Abstract
Det er for tiden stor interesse for å utvikle anti-kreftbehandling rettet mot cellesignalveier som er viktige for både kreft celle metabolisme og vekst. Flere epidemiologiske studier har vist at diabetespasienter som tar metformin har en redusert forekomst av kreft i bukspyttkjertelen. Dette har bedt arbeidet med å vurdere metformin, et legemiddel med ubetydelig toksisitet, som en terapeutisk modalitet i bukspyttkjertelkreft. Prekliniske studier i cellelinje xenograft og en studie i pasient-avledet xenograft (PDX) modellene var lovende, mens nylig publiserte kliniske studier viste ingen fordel å legge metformin til kombinasjonsbehandling regimer for lokalavansert eller metastatisk kreft i bukspyttkjertelen. PDX modeller der pasient svulster er direkte innpodet i immunsupprimerte mus har vist seg å være gode prekliniske modeller for biomarkører og terapeutisk utvikling. Vi evaluerte responsen av fire PDX tumorlinjer til metformin behandling og funnet ut at alle fire av våre PDX linjene var resistente mot metformin. Vi fant ut at mekanismene for resistens kan oppstå gjennom mangel på vedvarende aktivering av adenosin monofosfat-aktivert protein kinase (AMPK) eller nedstrøms reaktivering av mammalian target of rapamycin (mTOR). Dessuten, kombinert behandling med metformin og mTOR inhibitorer mislyktes i å forbedre responser i cellelinjer, noe som ytterligere indikerer at metformin alene eller i kombinasjon med mTOR-inhibitorer vil være ineffektiv i pasienter, og at motstanden av metformin kan skje gjennom flere reaksjonsveier. Videre studier er nødvendig for å bedre forstå disse mekanismene for resistens og informere potensielle kombinasjonsbehandlinger med metformin og eksisterende eller nye behandlingsformer
Citation. Lipner MB, Marayati R, Deng Y, Wang X, Raftery L, O’Neil BH, et al. (2016) Metformin Behandling ikke hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen Pasient Avledet xenografter. PLoS ONE 11 (1): e0147113. doi: 10,1371 /journal.pone.0147113
Redaktør: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, CANADA
mottatt: 25 juli 2014; Godkjent: 29 desember 2015; Publisert: 13 januar 2016
Copyright: © 2016 Lipner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble delvis støttet av Lineberger Omfattende Cancer Center (BHO) og CA140424 og CA193650 (JJY) fra National Cancer Institute
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive og dødelige kreftformer, med 80% av pasienter med lokalavansert eller metastatisk sykdom som bebuder en 6-12 måneders median overlevelse og en forferdelig kamp 6% fem års overlevelse [1]. Kjemoterapi produserer bare beskjedne forbedringer i overlevelse, og nye behandlingsformer er desperat behov for å bedre behandlingstilbud for denne store befolknings pasient [2]. Det er for tiden stor interesse for å utvikle anti-kreftbehandling som retter seg mot cellesignalveier viktige i både celle metabolisme og cellevekst [3]. 5 «adenosinmonofosfat-aktivert protein kinase (AMPK) veien har fått økende interesse, som AMPK fysiologisk hemmer mammalian target of rapamycin (mTOR) for å opprettholde homeostase i forhold til redusert tilgjengelige mobilnettet energikilder [4, 5]. Studier har vist at mTOR signal spiller viktige roller i overlevelse og spredning av ondartede celler [6, 7]. Dermed har AMPK aktivatorer generert stor interesse som potensielle antineoplastiske midler som fungerer ved å endre stoffskiftet og hemme mTOR pathway [3].
Metformin er første-linje agent for behandling av type 2 diabetes mellitus. Metformin hemmer mitokondrisk oksidativ fosforylering, for derved å øke forholdet av AMP til ATP [8, 9]. Høye nivåer av AMP aktivere AMPK, som deretter hemmer energikrevende trasé som proteinsyntese, delvis av downregulating mTOR signal ved direkte fosforylering av tumor suppressor TSC2 og mTOR bindingspartner Raptor [9-13]. Tilstanden til energisparing indusert av metformin har blitt foreslått for å forklare cytostatisk effekt av metformin på kreft [9] og den tilsynelatende beskyttende effekt observert hos diabetespasienter som behandles med metformin som senere utvikler kreft i bukspyttkjertelen [14].
flere epidemiologiske studier har indikert at pasienter med diabetes tar metformin har en redusert forekomst av kreft i bukspyttkjertelen [14-17]. Dette har ført til en god del spenning å vurdere metformin, et mye brukt legemiddel med ubetydelig toksisitet, som en terapeutisk modalitet i bukspyttkjertelkreft. Det er for tiden 3 kliniske studier som evaluerte metformin i kombinasjon med ulike chemotherapies i bukspyttkjertelkreft (cancer.gov/clinicaltrials). Prekliniske studier i cellelinje xenograft og en fersk undersøkelse i pasient avledet xenograft (PDX) modeller har vist lovende [18-22].
PDX modeller der pasient svulster er direkte innpodet i immunkompromitterte mus har vist seg å rekapitulere primærtumor arkitektur og genetiske egenskaper, selv etter passaging og utvide svulstene i påfølgende generasjoner av mus [23, 24]. Videre PDX modeller er overlegen i forhold til tradisjonelle cellelinje xenotransplantater, som er tilpasset til in vitro vekst, og som mangler heterogenitet av pasient tumorer, for evaluering av svarene på terapier og nye biomarkører [23-27]. Inntil nylig har det vært svært begrensede studier av PDX svar på mange foreslåtte onkologiske midler, og resultater for metabolske behandlinger som metformin er fortsatt svært mangelfull [27]. Dermed målet med denne studien var å evaluere responsen av bukspyttkjertelkreft PDX modeller til metformin og å undersøke metformin mekanisme av action og kompenserende motstand trasé.
Materialer og metoder
Narkotika og reagenser
Metformin hydroklorid (Spectrum, New Brunswick, NJ, USA) ble løst i fosfat-bufret saltvann (PBS) for både in vitro og in vivo studier. Rapamycin (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) og BEZ235 (Senter for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, UNC eshelman School of Pharmacy, Chapel Hill, NC, USA) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) for in vitro-studier på kombinasjonsbehandling . Antistoffer mot fosforylert AMPKα (Thr172), AMPKα, AMPKα1, AMPKα2, fosforylert mTOR (Ser2448), mTOR, fosforylert p70S6K (Thr389), p70S6K, fosforylert 4E-BP1 (Thr37 /46), og 4E-BP1 var fra Cell Signaling (Beverly , MA, USA). Anti-glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) og pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin IgG var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pierce® ECL Western blotting Underlaget var fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 testsettet var fra Promega (Madison, WI, USA).
Cell kultur og transduksjon med lentivirus
bukspyttkjertelkreft cellelinjer CAPAN-2, CFPAC- 1, ble HPAF-II, og SW1990 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC), autentiseres via korte tandem gjentagelse (STR) profilering (Genetica, Burlington, NC, USA), og testet negativt for mycoplasma ved indirekte farging. Cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2 atmosfære.
puromycin domenet for AMPKα1-859 pLKO.1 reporter plasmid (sjenerøst donert av laboratoriet av Channing Der, PhD ved The University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) ble erstattet med en blasticidin domene ved restriksjonsenzymoppslutning med BamHI og KpmI. Den andre generasjonen replikering-inkompetent lentivirus ble generert i 293T celler med en fire-plasmid system: reporter plasmid, pMDL gag /pol RRE, pRSV-Rev, og pCMV VSV-G. For transduksjon med lentivirus, 1 x 10
6 CFPAC-1 og HPAF-II-celler ble sådd ut i 100 mm plater med lentivirus og en endelig polybren konsentrasjon på 8 ug /ml. Etter 24 timer ble mediet byttet ut, og cellene ble dyrket i ytterligere 4 dager med 2 ug /ml puromycin eller 10 dager med 10 ug /ml blasticidin. Cellene ble trypsinert og analysert ved western blotting for å bestemme gen knockdown.
Ekspresjonsvektoren for myc-mTOR transient overekspresjon ble oppnådd fra Addgene (plasmid 1861, Cambridge, MA, USA). Transfeksjon av 5×10
5 CFPAC-1 eller HPAF-II-celler ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) ved hjelp av produsentens retningslinjer. Etter 24 timers inkubering ble transfekterte celler behandlet med 5 mM metformin i ytterligere 24 timer, ved hvilket tidspunkt cellene ble vasket med PBS, høstet ved skraping, og lagret ved -80 ° C inntil protein isolasjon.
MTT assay for celleproliferasjon
for å bestemme celleviabilitet følgende medikamentelle behandlinger, 5×10
3 celler ble sådd ut i fire eksemplarer i 96-brønners plater i 200 ul RPMI 1640 medium og dyrket over natten. Mediet ble deretter erstattet med friskt medium inneholdende enten PBS som en bærerkontroll, metformin (0-5 mM), eller metformin pluss enten rapamycin (0-80 uM) eller BEZ235 (0-1 uM). Etter ytterligere 48 timers inkubering ble 50 ul av 5 mg /ml 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) oppløst i PBS ved pH 7,4 ble tilsatt til hver brønn. Etter en times inkubasjon ble kulturmediet og MTT-reagens aspirert og 200 ul dimetylsulfoksid ble tilsatt til hver brønn og blandet grundig. Absorbansen ved OD560 nm ble målt ved anvendelse av en Synergy to plateleser (BioTek, Winooski, VT, USA). Relativ spredning ved hver medikamentkonsentrasjon ble beregnet i henhold til formelen: 100% * (eksperimentelt OD560 /kjøretøy OD560). Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av en enveis ANOVA-analyse med Dunnetfs multiple sammenligninger test. For kombinasjonsterapistudier, ble synergi vurdert ved hjelp Compusyn programvare ansette Chou-Talalay median effekt prinsippet (ComboSyn, Inc. Paramus, NJ, USA). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Western blot betingelser
Etter den angitte tiden for inkubasjon med metformin, ble cellene vasket med PBS, høstet ved skraping, og deretter lysert i 200 ul RIPA-buffer innehold 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 1 mM NaF, og 0,25% Na-deoksykolat og proteaseinhibitorer. Proteinekstrakter (30 ug) ble underkastet elektroforese på 10% SDS-polyakrylamidgeler og elektrooverført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. For bestemmelse av knockdown av AMPKα1 og AMPKα2, ble membranene blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i Tris-bufret saltvann, og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med 1: 1000 fortynninger av anti-AMPKα1, anti-AMPKα2, og anti- AMPKα antistoffer. For celler og vev lysatene isolert etter behandlinger metformin, ble membranene inkubert ved 4 ° C over natten med 1: 1000 fortynninger av anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR, anti-fosfo-p70S6K, anti-p70S6K, anti-fosfo-4e BP1, anti-4E-BP1, anti-fosfo-AMPKα, og anti-AMPK-antistoffer. Membranene ble deretter vasket og inkubert med en 1: 5000 fortynning av pepperrotperoksydase-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Immunoreaktive bånd ble påvist ved hjelp av kjemiluminescens Pierce® ECL western blotting substrat. Intensitet av hver immunoreactive bandet ble kvantifisert ved densitometri ved hjelp av Image J programvare (NIH, Bethesda, Maryland, USA), og uttrykte i forhold til PBS-behandlede celler eller mus. GAPDH ble anvendt for å sikre tilsvarende protein lasting. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Student
t
-UNDERSØKELSER for to prøve sammenligninger og enveis ANOVA analyse med Dunnetts multiple sammenligninger test for tre eller flere prøve sammenligninger.
PDX kohort utvidelse
bukspyttkjertel~~POS=TRUNC duktalt adenokarsinom vev fra avidentifiserte pasienter med lokalisert kreft i bukspyttkjertelen som gjennomgikk kurativ kirurgisk reseksjon ble hentet fra University of North Carolina Institutional Review Board (IRB) godkjente vev anskaffelser Facility etter IRB-godkjennelse (08-1153). Tumorvev ble innpodet subkutant i flankene av NSG /NOD-mus, ekspandert, og passert over tid, slik som beskrevet tidligere [28, 29]. 7-8 uker gamle nu /nu-mus med en gjennomsnittlig vekt på 18-20 g ble anvendt i alle forsøk. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med det amerikanske National Institutes of Health (NIH) Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i henhold til protokoller godkjent av University of North Carolina Institutional Animal Care og bruk Committee (12-314).
Metformin behandling av PDX kohort
behandlingen ble startet etter innpodet svulster vokste til en median tumorstørrelse på 108 mm
3. Minst fem mus ble inkludert i hver behandlingsgruppe for hver PDX tumor linje. Mus ble behandlet med metformin (200 eller 400 mg /kg) eller PBS (20 pl /g) med én gang daglig oral sonde. Den første dag av behandlingen ble betegnet som dag 0 og behandlingen ble fortsatt i 28 dager. Tumor volum (V) ble målt to ganger per uke ved hjelp calipers, og beregnes som (lengde x bredde
2) /2. Animal kroppsvekt ble målt en gang i uken. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av en enveis ANOVA-analyse med Dunnetfs multiple sammenligninger test. Tumorvev ble oppsamlet to timer etter den siste behandling, og kuttet i to deler: en del ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til protein isolasjon, mens den andre delen ble fiksert i 10% formalin og innleiret parafin ( FFPE). FFPE- vevsblokker ble seksjonert og farget med hematoxylin og eosin for histopatologisk evaluering.
Resultater
Metformin hemmer ikke veksten av PDX svulster
Vi har evaluert responsen på fire kreft i bukspyttkjertelen PDX tumor linjer til metformin (200 og 400 mg /kg) i 28 dager. Disse dosene ble valgt som høyere doser har vist seg å være nødvendig i mus for å fremstille en reduksjon i blodglukose i diabetiske dyr [19, 30, 31]. I tillegg har høyere doser av metformin (0,1% w /w) er vist å øke levetiden til mus [32]. Ingen tumorvekst-inhibering eller regresjon ble observert i noen av de fire PDX tumorlinjer som helst punkt målt (fig 1). Ingen endring i kroppsvekt forekommet i løpet av studien og tumor arkitektur forble grovt uendret etter 28 dagers behandling, som vurdert av hematoxylin og eosin-farging (S1 figur).
Ingen signifikant vekst inhibering ble observert i fire forskjellige bukspyttkjertelkreft PDX tumorlinjer når som helst punkt i løpet av en 28 dagers behandling kurs med 200 mg /kg eller 400 mg /kg metformin administrert av daglig oralt inntak.
Aktivering av AMPK og hemming av p70S6K fosforylering i PDX svulster er ikke vedvarende etter en 28 dagers behandling med metformin
for å avgjøre om metformin behandling endret AMPK og mTOR signalering, evaluert vi alle fire PDX tumorlinjer for fosforylering av AMPK (Thr172) og p70S6K (Thr389) på slutten av den 28-dagers behandling (fig 2A og 2B og S2 fig). I denne langtidsbehandling kohorten, ble ingen endring i fosforylering av AMPK og p70S6K sett i metformin sammenlignet med bilens behandlet svulster. Vi evaluerte deretter effekten av metformin på to PDX-tumorer etter bare 3 dagers behandling. I motsetning til de langsiktige behandlings svulster, viste de kortsiktige behandlings svulster økt fosforylering av AMPK og redusert fosforylering av p70S6K (Fig 2C og 2D).
Fosforylering av AMPKα og p70S6K i (A) P505 og (B) P710 PDX svulster etter 28 dagers behandling med 400 mg /kg metformin. Fosforylering av AMPKα og p70S6K i (C) P505 og (D) P710 PDX svulster etter tre dagers behandling med 400 mg /kg metformin (* p 0,05).
Metformin hemmer vekst og endrer AMPK og mTOR signalisering i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
Siden mangelen på vedvarende respons i våre PDX modellene var overraskende, vi neste undersøkte effekten av metformin på spredning av fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer (CAPAN-2, CFPAC-en , HPAF-II, og SW1990). Metformin hemmet celleproliferasjon i en doseavhengig måte i alle fire cellelinjer (figur 3A). Metformin behandling aktivert AMPK, som bestemt ved fosforylering av AMPK ved Thr (172) i alle cellelinjene som ble testet, med en topp-aktivering forekommer ved 4-8 timer etter behandlingen (figur 3B). Gitt at AMPK aktivering er kjent for å hemme mTOR, vi videre analysert effekten av metformin behandling på fosforylering status av mTOR og nedstrøms mål p70S6K og 4E-BP1. Interessant, observerte vi en forsinket hemming av mTOR og nedstrøms mål fosforylering, med nadir av observerte fosforylering av p70S6K og 4E-BP1 skjer på 48 timer i både CFPAC-en og HPAF-II celler (figur 3C og 3D).
(A) Celler ble sådd ut i fire eksemplarer til 96-brønns plater ved en densitet på 5×10
3 per brønn, inkubert over natten, og deretter behandlet med media inneholdende enten PBS som en bærerkontroll eller forskjellige konsentrasjoner av metformin (0 -5 mM). Etter 48 timer ble sprednings indekser bestemmes ved anvendelse av MTT-analysen og normalisert til de av de bæremiddelbehandlede celler. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. (B) Fosforylering av AMPKα og total AMPKα ved forskjellige tidspunkter etter behandling med 5 mM metformin. Behandling begynte på 0 timer (timer). (C) Fosforylering av mTOR, p70S6K, og 4E-BP1 ved forskjellige tidspunkter etter behandling med 5 mM metformin. (D) Densitometry av fosforylert AMPKα, mTOR, p70S6K, og 4E-BP1 forhold til totalnivå er vist i (B) og (C).
AMPK er bare delvis nødvendig for anti-proliferativ effekt av metformin
den anti-proliferative effekt av metformin er primært blitt tilskrevet dets evne til å aktivere AMPK pathway. Vi antok at mangel på vedvarende AMPK aktiveringen som sees i alle fire PDX-tumorlinjer kan forklare mangelen på tumorvekstrespons. Således utførte vi shRNA-indusert knockdown av en eller begge av de katalytiske underenhetene av AMPK i bukspyttkjertelcancercellelinjer for å bestemme hvorvidt anti-proliferative effekter av metformin ville bli påvirket. Vi fant at knockdown av AMPK α1 og /eller AMPK α2 delvis men ikke helt snudd metformin evne til å inhibere celleproliferering (figur 4A og 4B).
(A) shRNA knockdown av AMPKα subenheter i CFPAC-1 og HPAF -II-cellelinjer. (B) proliferasjon av CFPAC-1 og HPAF-II-cellelinjer med stabil knockdown av AMPKα underenheter etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av metformin (0-5 mm). (C) fosforylering av mTOR og p70S6K i CFPAC-en og HPAF-II cellelinjer med stabil knockdown av AMPKα subenheter.
Metformin synes å virke på mTOR i en AMPK-uavhengig måte
Vi neste undersøkt om mangelen på vedvarende p70S6K hemming sett i P710 PDX svulst linjen tross bevis for noen vedvarende AMPK aktivering kan ha vært på grunn av en AMPK-uavhengig mekanisme. Vi evaluerte effekten av metformin på fosforylering av mTOR og p70S6K etter knockdown av AMPK α1 og /eller AMPK α2. CFPAC-1 og HPAF-II-cellelinjer med stabil knockdown av NS, AMPK α1 og /eller AMPK α2 (figur 4A) ble behandlet med 5 mM metformin (figur 4B og 4C). I begge cellelinjer, ble knockdown av en eller begge subenheter ikke redde evnen av metformin til å inhibere vekst eller fosforylering av mTOR og p70S6K, noe som tyder på at evnen av metformin til å hemme mTOR og p70S6K er i det minste delvis uavhengig av AMPK-aktivering i disse celle linjer.
mTOR overekspresjon er tilstrekkelig til å overvinne de anti-proliferative effekten av metformin, men kombi behandling med metformin og mTOR-hemmere ikke produserer synergi
Fordi metformin ikke klarte å opprettholde hemming av mTOR veien målt ved p70S6K fosforylering i våre langsiktige metformin behandlet PDX svulster, og på grunn av våre funn at metformin-indusert mTOR-hemming var minst delvis AMPK-uavhengig, neste fastsatte vi om mTOR aktivering alene var nok til å oppheve effekten av metformin. Vi fant at overekspresjon av mTOR ved hjelp av en mTOR-myc-konstruksjonen var tilstrekkelig til å gi fullstendig vekstinhibering motstand og for å begrense reduksjonen i p70S6K-fosforylering følgende metformin behandling (figur 5A og 5B). For å bestemme hvorvidt å kombinere metformin med målrettet mTOR inhibitorer kan være et logisk terapeutisk strategi, behandlet vi cellelinjer med konstant-forholdet doser av metformin og enten allosterisk mTOR-inhibitor rapamycin eller den katalytiske mTOR inhibitor BEZ235, som er kjent for å inhibere kreft i bukspyttkjertelen cellelinjen vekst. Veksthemming ble ikke forbedret på noen dose kombinasjon i forhold til enkel behandling, og ingen synergisme mellom metformin og enten mTOR-hemmer ble beregnet til enhver dose med Chou-Talalay median effekt ligning (Fig 5C og 5D).
(A) Fosforylering av p70S6K i og (B) proliferasjon av HPAF-II-celler etter behandling med 5 mM metformin følgende forbigående ekspresjon av et transfektert myc-mTOR-konstruksjonen. Bruke median effekt ligningen beregning for kombinasjon indeks (CI) etter tre dagers behandling med konstant-ratio doser av metformin og enten (C) allosterisk mTOR-hemmer rapamycin eller (D) den katalytiske mTOR-hemmer BEZ235 klarte å produsere synergi (CI 1 ) ved en hvilken som helst dosekombinasjon. CI verdier ved 50% veksthemming: (C) CFPAC-1 1,54, HPAF-II 1,43; (D) CFPAC-1 1,30, HPAF-II 1.29. (* P 0,050, ** p 0,005, *** p 0,001).
Diskusjoner
Epidemiologiske studier hos diabetespasienter har funnet at pasienter behandlet med metformin har en redusert forekomst av flere kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [14-17]. Flere prekliniske studier av metformin som en anti-cancer terapeutisk har vært lovende, noe som viser imponerende tumorvekstinhibitering [20, 22, 33] og apoptose [34] fra bukspyttkjertelcancercellelinjer. Imidlertid har cellelinje xenografter vært generelt upålitelige predikator for narkotika reaksjoner hos mennesker. Lonardo et al. evaluert effekten av metformin på fire bukspyttkjertelkreft PDX tumorlinjer og, i likhet med tidligere cellelinje xenograft studier, fant betydelig veksthemming [21]. I kontrast, nye kliniske studier som evaluerte metformin i bukspyttkjertelkreft har herdet optimisme opprettet av denne preklinisk arbeid. En dobbel-blind, randomisert, placebo-kontrollert fase II-studie som evaluerte metformin i kombinasjon med gemcitabin og erlotinib hos pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen viste ingen forskjell i utfall som følge av metformin behandling [35]. En annen fase II-studie som kombinerer metformin med paclitaxel hos pasienter med gemcitabin-refraktær sykdom ikke klarte å oppfylle sin primære endepunktet i sykdomskontrollrate [36].
I denne studien har vi observert en uniform manglende respons på metformin i fire PDX kreft linjer som vi evaluert. Flere mulige grunner foreligger for de ulike resultatene mellom tidligere prekliniske arbeid i forhold til vår studie og nyere kliniske studier. Først PDX svulster er iboende svært heterogen fordi PDX svulster er passert i bulk og er representative «biopsier «av tilsvarende heterogene kilde pasient svulster. For det andre, selv om doseområdet i vår studie lapper med tidligere studier, farmakokinetikken til metformin opptak er fortsatt uklart [37]. Svulstens mikromiljø og stromal innhold synes å påvirke metformin tilgang til kreftceller, som kan føre til ulike utfall mellom studier [21]. For det tredje, tumorvolumet ved hvilken behandlingen ble igangsatt varierer mellom studier, som kan påvirke svulst preparat, spesielt kreft stamcelle byrde. Lonardo et al. og andre har vist at bare denne stamcelle subpopulasjonen gjennomgår apoptose som et resultat av metformin behandling, mens det store flertallet av tumorceller opplever reversibel vekststans [18, 21]. Interessant, selv om Lonardo et al. fant at metformin var i stand til å begynne bremse PDX tumorvekst, de bemerket at alle PDX svulster slutt kommet på terapi [21], noe som tyder på at metformin monoterapi vil ikke være effektiv hos pasienter.
For å få innsikt i mulige mekanismer for motstand, vi evaluert ytterligere to av våre fire PDX linjer og funnet ut at motstand mot metformin kan være multifaktoriell og tumor-avhengige. For eksempel, i P505, AMPK-aktivering ble ikke opprettholdt mens det i P710, fortsatte tumorvekst skjedde til tross for noen varig AMPK aktivering. Våre etterfølgende resultater i cellelinjer som tyder på at dette kan være av to grunner. Først effekten av metformin på celleproliferasjon synes å være bare delvis AMPK-avhengig. For det andre, vises evnen av metformin til å inhibere mTOR-reaksjonsveien i bukspyttkjertelkreft også å være bare delvis AMPK-avhengig. På tvers av krefttyper, den grad som er avhengig av metformin AMPK aktivering for å hemme vekst og endre mTOR /p70S6K-signalering er uklar og sannsynligvis celletype-avhengig. Hemming av AMPK uttrykk via stanse av den katalytiske AMPK α-subenheten med bestemte hemmere av AMPK eller knockout av LKB1, oppstrøms signal for AMPK aktivering, reverserte anti-proliferative effekten av metformin i bryst- og eggstokk-kreft celler [38-40]. Omvendt, Ben Sahra et al. viste at nedregulering av AMPK hadde ingen effekt på metformin evne til å hemme prostatacancer cellevekst og mTOR-signalering [41]. I stedet fant de at metformin førte til mTOR-hemming og cellesyklus arrest ved å aktivere mTORC1 inhibitor REDD1 [42]. Andre studier i bryst- og eggstokk-kreft-cellelinjer er også funnet at effekten av metformin kan være bare delvis avhengig av AMPK-aktivering [43, 44]. Den anti-proliferativ effekt av metformin ble opprettholdt i eggstokkreft cellelinjen A2780 tross siRNA stanse av AMPKα1. I tillegg metformin behandling var i stand til å dempe proliferasjon av både AMPKα1 /2 vill-type og AMPKα1 /2 mangelfull mus embryonale fibroblaster (MEFs), selv om AMPKα1 /2 fattige MEFs var litt mindre følsom for metformin [43]. I brystkreftcellelinjer, ble hemming av HER2 med metformin funnet å være helt AMPK uavhengig [44]. Nyere studier i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer fant at metformin kan hemme vekst uavhengig av AMPK gjennom oppregulering av MIR-26a [45], mens metformin sin effekt på kreft i bukspyttkjertelen stamceller kan være mediert gjennom reexpression spesifikke miRNAs [18]. Disse resultatene tyder på at modulering av miRNA uttrykk kan være enda en viktig mekanisme bak de biologiske effektene av metformin.
Tatt sammen med de ovennevnte studiene, våre resultater at knockdown av AMPK subenheter ikke redde den hemmende effekten av metformin på mTOR /p70S6K fosforylering men det mTOR reexpression var i stand til å reversere den anti-proliferative effekter av metformin, antyder at aktiveringen av AMPK og hemming av mTOR /p70S6K reaksjonsveien av metformin er uavhengige hendelser som kan både bidra til kreftcellevekst inhibering. Videre kan regulering av AMPK av metformin være avhengig av celletype, og i kreft i bukspyttkjertelen, kan den anti-proliferative effekter av metformin være delvis eller i stor grad AMPK-uavhengig.
Samlet viser vår studie at selv om metformin inhiberer pankreatisk kreftcellelinje spredning, vil dens virkning på pasientens tumorer sannsynlig være forbigående, og mye mer kompleks. Mens resistensmekanismer sannsynligvis innebære mTOR bane aktivering, kan samtidig behandling med metformin og mTOR inhibitorer gjøre lite for å forbedre effektiviteten av enten terapi. Videre studier er nødvendig for å avgjøre om metformin kan en dag gi fordeler til bukspyttkjertelen kreftpasienter ved å utnytte sin komplekse metabolske og signaliserte effekter i kombinasjon med kjemoterapeutika eller målrettet terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Langsiktig metformin behandling påvirker ikke mus vekt eller tumorhistologi. Product: (A) Vekt av mus i løpet av en 28 dagers behandling kurs med enten 200 mg /kg eller 400 mg /kg metformin vist i forhold til baseline vekter. Hematoxylin og eosin farging av (B) P505 og (C) P710 pasient-avledet xenograft tumorer etter 28 dagers behandling med kjøretøy (venstre panel) eller 400 mg /kg metformin (høyre panel) viser ingen forskjell i tumor arkitektur, ductal formasjon, eller stromal innhold. Skala barer er 300 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147113.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Aktivering av AMPK og hemming av p70S6K fosforylering i PDX svulster er ikke vedvarende etter 28 dager med metformin behandling.
Fosforylering av AMPKα og p70S6K i (A) P722 og (B) PT4 PDX svulster etter 28 dagers behandling med 400 mg /kg . metformin
doi: 10,1371 /journal.pone.0147113.s002 plakater (TIF)
bekreftelser
forfatterne takker Charlene M. Santos ved University of North Carolina (UNC ) Lineberger Omfattende Cancer Center Animal Studies Core, UNC PDX Program, UNC vev anskaffelser Facility, og UNC translasjonell Pathology Laboratory for teknisk assistanse.
