Abstract
papillær skjoldbruskkjertelen (PTC) er en heterogen og kompleks sykdom; mottakelighet for PTC påvirkes av felles effekter av flere felles, lav penetrans gener, men relativt få har blitt identifisert til dato. Her har vi brukt en streng kombinert tilnærming for å vurdere både den enkelte og epistatisk bidrag fra genetiske faktorer til PTC mottakelighet, basert på en av de største serie av skjoldbruskkjertelen krefttilfeller som er beskrevet hittil. I tillegg til å identifisere involvering av
TSHR
variasjon i klassisk PTC, vår pioner studie av epistasis viste en signifikant interaksjon mellom varianter i
STK17B Hotell og
PAX8
. Interaksjonen ble påvist ved MD-MBR (p = 0,00010) og bekreftet av andre metoder, og deretter replikert i en andre serie uavhengig av pasientene (MD-MBR p = 0,017). Videre viste vi en invers korrelasjon mellom uttrykk for
PAX8 Hotell og
STK17B
i et sett av cellelinjer avledet fra humane thyroid karsinomer. Totalt sett, vårt arbeid kaster mer lys på genetisk grunnlag av skjoldbrusk kreft mottakelighet, og foreslår en ny retning for utforskning av arvelig genetisk bidrag til sykdom ved hjelp av assosiasjonsstudier
Citation. Landa jeg, Boullosa C, Inglada -Pérez L, Sastre-Perona A, Pastor S, Velázquez A, et al. (2013) En epistatisk Interaksjon mellom
PAX8 Hotell og
STK17B
Gener i papillær skjoldbrusk kreft mottakelighet. PLoS ONE 8 (9): e74765. doi: 10,1371 /journal.pone.0074765
Redaktør: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory for miljø og helse, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 05.08.2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Landa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) prosjekt PI11 /01 359 (til MR), Røde Tematica de INVESTIGACION Cooperativa en kreft, Instituto de Salud Carlos III, RD12 /0030/0060 (til PS), RD12 /0036/0050 (til NM) og S2011 /BMD-2328 TIRONET fra Comunidad de Madrid (til MR og PS), og European Regional Development Fund. IL støttes av FIS stipend FI07 /00326; CB er støttet av FPI tilskudd BES-2008-006332; LI-P er støttet av Centro de INVESTIGACION BIOMEDICA en Red de Enfermedades Raras, og AS-P er en predoctoral karer i FPU program (MICINN) hhv. SR-LL er postdoktor i FIS (kontrakt # CD05-0055). RDU er støttet av prosjektet BIO2009-12458 fra det spanske departementet for økonomi og innovasjon. RM, SP og AV støttes av Generalitat de Catalunya, CIRIT (2009SGR-725). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Follikkelfasen-celle-avledet skjoldbrusk karsinom er den vanligste endokrine maligniteter og insidensen har bemerkelsesverdig økt i de senere år [1], [2]. Blant dem, papillær thyroideakarsinom (PTC, 80-85% av tilfellene), og follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom (FTC, 5-10%) er de hyppigste subtyper [3]. Det er allment akseptert at follikulær-celle-avledet i skjoldbruskkjertelen kreft oppfører seg som en kompleks sykdom, der flere genetiske varianter, ligger på lav-penetrans gener (LPG), kommuniserer med hverandre og med omgivelsene, og således modulere den individuelle responsen [4] – . [6]
Vi har tidligere rapportert foreningen av
FOXE1
gen med PTC mottakelighet [7], et resultat som har blitt grundig kopiert [8] – [10]. Til nå har de fleste assosiasjonsstudier fokusert på hovedeffekter og identifisert bare enkelt, eller et svært begrenset antall, gener involvert i PTC patogenesen. Varianter i disse genene forklarer en relativt liten andel av tilfellene. Mens ytterligere lav-penetrans-gener kan identifiseres ved fremtidige studier av hovedeffektene, er det også sannsynlig at vanlige varianter på forskjellig
loci
samhandler for å endre følsomheten. Når genetiske varianter påvirke fenotypen i fellesskap i en ikke-additiv måte, er dette gen-genet interaksjon kjent som epistasis. Påvisningen av epistatisk interaksjoner representerer ikke bare statistisk, men også beregningsmessige utfordringer [11], [12]. Disse kan overvinnes ved å fokusere assosiasjonsstudier på gener som
a priori
kan spille en rolle sammen, enten fordi de er plassert på samme trasé, eller fordi de er uttrykt forskjellig i skjoldbruskkjertelen svulster. Den relative risiko for tyreoideacancer for første grad slektninger til probands er høyere enn det for en hvilken som helst annen ikke-mendelsk neoplasi [13] – [15], som tyder på en sterkere genetisk komponent til dens etiologi og derfor en mulig høyere sannsynlighet for å identifisere gen-gen interaksjoner.
Formålet med denne studien var å få et mer helhetlig syn på det genetiske grunnlaget for PTC av, på den ene siden en videre vurdering av konsekvensen av felles varianter i kandidatgener, og på den andre tester for epistatisk toveis interaksjoner mellom disse variantene. For dette formål, ble en to-trinns krets anvendte metoden, basert på en av de største differensiert tyreoideacancer pasient serie som er beskrevet så langt. Det følger med et funn satt av 609 tilfeller og 525 kontroller (serie I), og to uavhengige replikasjon serien, som består av 969 saker og 1040 kontroller (serie II og III). Vi identifiserte og gjenskapt et samspill mellom varianter i
PAX8 Hotell og
STK17B
, noe som tyder på at de kan være nye spillere i skjoldbruskkjertelkreft mottakelighet. Funksjonelle analyser bekreftet at uttrykket av disse genene er omvendt korrelert, selv om den underliggende mekanisme som fører til utvikling av kreft har fortsatt ikke klarlagt.
Resultater
Utvidet Replication Series Ytterligere Bekreft Involvering av
FOXE1
i PTC Følsomhet
Vi videre uavhengig kopiert den tidligere rapporterte tilknytning til felles variasjon i
FOXE1
genet [7]. I vår andre, mer nylig samlet spansk case-control serie (serie III), som består av 451 PTC tilfeller og 540 kontroller, fikk vi bekreftet den svært signifikant sammenheng for funksjonell variant rs1867277 i
FOXE1
promoter-regionen, under samme multiplikativ modell, med en OR (per allel) på 1,44 (95% CI = 1,19 til 1,74;
P
= 2,0 × 10
-4). Overall, basert på til sammen 1358 PTC saker og 1551 kontroller av hvit europeisk opprinnelse fra Spania og Italia, en per-allel OR på 1,45 ble estimert (95% CI = 1,30 til 1,61; P = 4,7 × 10
– 12).
Stratifisering av pasienter lanserer Antatte Undergruppe-spesifikke foreninger mellom Individuell SNPs og skjoldbrusk Cancer Risk
Etter genotyping saker og kontroller i oppdagelsen scenen, valgte vi 9 varianter som ligger på 9 forskjellige gener for inkludering i replikering scenen. Hver SNP var enten den mest signifikante tagSNP ved en gitt
locus
, eller var konsekvent forutsagt å være funksjonelt, slik som vist i tabell 1.
Den mest signifikant sammenheng i oppdagelsen trinnet ble innhentet for SNP rs2284734 i
TSHR
gen (recessiv OR = 2,64; 95% CI = 1,69 til 4,13;
P
= 1,8 × 10
-5), noe som tyder på sitt engasjement som en risikofaktor spesifikk for utvikling av klassisk PTC. Vi har også observert tegn på en undertype-spesifikk effekt for rs2687834 i
TG
gen (recessiv OR = 2,28; 95% CI = 1,50 til 3,46;
P
= 1,1 × 10
-4), noe som ytterligere antyder at tumor stratifisering synes å være en relevant aspekt å vurdere i assosiasjonsstudier. Dette er vist grafisk i figur S1. Foreningen av
TSHR
-rs2284734 med cPTC var marginalt statistisk signifikant i replikering scenen (recessiv OR = 1,42;
P
= 0,058, Tabell 1). Foreningene for de resterende 8 SNPs ble ikke kopiert.
epistatisk Interaksjon mellom
STK17B Hotell og
PAX8
i skjoldbruskkjertelen Følsomhet
Blant alle PTC tilfeller en interaksjon ble konsekvent observert i analyser av tre metoder; epistasis mellom SNP-pair rs721992 og rs6554198, som ligger i
CCDC6
og
KIT
gener henholdsvis ble oppdaget av MDR, SNPHarvester og MB-MDR (tabell 2). Men dette samspillet ble ikke kopiert i serien II og III (p = 0,13).
Når bare vurderer pasienter diagnostisert med cPTC, ble en interaksjon oppdaget av fire av de fem anvendte metoder. Dette samspillet, som involverer SNPs rs4848323 og rs1378624, som ligger i
PAX8 Hotell og
STK17B
gener, henholdsvis, hadde en tilhørende p-verdi ved MB-MDR av 0,00010 i oppdagelsen scenen og av 0,017 i replikasjonsfasen (tabell 3, figur 1). Den tilsvarende p-verdi fra den kombinerte analysen av data fra begge trinn var 0,00002, estimert av 100000 permutasjoner. Denne interaksjonen ble konsekvent observert av MB-MDR når hele PTC case-serien (inkludert alle undertyper) ble ansett (p-verdi = 0,026 og 0,045 for oppdagelsen og replikering stadier, henholdsvis).
Relative frekvenser av de ni genotypen kombinasjoner av replikert interaksjon (
PAX8 Anmeldelser –
STK17B
) er vist for saker og kontroller (rød og blå søyler, henholdsvis). Cellen som inneholder høy risiko genotype kombinasjonen er markert i lyserøde, de med lav risiko kombinasjoner i lys blå, og de med nøytrale kombinasjoner er ufarget. Figure1a – basert på oppdagelsen scenen (serie I); Figur 1b – basert på replikasjonstrinnet (serie II og III); Figur 1c -. Basert på begge trinn kombinert (serie I, II og III)
For å få funksjonelle innsikt i PAX8-STK17B samhandling, må vi først vurderes uttrykket av disse genene ved hjelp av data fra en tidligere matrise-basert studie av 63 skjoldbruskkjertelen svulster [16] og observert en invers korrelasjon (r = -0,77, p = 8,65 × 10
-14 Figur S2). Vi senere observert en gjennomført resultat i en serie av skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer fra forskjellige humane tumorer; høy STK17B uttrykk ble observert i de udifferensierte menneskelige anaplastiske skjoldbrusk celler (8505c, Hth7 og Hth83), som er preget av svært lav eller null PAX8 nivåer (figur 2).
mRNA uttrykk nivåer av både gener var bestemmes av QRT-PCR og er representert som relative enheter. Navnet på cellelinje og dens opprinnelse (follikulær, papillær eller anaplastisk) er indikert.
For å utforske forholdet mellom PAX8 og STK17B i skjoldbruskkjertelen, rotte skjoldbrusk celler ble Pax8-forstummet og STK17B uttrykk analysert. Etter en dag for midlertidig å stanse all PAX8, mRNA-nivåer av PAX8 redusert med omtrent 70% i forhold til villtypen eller siScamble transfekterte celler. Men ingen endring ble observert i mRNA nivåer av STK17B. Pax8 proteinnivåer var også lavere i de dempede celler, mens STK17b nivåer forble uendret i forhold til de siScamble transfekterte celler (fig. 3A). For å avgjøre om fraværet av en sammenheng skyldes kortsiktig karakter av taushet, ble en siPax8-stabil cellelinje generert og proteinnivåer analysert 7, 14 og 21 dager etter transfeksjon. Igjen ble en reduksjon i PAX8 nivåer funnet uten en betydelig variasjon i STK17B nivåer. (Fig. 3B).
PCCl3-celler ble forbigående (A) eller stabilt (B) stilnet for transkripsjonsfaktoren Pax8 (siPax8). Som en kontroll, ble villtype eller siScramble transfekterte celler anvendt. Uttrykket nivåer ble vurdert ved hjelp av QRT-PCR (A, øvre panel) eller western blot (A, nedre panel, og B).
Diskusjoner
Selv om antallet identifisert LPGs for follikulær celle-avledet thyroideakarsinom har økt de siste årene, er det fortsatt henger etter som for andre komplekse sykdommer. Så sent anmeldt, har foreningene vært konsekvent kopiert kun for et begrenset antall
loci product: [4], [6], og dermed en stor andel av arvbarheten av denne multifaktoriell sykdom forblir uforklart.
skjoldbruskkjertelkreft har en sterk genetisk komponent, med den relative risikoen for førstegradsslektninger av probands være den høyeste blant neoplasier ikke viser vanlig Mendels arvelover [13] – [15]. Fokus på identifisering av nye gener ved vurderingen av gen-genet interaksjonen kan derfor avsløre det minste en del av denne uforklart genetisk komponent. I de senere årene har det store antallet mottakelighet varianter er identifisert for komplekse sykdommer gitt opphav til behovet for å utføre spesifikke analyser for å vurdere deres potensielle epistatisk effekter. Betydningen av disse analysene ligger hovedsakelig i avsløring hvordan nærvær av en genetisk variant påvirker virkningen av en annen variant [17] -. [19]
Slike epistatisk analyser, i motsetning til de av hoved genetiske effekter, utgjør en beregnings og statistisk utfordring. Mange metoder har blitt utviklet for å detektere epistasis, men alle har begrensninger og deres ytelse er variabel. I tillegg kan noen av disse metodene er beregningsmessig unviable for GWAS data [20]. Siden vår studie vurderes kun 768 SNPs i gener valgt på grunnlag av deres
a priori
antatte rolle i sykdommen, var det mulig å bruke flere mer komplekse algoritmer avledet fra komplementære strategier, og dermed øke robustheten av samspillet deteksjon .
bruken av MB-MDR i den andre replikasjonstrinn underforstått flere fordeler, inkludert muligheten til å teste den eksakte epistatisk modellen identifisert i oppdagelsen trinnet, og evnen til å justere for eventuelle confounders, samt marginal SNP effekter, den sistnevnte for å unngå påvirkning på resultatene av SNP-parene som virker på rent additiv måte. Videre kan en permutasjon basert p-verdi på enkel måte oppnås ved en rimelig beregningskostnad. Det faktum at vi var i stand til å gjenskape en av de to interaksjoner oppdaget i oppdagelsen scenen er testament til påliteligheten av våre foreslåtte rørledning.
Til dags dato, en rekke studier utført med gjær modeller har identifisert utvetydig gen- gen-interaksjoner [21] – [24]. Tvert imot, forsøk på å identifisere epistatisk eller annen form for interaksjonene i human sykdom mottakelighet kun relativt nylig har begynt å gi resultater [25] – [29]. Likevel, få om noen har vært overbevisende kopiert. Denne studien har, for første gang, identifisert og uavhengig replikert en epistatisk tilknytning cPTC følsomhet vanligste variantene i to gener. Denne suksess skyldes sannsynligvis ikke bare å ha en redusert liste med kandidatgener, men også til den høye arveligheten av thyroid kreft, så vel som omhyggelig klinisk karakterisering av saken serie for å identifisere sykdoms undergrupper med minimal feil.
Vår analyse av epistasis, anvendt på en case-control studie basert på en kandidat genet tilnærming [7], har identifisert en interaksjon mellom
PAX8 Hotell og
STK17B
. Dette og fremtidige funn av epistatisk genetiske foreninger kan være det første skrittet mot en dypere biologisk karakterisering av skjoldbruskkjertelkreft.
STK17B
koder DRAK2, en serin-treonin kinase involvert i reguleringen av apoptose. Det ble opprinnelig valgt som kandidat genet for å studere basert på sin differensial uttrykk i PTC svulster i forhold til normal tyroideavev [7], [16].
PAX8
ble valgt fordi den er en velkjent thyroid transkripsjonsfaktor, relatert til differensiering skjoldbruskkjertelen, regulering av spesifikke gener, og til medfødte sykdommer [30] – [33]. Interessant nok har en fersk studie som kombinerer et genom-wide analyse av Pax8 bindingssteder med genuttrykk profiler definert apoptose som en viktig vei i henhold Pax8 regulering [34]. Selv om funksjonelle analyser utført av siRNA ikke forklare den underliggende biologiske mekanismen, har genuttrykkstudier basert på både menneskelige svulster og cellelinjer funnet en invers korrelasjon mellom
PAX8 Hotell og
STK17B
. Sistnevnte funn bekrefter funnene fra foreningen studien, noe som tyder på at disse to
loci
faktisk samhandler for å påvirke mottakelighet for cPTC. Dermed er det fristende å spekulere i at PAX8 kan spille en rolle i reguleringen av
STK17B
uttrykk, som peker til denne siste, relativt ukjent gen som en ny antatt spiller i skjoldbruskkjertelen stoffskifte.
Til slutt våre resultater for enkelte varianter i
TSHR Hotell og muligens
TG
, og epistatisk effekten av SNPs i
PAX8 Hotell og
STK17B
, alle tilsynelatende sterkere for spesifikke sykdoms subtyper, understreker hvor viktig svulst karakterisering og lagdeling i assosiasjonsstudier. Foreningen av tagSNP rs2284734 i
TSHR
med risiko for cPTC var den nest mest statistisk signifikant (OR = 2,64; 95% CI = 1,69 til 4,13;
P
= 1,8 × 10
-5), med konsistente resultater observert i replikering scenen (OR = 1,42; 95% CI = 0,99 til 2,03;
P
= 0,058). Flere studier har antydet en sammenheng mellom
TSHR Hotell og mottakelighet for å utvikle autoimmune sykdommer i skjoldbruskkjertelen [35] – [38], en av dem involverer samme tagSNP (rs2284734). En forening med Graves «sykdom har også blitt rapportert [39]. Få studier har vurdert sammenhengen mellom
TSHR Hotell og skjoldbruskkreftrisiko, og de som har, har rapportert negative resultater så langt [40], [41]. Imidlertid har tidligere studier evaluert bare et begrenset antall exonic
TSHR
varianter. Det synes for tidlig å utelukke dette
locus
i skjoldbruskkjertelkreft mottakelighet. Fine-kartlegging av regionen bør utføres for å identifisere en funksjonell variant, muligens intronic og /eller forskrifter, for å forklare vår observerte assosiasjon med cPTC.
I sammendraget, foreslår vi flere genetiske faktorer som kan forklare en del av den uavklarte arvbarheten av skjoldbruskkjertelkreft. I tillegg til å identifisere en potensiell rolle
TSHR
varianter i cPTC risiko, har vi oppdaget og uavhengig replikert for første gang en epistatisk forholdet mellom
PAX8 Hotell og
STK17B
gener i skjoldbruskkjertelkreft mottakelighet. Dette genet-genet interaksjon viser at epistatisk effekter kan spille en viktig rolle på skjoldbruskkjertelen, og kan forklare mangelen på en observert forening for hvert gen individuelt. Videre studier er nødvendig for å fastslå om gen-gen-interaksjoner kan være nyttig som risikomarkører for follikkelcelleadenom-avledet skjoldbrusk kreft, samt for andre svulster.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i samsvar protokoller godkjent av «Comité de bioética y Bienestar dyr del Instituto de Salud Carlos III» og etikkomiteen av COR (Regional Cancer Center), Padova, Italia, som godkjente denne studien
fag
Tre serier av skjoldbrusk kreft-tilfeller og kontroller ble rekruttert, som beskrevet nedenfor:..
Discovery (serie i)
Vi rekrutterte 609 tyroideacancer fra den spanske sykehuset nettverk. Disse inkluderte de viktigste thyroid follikulær-celle avledet karsinomer: 520 PTC, representert ved hoved subtypes «klassiske PTC «(cPTC; n = 304) og» follikulær variant PTC «(fvPTC; n = 146); og 69 follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom (FTC). Medullær skjoldbruskkjertelen karsinom (MTC) ble ikke inkludert i studien.
En serie av 525 kreftfrie kontroller ble rekruttert fra de samme geografiske områdene som omfattes av de involverte i studien sykehus. For både saken og styrer gjennomsnittsalderen var 46 år og det kvinnelige: mannlige kjønnsfordelingen var 4.6:1
Replication (serie II og III kombinert)
En annen case-control serie.. (serie II) består 412 PTC og 44 FTC pasienter rekruttert ved tre sykehus som ligger i Italia og 500 kontroller fra de samme tre geografiske regioner.
En tredje, uavhengig gruppe spanske skjoldbrusk kreftpasienter ble oppnådd, inkludert 451 PTC og 62 FTC, samt en utfyllende sett av 540 spanske kontroller (serie III).
Totalt replikering studien omfattet 969 skjoldbrusk kreft tilfeller av hvit europeisk opphav, inkludert 863 PTC (582 cPTC og 118 fvPTC) og 106 FTC. Deres gjennomsnittsalder var 47 år og den kvinnelige: mannlige kjønnsfordelingen var 4.4:1. Gjennomsnittsalderen på de totale 1040 kontrollene var 53 år og det kvinnelige: mannlige kjønnsfordelingen var 2.4:1
Leger fra alle deltakende sentre fullførte en detaljert klinisk spørreskjema for hver pasient som inkluderte personlig og klinisk informasjon, for eksempel. som svulst subtype og scene, samt detaljer om kirurgi, behandling og utvikling av metastaser under oppfølging.
DNA Isolering og kvantifisering
Blod eller spyttprøver ble innhentet fra alle tilfeller og kontroller. Genomisk DNA ble ekstrahert fra perifere blod lymfocytter fra automatiserte metoder i henhold til produsentens instruksjoner (Magnapure, Roche, Madrid, Spania), eller manuelt ved hjelp av standardmetoder [42]. DNA ble ekstrahert fra spytt bruker Oragene DNA Selv Collection Kit (DNA Genotek, Ottawa, Canada). DNA-konsentrasjonen ble kvantifisert i alle prøvene før genotyping bruker Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagens (Invitrogen, Eugene, OR, USA).
Gene og SNP utvalg
Ninety-sju kandidat gener var velges på en biologisk orientert måte og 768 enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) (tabell S1) ble identifisert i denne, som beskrevet tidligere [7].
SNP genotyping
SNP ble genotypet i oppdagelsen trinnet hjelp av Illumina GoldenGate® Genotyping analysen (San Diego, California, USA) system, på en Sentrix Universal-96 Array Matrix multi-sample rekke format. Genotyping for replikering scenen ble utført ved hjelp av Kaspar SNP genotyping System (Kbiosciences, Herts, UK) som tidligere beskrevet [7].
Statistical Analysis
Avgang fra Hardy-Weinberg likevekt (HWE ) for alle SNP’er ble testet i kontrollene ved hjelp av Fishers eksakte test. SNP viktigste effektene ble vurdert ved å estimere genotype-spesifikk odds ratio (OR) via ubetinget logistisk regresjon, ved hjelp homozygote av de hyppigste allelet i kontroller som referansegruppen. For hver SNP, ble den best tilpassede modell genetisk bestemt, og den tilsvarende p-verdi ble beregnet basert på statistikk Wald. Alle modellene ble justert for den antatte konfunderende faktorer alder, kjønn, og når det er relevant, country. Vi vurderte heterogenitet i per-allelet OR av skjoldbruskkjertelkreft subtype ved hjelp av en sannsynlighet-ratio test, som tidligere beskrevet [43]. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS for Windows 17.0 og Stata versjon 10®, med mindre annet er oppgitt.
metoder for å vurdere SNP-SNP Interactions
Vi testet for epistasis bruker saker fra homogen og robust representert sykdom grupper, inkludert PTC samlet og cPTC. Vi vurderte toveis interaksjoner mellom SNPs bruker fem forskjellige metoder, flerfaktordimensjoner Reduction (MDR) [44], [45], Maximum Entropy betinget sannsynlighet Modeling (MECPM) [46], SNPHarvester [47], MegaSNPHunter [48], og modell~~POS=TRUNC – Multifaktor dimensjoner Reduction (MB-MDR) [49]; se Metoder S1). Vi justert for kjønn og alder i oppdagelsen scenen, der det er tillatt ved metoden i spørsmålet. Bare interaksjoner (SNP par) identifisert ved minst tre metoder ble valgt for replikering i serie II og III. Vi brukte MB-MDR å teste i replikering scenen epistatisk modell identifisert i oppdagelsen scenen (se Metoder S1). Alder, kjønn og land ble inkludert som kovariater. MB-MDR tildeler hver av de ni mulige kombinerte to-SNP genotyper til tre risikokategorier (høy, lav, og nøytrale) med logistisk regresjon. Vi inkluderte alder, kjønn og land som kovariater og beregnet p-verdier basert på en permutasjon test [44], [45]. Replication interaksjoner ble vurdert ved å tvinge genotypen kombinasjoner inn i risikoklasser bestemmes i oppdagelsen scenen. Interaksjoner med en tilhørende p-verdi 0,05 ble ansett kopieres. En lignende strategi ble brukt til kombinerte data fra begge trinn for replikert interaksjoner.
funksjonelle analyser
Cell kultur.
Cellelinjer var velvillig donert av Dr. Heldin (SW1736, Hth7 og Hth83 [50]), Dr. Fagin (WRO [51]) og Dr. Fusco og Dr. Santoro (BCPAP [52] og TPC-1 [53]), eller hentet fra den tyske Innsamling av mikroorganismen og Cells Kultur (Cal62, 8505c) og den europeiske samling av cellekultur (NthyORI, FTC133). Alle cellelinjer ble genetisk fingeravtrykk og bekreftet å være unik og thyroid opprinnelse [54].
PCCl3 celler er en sammenhengende linje av rotteskjoldbruskkjertelen follikulære celler som uttrykker skjoldbruskspesifikke transkripsjon faktorer Nkx2.1, Foxe1, og Pax8. De ble dyrket i Coon s modifikasjon av Hams F-12 medium, supplert med 5% donor kalveserum og en seks-hormon blanding [55].
De humane cellelinjer som ble brukt var avledet fra normal tyroideavev eller fra follikulær , papillær eller anaplastisk skjoldbruskkjertelen karsinom. 8505c, WRO og SW1736-celler, så vel som NthyORI3.1 kontrollcellene ble dyrket i RPMI-medium, mens FTC133, TPC1, BCPAP og Cal62 celler ble vekst i DMEM-medium, og Hth7 og Hth83 celler i MEM-medium. Alle medier ble supplert med 5% føtalt bovint serum.
Generering av PCCl3-Pax8-forstummet skjoldbrusk celler.
stanse av Pax8 ble utført i PCCl3 celler enten forbigående eller stabilt. Transient transfeksjon ble utført ved hjelp av DharmaFECT en siRNA transfeksjon reagens både for kryptert og for
Pax8
siRNA forhold (Dharmacon, Denver, CO). Stabil kort hårnål RNA (shRNA) ble oppnådd ved infeksjon med pGIPZ lentivirale plasmid inneholdende den interfererende sekvensen av puromycin-resistente Pax8 eller dets kontroll (scramble) (Åpen Biosystem, Denver, CO).
Totalt RNA ble fremstilt fra kontroll (villtype) og fra forbigående-Pax8-forstummet celler (si
Pax8
eller egge siRNA) ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens anbefalte protokoll; semikvantitativ RT-PCR ble deretter utført som tidligere beskrevet [56] med spesifikke primere for Pax8 (
fremover
CAAGGTGGTGGAGAAGATTG og
omvendt
GAGGTTGAATGGTTGCTG), STK17B (
fremover
CCTGAGTTGGCTGAAATG og
omvendt
TCTGTTGCTGTGGTAATGGG) eller βactin (
fremover
CACTCTTCCAGCCTTCCTT og
omvendt
CTCGTCATACTCCTGCTTGCT).
Validering av Pax8 taushet STK17B uttrykk ble testet enten ved RT-PCR eller ved Western blot ved anvendelse av et polyklonalt Pax8 museantistoff (Biopat, Milano, Italia) eller et humant antistoff STK17B (RD System, Minneapolis, MN), henholdsvis. βactin nivåer ble brukt som lasting kontroll etter immunoblotting med et spesifikt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Subtypesamlinger spesifikke Manhattan tomt representasjoner av forskjellene i allel frekvenser mellom saker og kontroller i oppdagelsen serien. Øvre panel:. Klassiske PTC
vs
kontroller; Nedre panel: follikulær variant av PTC
vs
kontroller.. Uthevede områder svarer til de varianter av
TSHR
og
TG
, spesifikt knyttet til hver av de nevnte PTC-undertyper, henholdsvis. Den innsatte Tabellen viser resultatene for de to øverste varianter i deres spesifikke undergrupper, samt korrespondent
P
-verdier avledet fra sannsynligheten-ratio testen, og dermed demonstrerer subtype-spesifisiteten av
TSHR
og
TG
foreninger
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074765.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Unsupervised clustering for PAX8 og STK17B sonder i vår tidligere utgitt mRNA utvalg, inkludert 63 skjoldbrusk svulster (Montero-Conde et al, 2008- ref. 26). En signifikant invers korrelasjon er observert (r = -0,77, p = 8,65 × 10
-14). Forkortelser: PTC = Papillary thyroideakarsinom; FVPTC = follikulær variant av PTC; FTC = Follicular thyroideakarsinom; FA = Follikulære Adenom; PDTC = Dårlig differensiert tyreoideakreft; ATC = Anaplastisk thyroideakarsinom; N = Normal Thyroid
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074765.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
oversikt over SNPs studert i oppdagelsen serien; Eksporter doi:. 10,1371 /journal.pone.0074765.s003 plakater (DOC)
Metoder S1.
Kort beskrivelse av metodene som brukes til å oppdage epistatisk interaksjoner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074765.s004 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne takker Leticia de la Vega for utmerket teknisk assistanse, samt Javier Maravall, Ignacio Ramos, Víctor Andía, Paloma Rodríguez-Poyo, Amparo Meoro, Luis Arribas, Pedro Iglesias, Javier Caballero, Joaquín Serrano, Antonio pico, Francisco Pomares, Gabriel Giménez, Pedro López-Mondéjar og Cristina Álvarez-Escola, som har bidratt til rekruttering av pasienter og innsamling av klinisk informasjon. Vi takker også Dr Erik Heldin (Rudbeck Laboratory, Uppsala, Sverige) Dr. James A. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA) og Dr. Alfredo Fusco og Dr. Maximo Santoro (Universita Federico II di Napoli, Napoli, Italia) for å gi cellelinjer.
