsentrasjonen i mediet av siFOXA1-transfekterte celler ble også sterkt øket (mer enn 30 ganger) sammenlignet med den til Nega-transfekterte celler. Siden IGFBP-3 modulerer IGF-1-signalering, ved siden undersøkte vi om FOXA1 regulering av IGFBP-3 ekspresjon var assosiert med modulering av ekspresjonen nivå eller aktiveringsstatusen til IGF-1 nedstrømssignalene i disse cellene (figur 3E). Western blot-analyse indikerte merket oppregulering av IGFBP-3, ned-regulering av fosforylering av MAPK og Akt, og oppregulering av proteinet ekspresjon av cyclin-avhengige kinaser (p21cip1, p27kip1) i siFOXA1-transfekterte celler sammenlignet med Nega-transfekterte celler (Figur 3E). Videre FOXA1 uttømming vesentlig blokkert aktivering av AKT som respons på IGF-1-behandling i LNCaP (figur S1E). Disse resultatene viste at FOXA1 regulering av IGFBP-3 er ledsaget av regulering av IGF-1 nedstrømssignalene.
For å kunne bestemme betydningen av IGFBP-3 for FOXA1 regulering av PC-proliferasjon, vi sammenlignet veksten av siFOXA1 -transfected LNCaP-celler og at av siIGFBP-3-transfekterte celler. IGFBP-3 var forbigående slått ned ved transfeksjon av LNCaP celler med IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) plasmid og IGFBP-3 mRNA og protein uttrykk i siIGFBP-3-transfekterte celler ble vurdert ved hjelp QRT-PCR og Western blot analyse hhv. Figur 4A viser at IGFBP-3 mRNA og protein ekspresjon i siIGFBP-3-transfekterte celler var signifikant lavere enn det i den nega-transfekterte celler. Selv om siFOXA1-transfekterte celler viste en signifikant reduksjon i cellevekst sammenlignet med Nega-transfekterte celler (figur 3A og 4B), ble den anti-proliferative effekt av siFOXA1 reverseres ved dobbel transfeksjon av siFOXA1 og siIGFBP-3 (Figur 4B). Dette resultat indikerte at FOXA1 regulerer celleproliferering i en IGFBP-3-avhengig måte.
(A) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med et IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) og, 48 timer senere, IGFBP-3 mRNA og proteinnivåer ble analysert ved hjelp QRT-PCR og Western blot-analyse. IGFBP-3 mRNA-ekspresjon er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. (B) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1- # 3) og /eller en IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), og ble sådd på nytt inn i en 24 -Vel kultur plate. Celleproliferasjon ble målt i løpet av 4 dager, og antall celler for hver transfektert populasjon er indikert. (C, D) LNCaP-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en AR siRNA (si AR) og /eller en FOXA1 siRNA (si FOXA1 # 1), og 48 timer etter transfeksjon, AR mRNA og protein ( C) eller IGFBP-3 mRNA-nivåer (D) ble analysert ved hjelp QRT-PCR og /eller western blot-analyse. De mRNA-nivåer er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. ** Indikerer statistisk forskjell fra P. 0,01
Siden aktivering av AR har blitt rapportert til å ned-regulere IGFBP-3-ekspresjon [24], vi studert videre effekten av AR på FOXA1 medierte regulering av IGFBP-3 bruker SIAR-transfekterte celler (Figur 4C og 4D). Nedbryting av AR gjorde øke IGFBP-3 mRNA uttrykk (2,8 ganger). Men økningen i IGFBP-3-ekspresjon observert i siFOXA1-transfekterte celler var mye høyere (16,4 ganger) enn det i Siar-transfekterte celler. Videre samtidig uttømming av AR og FOXA1 resulterte i en ytterligere økning i IGFBP-3 ekspresjon (24,0 ganger) sammenlignet med uttømming av FOXA1 alene, noe som antyder at AR FOXA1 og samvirkende regulere IGFBP-3 ekspresjon (figur 4D).
rolle FOXA1 på kastrering resistent prostatakreft (CRPC) modeller
Vi vurderte rolle FOXA1 på androgen-uavhengig prostatakreft ved hjelp c4-2 celler, etablert fra kastrerte rekke LNCaP celler. Nedbryting av FOXA1 betydelig hemmet cellevekst av c4-2 celler selv ved lav androgen miljø (5% kullfilter FCS) sammenligne med Nega-transfekterte celler (figur 5A). Overexpresssion av FOXA1 i c4-2 celler fremmet betydelig cellevekst (figur S1D). Når kontroll c4-2 celler ble behandlet med lave doser av DHT (1-100 pM), PSA promoter aktivitet var oppregulert ved en DHT konsentrasjon på 100 pM. Imidlertid transfeksjon av FOXA1 siRNA blokkerte oppregulering av PSA-promoteraktivitet som skjedde i respons til DHT behandling på 100 pM i c4-2-celler (Figur 5B). Tilsvarende uttømming av FOXA1 betydelig hemmet PSA mRNA uttrykk i QRT-PCR (figur S1B). Vi har også analysert IGFBP-3 mRNA-ekspresjon i c4-2-celler transfektert med plasmider siFOXA1 eller med den negative kontroll, ved hjelp av QRT-PCR. Figur 5C viser at IGFBP-3 mRNA-ekspresjon i siFOXA1-transfekterte celler var signifikant høyere enn den i Nega-transfekterte celler. Figur 5D viser at IGFBP-3-konsentrasjon i media av siFOXA1-transfekterte celler ble også økt kraftig (over 40 ganger) sammenlignet med nivået i Nega-transfekterte celler. siFOXA1 signifikant hemmet fosforylering av Akt etter stimulering med IGF-1 i c4-2 celler som ligner på den fra LNCaP-celler, noe som indikerer negativ regulering av IGF-1-signalisering ved uttynning FOXA1 (figur S1F).
(A) C4 -2-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre FOXA1 sirnas (# 1- # 3), og ble deretter sådd på nytt inn i en 24-brønners dyrkingsplate med fenolrødt-fritt RPMI-1640 medium inneholdende 5% CS-FBS. Celleproliferasjon ble deretter målt i løpet av 4 dager, og er vist som antall celler for hver transfektert populasjon. (B) c4-2-celler ble transfektert med den pGL3-PSAP 5,8 luciferase reporter og med en FOXA1 siRNA (# 1) og ble dyrket i fenolrødt-fritt RPMI-1640 medium inneholdende 5% CS-FBS med de indikerte konsentrasjoner av dihydrotestosteron (1-100 pM). Etter 72 timers transfeksjon, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av Dual-luciferase reporter analysesystem. (C) c4-2-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (Nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3). Etter 48 timers transfeksjon av IGFBP-3 mRNA-ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR. IGFBP-3 mRNA-ekspresjon er uttrykt i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon i den samme celle. (D) c4-2 celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA (nega) eller med en av tre forskjellige FOXA1 sirnas (siFOXA1 # 1-3). Etter 72 timer med transfeksjon, ble IGFBP-3-konsentrasjon av mediet analysert ved hjelp av ELISA. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. * Og ** indikerer statistisk forskjell på P 0,05 og P . 0,01, henholdsvis
Diskusjoner
Denne studien undersøkte rollen FOXA1 i PC progresjon. Vi identifiserte tumor suppressor IGFBP-3 som et nytt mål for FOXA1, og viste at FOXA1 målretting av IGFBP-3 spiller en sentral rolle i reguleringen PC-celleproliferasjon.
IGFBP-3 er kjent for å fungere som en tumor suppressor eller et cellesyklus-inhibitor i PC-celler [21], [24]. Økt IGFBP-3 ekspresjon ved FOXA1 uttømming inhiberte fosforylering av MAPK og av Akt og mediert cellesyklus-stans ved øket ekspresjon av cellesyklus regulatorer p21 og p27 i PC-celler. FOXA1 er nylig blitt rapportert for å regulere cellesyklus og celleproliferasjon i LNCaP-celler [15]. Våre data indikerte at IGFBP-3 kan være en viktig regulator av FOXA1-avhengig celleproliferasjon i LNCaP-celler. Basert på våre resultater, ikke bare AR men også IGFBP-3 kan være en viktig faktor i FOXA1 mediert signalering i PC.
FOXA1 er en transkripsjonsfaktor som modulerer funksjonen av steroidhormonreseptorer. I prostata, samvirker FOXA1 med AR og regulerer androgen indusert aktivering av prostata-spesifikke gener [6]. Nylig, AR og tilstøtende FOXA1 bindingsseter er finnes på flere arrangører i prostataceller [7], [25]. På samme måte som funksjon av AR, er nødvendig for normal utvikling i tillegg til androgen regulering av PC [26] FOXA1 uttrykk. Økt uttrykk for FOXA1 har blitt observert i alle stadier av prostata utvikling i en musemodell [27]. Vi fant at FOXA1 ble overuttrykt i kjernen av PC-celler, og at denne overekspresjon var forbundet med øket PSA, Gleason Poeng og AR uttrykk. Videre er overekspresjon av FOXA1 var en signifikant faktor i PSA svikt. De Resultatet er i tråd med tidligere rapport som indikerer at FOXA1 fargeintensitet var betydelig svakere i tilstøtende ikke-kreft enn kreftvev [28] og at sterke FOXA1 farging assosiert med dårlig prognose, høyere pt etapper og økt Gleason grad [15], [28 ]. Et høyt nivå av FOXA1 ble tidligere funnet i 89% av metastatisk PC og uttrykk for FOXA1 var positivt korrelert med tumorstørrelse, extraprostatic invasjon, AR og lymfeknute invasjonen [29]. FOXA1 bidrar til androgen-avhengig vekst av PC [30]. FOXA1 spiller også en viktig rolle i uttrykket av ubiquitin-konjugering enzym E2C (UBE2C), et gen som inaktiverer M-fase sjekkpunkt, og UBE2C er over-uttrykt i androgen-uavhengig PC cellelinjer og kliniske tilfeller [31]. Genom-wide assosiasjonsstudier indikerte tilstedeværelsen av en enkeltnukleotidpolymorfi (rs119986220) i FOXA1 bindingssetet innen 8q24 alleler som er tilknyttet PC risiko [25]. Den kombinerte bevis støtter sammenhengen mellom FOXA1 og tumorprogresjon hos PC.
Gjennom genekspresjonsanalyser identifiserte vi IGFBP-3 som en ned-stream målet for FOXA1. IGFBP-3 er en insulin-lignende vekstfaktorbindende protein hvis hovedfunksjon er forbundet med IGF levering og tilgjengelighet [32]. IGFBP-3 har en større affinitet for IGF-1 enn IGF-1-reseptoren og blokkerer IGF-1-mediert reaksjonsvei. IGFBP-3 kan derfor redusere IGF-1 biotilgjengelighet og hemmer IGF-1 interaksjon med IGF-1-reseptoren, for derved å virke som en tumor suppressor [21], [24]. En IGF-uavhengige rolle IGFBP-3 har også nylig blitt identifisert. IGFBP-3 binder seg til den transformerende vekstfaktor-β type V-reseptoren og derved hemmer cellevekst uavhengig av dens virkninger på IGF [20], [33]. Induksjon av apoptose ved synergistisk interaksjon av IGFBP-3 med en kjernefysisk reseptor slik som retinoid X-reseptor (RXR) -alfa har også blitt observert i PC-celler [24], [34]. Vår resultat indikerte også at økt ekspresjon av IGFBP-3 ved uttømming av FOXA1 signifikant hemmet PC proliferasjon i androgen-følsomme LNCaP-celler, mest sannsynlig gjennom IGF-1 signalveien. Økt IGFBP-3 på FOXA1 uttømming hemmet fosforylering av signale meklere i IGF-1 signalveien inkludert MAPK og Akt, og formidlet cellesyklus arrest gjennom p21 og p27 i PC-celler. De sistnevnte resultatene er konsistent med en tidligere rapport som FOXA1 var oppregulert i en skjoldbrusk kreft lesjon, og at uttømming av FOXA1 indusert cellesyklus arrest og en reduksjon i celleproliferasjon via en p27 avhengig mekanisme [14].
Kjøp av androgen motstand i PC, som er betegnet kastrering motstand, er et stort problem som begrenser pasientens livskvalitet samt forventet levealder. Selv om en rekke mekanismer har blitt foreslått for å forklare utviklingen av kastrering-resistente PC (CRPC), vises fremdeles den viktigste vei av denne motstand å involvere AR, selv under anti-androgen behandling. Forsterkning av AR, mutasjon av AR, overekspresjon av AR coactivators eller deregulering av vekstfaktorer /cytokiner kan alle forekomme i CRPC og indusere en forandring i respons til AR-antagonister. En annen mekanisme for CRPC er gjennom flukt fra apoptose på grunn av tap av tumorundertrykkende gen PTEN og undertrykkelse av anti-apoptotiske gen BCL-2 [35]. En annen kjent årsak til CRPC er at AR kan aktiveres i humane PC-celler i fravær av androgener med IL-6 [36], [37]. Eksistensen av så mange komplekse stier knyttet til regulering av AR aktivisering gjør det vanskelig å kontrollere veksten av CRPC. Basert på våre data, kan målretting av FOXA1 gi en praktisk tilnærming til nedregulering av AR aktivitet i CRPC. Nedbryting av FOXA1 signifikant nedregulert ligand-avhengig AR aktivering (opptil 80%) i LNCaP celler og c4-2 celler. Videre uttømming av FOXA1 oppregulert IGFBP-3 ekspresjon og inhiberer IGF-1 signalering, som er en stor vei for ligand-uavhengig aktivering av AR [38]. Men en annen linje av bevis indikerte doble rollen FOXA1. Selv FOXA1 fungerer som en pioner faktor fremme AR og kromatin samhandling, skaper det også corepressor komplekser hemmende AR og kromatin bindende. Således FOXA1 uttømming resulterer i opptreden av et stort antall nye ARB som er knyttet til androgen regulering av nærliggende gener [28], [39]. For å unngå ikke-spesifikk binding, ble en immuniserende peptid-blokkerende eksperiment utført. 2+, moderat;
