Abstract
Bakgrunn
Intra-tumor steroidogenesis og konstituerende androgen reseptor (AR) aktivitet har vært forbundet med kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Denne studien hadde som mål å undersøke om CRPC benmetastaser uttrykt høyere nivåer av steroid konvertere enzymer enn ubehandlede benmetastaser. Steroidogenic enzym nivåer ble også analysert i forhold til uttrykk for konstitutivt aktive AR varianter (AR-Vs) og kliniske og patologiske variabler.
metodikk /hovedfunnene
Ubehandlet, hormon-naive (HN , n = 9) og CRPC benmetastaser prøver (n = 45) ble oppnådd fra 54 pasienter med metastase kirurgi. Ikke-maligne og maligne prostataprøver ble kjøpt fra 13 prostatektomi prøver. Transkripsjon og proteinnivåer ble analysert ved real-time RT-PCR, immunhistokjemi og immunoblotting. ble påvist noen forskjeller i steroidogenic enzym nivåer mellom CRPC og HN-skjelettmetastaser. Betydelig høyere nivåer av SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, og HSD17B10 mRNA ble imidlertid funnet i skjelettmetastaser enn hos ikke-ondartede og /eller ondartet prostatavevet, mens CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, SRD5A2 og HSD17B6 mRNA nivåer i metastaser var betydelig lavere . En undergruppe av metastaser uttrykte svært høye nivåer av AKR1C3, som ikke var på grunn av genamplifikasjon som vurdert av kopitallet variasjon assay. Ingen sammenheng ble funnet mellom AKR1C3 uttrykk og kjernekraft AR farging, tumor celleproliferasjon eller pasient utfall etter metastaser kirurgi. Med kun ett unntak, ble høy AR-V protein nivåer funnet i benmetastaser med lave AKR1C3 nivåer, mens metastaser med høye AKR1C3 nivåer primært inneholdt lave AR-V nivåer, noe som indikerer forskjellige mekanismer bak kastrering-motstand i enkelte skjelettmetastaser.
Konklusjon /Betydning
Induced kapasitet til å konvertere binyre-kjertel avledet steroider inn mer potente androgener ble angitt i en undergruppe av PC benmetastaser. Dette var ikke forbundet med CRPC men bare med avansert stadium av metastaser. Undergrupper av benmetastaser kunne identifiseres i henhold til deres uttrykk nivåer av AKR1C3 og AR-Vs, som kan være av betydning for pasientens respons på to
nd linjen androgen-deprivasjon terapi
Citation. Jernberg E, Thysell E, Bovinder Ylitalo E, Rudolfsson S, Crnalic S, Widmark A, et al. (2013) Karakterisering av prostatakreft skjelettmetastaser Ifølge uttrykk nivåer av Steroidogenic Enzymer og androgen Receptor Splice Varianter. PLoS ONE 8 (11): e77407. doi: 10,1371 /journal.pone.0077407
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: May 14, 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 07.11.2013
Copyright: © 2013 Jernberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet, den svenske Kreftforeningen, Cancer Research Foundation i Nord-Sverige, Løve Cancer Research Foundation, og Umeå universitet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
førstelinjebehandling for pasienter med avansert prostatakreft (PC) er androgen deprivasjon terapi (ADT). Denne terapien er effektivt i de fleste pasienter, men etter en periode med innledende remisjon svulster generelt tilbakefall, hovedsakelig i bein, og blir deretter kalt kastrering-resistent PC (CRPC).
Til tross for lave sirkulerende nivåer av androgener i kastrerte menn flertallet av CRPC svulster viser androgen reseptor (AR) aktivitet og uttrykk av AR regulerte gener [1]. Mulige mekanismer bak AR-aktivitet i CRPC omfatter AR genamplifisering og mutasjoner, intra-tumoral syntese av androgener, og ekspresjon av konstitutivt aktive AR spleisevarianter [2], [3]. Særlig noen CRPC svulster og enkelte kreftceller i de fleste pasienter, viser svært lav eller fravær av kjernefysisk AR farging, og faktorer down-stream AR er ikke nødvendigvis oppregulert i de tilfeller [4], [5], [6] , [7]. Vi har nylig preget en rekke hormon naive (HN) og CRPC skjelettmetastaser hos pasienter i henhold til AR aktivering og uttrykk for AR spleisevarianter (AR-Vs) [5], [8]. Nivåer av AR-V7 (også betegnet AR3) [9], [10] og AR-V567es [11] varianter ble øket i CRPC sammenlignet med HN-metastaser, og dessuten funnet å være sterkt uttrykt i en sub-gruppe av CRPC pasienter med spesielt dårlig prognose [8]. AR-V7 og AR-V567es mangler ligand-bindende domene (LBD) og har konstituerende aktivitet [9], og pasienter uttrykker de AR-Vs vise sannsynligvis dårlig respons på ADT og anti-AR legemidler rettet mot LBD. Noen CRPC pasienter imidlertid svare på to
nd linjen ADT og dette kan være på grunn av intra-tumor steroidogenesis og produksjon av testosteron, dihydrotestosteron (DHT), eller andre androgener på nivåer høyt nok for AR aktivering, som rapportert av andre [13 ], [14], [15], [16]. Det er imidlertid ikke kjent når disse steroidogenic enzymene er oppregulert. Er de økte allerede i tidligere ubehandlede HN metastaser, eller som AR-Vs [8] økte som følge av kastrering behandling? Et av målene med denne studien var derfor å analysere ekspresjon av steroid-konverterende enzymer potensielt er involvert i syntesen av testosteron og DHT i et sett av HN og CRPC benmetastaser oppnådd fra pasienter med metastase kirurgi. Videre ble enzym uttrykk nivåer analysert i forhold til uttrykk for AR-Vs, for å identifisere potensielle ulike mekanismer bak CRPC i enkelte skjelettmetastaser.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av den lokale etikk gjennomgang styret i Umeå universitet og deltakerne ga skriftlig eller muntlig samtykke. På grunn av den akutte situasjonen når bein metastase operasjonen er utført for å lettelse ryggrad symptomer og pareser, gjør logistikken ikke alltid at skriftlig samtykke og den lokale moral vurdering styret derfor spesielt godkjent også muntlig samtykke. Muntlig samtykke er dokumentert av lege i pasientens journal.
Pasienter
Bone metastase vev er hentet fra serien av ferske frosne og formalinfiksert biopsier innhentet fra pasienter med PC operert for metastatisk rygg ledningen komprimering eller patologiske frakturer ved Umeå universitetssykehus (2003-2011). Kliniske karakteristika og terapier er oppsummert i tabell 1, og denne pasient serien har blitt tidligere beskrevet i Crnalic et al [5], [17], [18]. Studien inkluderer også 13 pasienter som ble behandlet med radikal prostatektomi ved Umeå Universitetssykehus, mellom februar 2005 og september 2006. Median alder for pasientene var 60 år (spredning 48-68 år) og median PSA var 6,6 ng /ml (variasjon 3,5 -24 ng /ml). Elleve av de pasientene hadde svulster gradert som Gleason score (GS) 7 og to som GS 8. Fire av svulstene var i stadium T2 og ni i scene T3. Ytterligere informasjon om vev håndtering har tidligere blitt beskrevet i Hornberg et al [8].
Prøvepreparering
Representative deler av skjelettmetastaser, primære PC og ikke-ondartet prostatavevet var cryo -sectioned inn i ekstraksjonsrør og RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol-protokollen (Invitrogen, Stockholm, Sverige) eller AllPrep DNA /RNA /Protein Mini Kit (Qiagen, Sollentuna, Sverige). For tilfeller var DNA og protein ble analysert i parallell med RNA, ble nukleinsyrer og proteiner isolert fra de samme vev seksjoner ved hjelp av AllPrep metoden. Prosentandelen av tumorceller i prøvene var over 50% i de fleste tilfeller. RNA og DNA-konsentrasjonene ble kvantifisert ved absorbans-målinger ved hjelp av et spektrofotometer (ND-1000 spektrofotometer; Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce Chemical Co., IL, USA). RNA kvalitet ble analysert med 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og bekreftet å ha en RNA integritet nummer ≥6.
Real time RT-PCR
RNA var vendt fra transkribert med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et totalt volum på 10 pl. Den påfølgende PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), eller ABI PRISM 7900HT Instrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) i et totalt volum på 20 pl ved bruk av IQ SYBR grønne Supermix (Bio-Rad Laboratories) eller TaqMan genuttrykk Mastermix (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige) i henhold til produsentens protokoller. Primersekvensene er vist i tabell S1. Hver prøve ble kjørt i duplikat og justert for de tilsvarende RPL13A mRNA-nivåer. Smelting kurve analyse bekreftet de amplifiserte produkter, som ble også analysert ved 1% agarosegelelektroforese for å bekrefte den forventede størrelse (data ikke vist).
Immunhistokjemi
Prøvene ble fiksert i bufret formalin, decalcified i maursyre, og innstøpt i parafin [5]. Fem um paraffin-snitt ble deparaffinized i henhold til standardprosedyrer, kokt i 0,01 M citratbuffer, pH 6,0, og immunofarget for AKR1C3 (NP6-G6.A6, fortynnet 1:1000, Sigma, St. Louis, Missouri, USA), AR (PG -21, fortynnet 1:25, Upstate, Lake Placid, NY, USA), PSA (A0562, fortynnet 1:2000, DAKO, Glostrup, Danmark) og Ki67 (MIB1, fortynnet 1:50, DAKO) med Ultra Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems). Nuclear AR og cytoplasmatic AKR1C3 og PSA flekker i tumor epitelceller ble scoret i henhold til intensitet (0 = ingen farging, 1 = svak, 2 = moderat, 3 = intens farging) og fraksjon av fargede celler (1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%). En totalscore (som varierer fra 0-12) ble oppnådd ved å multiplisere de fargeintensitet og fraksjons score. Ki67 ble scoret av evaluering 300-1000 kreft epitelceller per pasient, som beskrevet tidligere [5].
Kopier nummer analyse
Kopien nummeret på AKR1C3 genet i PC-skjelettmetastaser ble undersøkt ved hjelp av den Hs03060693_cn og Hs02574521_cn TAQMAN kopi tallanalyser (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige), målretting AKR1C3 ekson 2 og ekson 7, henholdsvis. Analysene ble gjennomført i henhold til produsentens beskrivelse, med RNaseP som referanse genet, og analysert ved hjelp av Kopier Caller programvare (Applied Biosystems).
Immunoblotting
22Rv1 celler ble vedlikeholdt i henhold til produsentens instruksjoner ( ATCC), og proteinet ble ekstrahert som ovenfor. Prøver (10 ug protein) ble separert ved 7,5% SDS-PAGE under reduserende betingelser og deretter overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble blokkert i 5% melk, etterfulgt av primær antistoff inkubering i 4 ° C over natten (N-20-antistoff, fortynnet 1:500 i 1% melk /PBST, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) for å detektere den fulle lengde AR og ca 80 kDa avkortet AR-Vs med intakte N-terminaler. Den sekundære anti-kanin-IgG (Dako, Glostrup, Danmark) antistoff (fortynnet 1:20 000 i 2,5% melk) ble påført etter vasking i PBST og inkubert i 1 time i romtemperatur. Protein uttrykket ble visualisert etter omfattende vask med ECL Avansert målesett (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Filtrene ble deretter strippet, i henhold til standard prosedyrer og analysert for aktin proteinnivåer ved å bruke kanin anti-actin-antistoff fra Sigma (St. Louis. Missouri), fortynnet 1:8000, for å sikre lik prøve lasting. ECL signalene ble kvantifisert ved hjelp av en ChemiDoc skanneren og Antall One 4 programvare (Bio-Rad Laboratories). Intensiteten av 80 kDa-båndet i hver pasientprøve ble analysert og uttrykt i forhold til den tilsvarende full lengde AR bånd intensitet. Den 22Rv1 celleekstrakt ble drevet som en positiv kontrollprøve på hver gel.
Statistisk analyse
Korrelasjon mellom variabler ble analysert ved hjelp av Spearman rank test. Gruppene ble sammenlignet med Mann-Whitney U test for kontinuerlige variabler og Chi-kvadrat test for kategoriske variabler. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført med døden til PC som hendelse og oppfølging tid som tiden mellom metastasekirurgi og den siste oppfølgingsundersøkelse (desember 2012). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap, SPSS 20,0 programvare (SPSS, Inc, Chicago, USA). En P-verdi mindre eller lik 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Ingen induksjon av steroidogenic enzymer i kastrering-resistente mot hormon naive benmetastaser
genuttrykk nivåer av nøkkelenzymer som er involvert i dannelsen av testosteron og DHT fra kolesterol (figur 1) ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR-analyse av HN (n = 9) og CRPC skjelettmetastaser (n = 45) i sammenligning med primær randsone prostata tumor (n = 13) og ikke-ondartet prostatavevet (n = 13).
Enzymer med betydelig høyere mRNA nivåer observert i skjelettmetastaser enn hos ikke-ondartede og /eller ondartet prostatavevet er vist i fet skrift og enzymer med betydelig lavere nivåer observert i skjelettmetastaser er vist i
kursiv
. Steroider skilles ut av binyrene er uthevet i grått.
Ingen av de analyserte enzymer i steroidogenesis pathway (figur 1 og 2) viste signifikant forskjellige mRNA uttrykk nivåer mellom HN og CRPC skjelettmetastaser (for sammenligning mellom metastaser og prostatavevet se nedenfor). Variasjonen mellom ulike CRPC metastaser var imidlertid stor, og ble observert personer med særlig høy uttrykket av spesifikke steroidogenic enzymer i CRPC gruppen (figur 2).
Alle mRNA nivåer ble korrigert for mRNA nivåer av husholdningsgenet RPL13A og normalisert til medianverdien av de primære tumorprøver. * P 0,05. ** P 0,01, *** P 0,001. Åpne sirkler indikerer uteliggere og ekstreme. X indikerer ekstreme nivåer utenfor skalaen.
Prostatakreft benmetastaser kan konvertere svake sirkulerende androgener til mer potente seg, men sannsynligvis har lav generell kapasitet for de-novo steroidogenesis
Transcript nivåer enzymer i de tidlige trinnene av steroid ble redusert i HN og CRPC skjelettmetastaser sammenlignet med ikke-ondartet prostatavevet (figur 2); median CYP11A1, CYP17A1, og HSD3B2 mRNA-nivåer var 0,15, 0,29 og 0,32 ganger HN og 0,14, 0,32 og 0,31 ganger CRPC skjelettmetastaser sammenlignet med nivåene i ikke-ondartet prostatavevet (P = 0,004, 0,025 og 0,071, og p = 0,00004, 0,019 og 0,01, henholdsvis). Median CYP11A1 mRNA-nivå i CRPC metastaser var 0,41 ganger i forhold til nivået i den primære tumorvevet (P = 0,011, figur 2), mens den CYP17A1 og HSD3B2 mRNA-nivåer i CRPC skjelettmetastaser var ikke signifikant forskjellig fra nivået i den primære svulstvev. Men CYP11A1 mRNA nivåer ble korrelert til tilsvarende CYP17A1, HSD3B2, SRD5A1 og SRD5A2 mRNA nivåer i CRPC metastaser (Rs = 0,80, P 0,000001, Rs = 0,740, P 0,000001, Rs = 0,53, P 0,0002, og Rs = 0.70, P . 0,000001), noe som indikerer at de første trinnene i steroidogenesis kan være aktive i enkelte metastaser
Transcript nivåer av mange enzymer involvert i senere trinn av androgen syntese ble økt i metastaser sammenlignet med ikke-ondartet prostata og primær svulstvev (figur 2). Median AKR1C3 og AKR1C2 mRNA-nivåer var 5,5 og 5,4 ganger høyere i HN (P = 0,03, p = 0,007) og 3,7 og 5,8 ganger høyere i CRPC benmetastaser (P = 0,0006, P = 0,00008), respektivt, sammenlignet med primære prostatakreft. Vi har observert en forskyvning fra SRD5A2 til SRD5A1 mRNA-ekspresjon med progresjonen fra ikke-ondartet prostata til PC og PC metastasering (figur 2), som er i samsvar med resultatene i tidligere studier [14], [15], [19]. En tilsvarende dreining fra primært HSD17B6 ekspresjon i ikke-ondartede og primærprostatatumorvevet til hovedsakelig HSD17B10 ekspresjon i PC-metastaser ble videre notert (figur 2). De AKR1C3 mRNA nivåer var signifikant korrelert til AKR1C2 og UGT2B15 mRNA nivåer (Rs = 0,39, P = 0,008 og Rs = 0,49, P = 0,001).
Til sammen disse resultatene tyder på at PC-skjelettmetastaser hos pasienter kan har indusert kapasitet til å konvertere androgener med lav AR affinitet til mer potente androgener, mens
de novo
syntese av androgener fra kolesterol er mindre sannsynlig.
Noen benmetastaser uttrykke svært høye nivåer av AKR1C3
Selv om ingen av de undersøkte steroidogenic enzymer viste signifikant økt uttrykk nivåer i CRPC forhold til HN skjelettmetastaser, ble enkelte CRPC metastaser kjent for å uttrykke svært høye transkripsjonsnivåer (figur 2). Ett enzym som viser spesielt høye mRNA nivåer i en undergruppe av CRPC metastaser var AKR1C3. Ettersom dette enzymet har kapasitet til å konvertere sirkulerende DHEA og androstendion (syntetisert i binyrene) til 5-androstenediol og testosteron, ble det ansett å være av spesiell interesse.
For å avgjøre om de AKR1C3 mRNA nivåer i metastaser ble reflektert i de tilsvarende protein nivåer, vurdert vi AKR1C3 protein uttrykk ved immunhistokjemi og ved hjelp av et poengsystem som tok både fargeintensitet og distribusjon i betraktning (figur 3). Cytoplasmatiske AKR1C3 farging ble påvist i de fleste tumor epitelceller mens kjernefysiske farging var heterogent observert og ikke scoret. Alle metastaser viste sterk positiv farging i de endoteliale celler, mens variabel farging ble observert i fibroblaster og hematopoetiske celler i benmargen. Den AKR1C3 farging totale poengsummen ble sterkt korrelert til AKR1C3 mRNA nivåer i de tilsvarende metastaser (Rs = 0,73, P 0,000001, n = 51). Høy AKR1C3 uttrykk var ikke på grunn av AKR1C3 genamplifisering, ifølge AKR1C3 genkopitallet analyse av 6 metastaser prøver (3 prøver med ekstreme AKR1C3 mRNA nivåer og totale farging score til 12 og 3 prøver med lav AKR1C3 uttrykk) i forhold til to ikke- maligne prostataprøver (data ikke vist).
En total poengsum (alt fra 0-12) ble oppnådd ved å multiplisere poengsummen fargeintensitet (0-3) i svulsten epitelceller med positive brøkdel poengsum (1 -4). (A) Histogram henhold til total AKR1C3 flekker score i hormon-naive (grå) og kastrering-resistente (svart) benmetastaser. (B) Representant delen av beinmetastaser med AKR1C3 total poengsum 0. (c) Representant delen av beinmetastaser med AKR1C3 total poengsum 12. Bar indikerer 100 mikrometer.
I CRPC skjelettmetastaser, den AKR1C3 total farging Poengsummen ble korrelert til UGT2B15 mRNA nivåer (Rs = 0,39, P = 0,009, n = 43), som kan tyde på DHT produksjon i metastaser med høy AKR1C3 protein uttrykk. Det var imidlertid tydelig at høy AKR1C3 protein uttrykk ikke var direkte knyttet til høyt AR aktivitet i CRPC metastaser; 14 av 18 (78%) prøver med høy AKR1C3 flekker score, definert som en AKR1C3 farging score over median (6) og 15/25 (60%) prøver med lav AKR1C3 flekker score (≤6) viste høy kjerne AR farging score (≥8, over median som definert i [5], p = 0,22). I samsvar med tidligere resultater [5], ble høy AR farging i metastaser i forbindelse med kortere kreftspesifikk overlevelse etter metastasekirurgi (log-rank = 8.1, P = 0,004, n = 45). I motsetning til dette, var det ingen sammenheng funnet mellom AKR1C3 farging og kreftspesifikk overlevelse av CRPC pasienter etter metastasekirurgi (data ikke vist). Det ble også observert noen sammenheng mellom AKR1C3 farging score og Ptil flekker score (data ikke vist) eller indeks tumor celleproliferasjon (Ki67 farging score, data ikke vist).
Expression of steroidogenic enzymer i forhold til nivåer av androgen reseptor spleisevarianter
AR protein nivåer ble studert av immunoblot analyse av 29 CRPC benmetastaser valgt basert på AR immunhistokjemi resultater å inkludere AR lav til AR høy poengsum metastaser, og hvor tilstrekkelig vev gjensto å tillate immunoblot analyse. Den fulle lengde av AR omtrentlig 110 kDa ble påvist i de fleste tilfeller, mens avkortet AR-Vs på ca. 80 kDa, antatt å representere AR spleisevarianter som mangler den LBD C-terminale domene, ble detektert i noen tilfeller (figur 4). Intensiteten av 80 kDa-båndet var sterkt korrelert til tilsvarende AR-V7 mRNA nivå (Rs = 0,76, P 0,000002, data ikke vist), i samsvar med egne tidligere resultater [8]. I Berg et al [8] pasienter med høye nivåer av metastase AR-V7 mRNA, definert til å ha mRNA-nivåer i den øvre kvartil, ble funnet å ha ekstremt dårlig prognose. Basert på denne kunnskap, og ved hjelp av en tilsvarende fremgangsmåte ble 7 prøver analysert ved immunoblotting definert til å uttrykke høye nivåer av AR-Vs som forholdet mellom intensitetene av 80 og 110 kDa-båndene ble funnet i 75
persentil av dataene (≥0.5).
Analysen ble utført ved anvendelse av et antistoff rettet mot den N-terminale domenet av AR. Den 22Rv1 celleekstrakt ble inkludert som en positiv kontroll.
Interessant, viste bare en av 13 (7,8%) CRPC metastaser med høy AKR1C3 uttrykk (farging poengsum over medianen) også høy AR-V protein nivåer. Dette var en betydelig lavere andel enn det som finnes mellom metastaser med lave AKR1C3 nivåer (6/15, 40%, P = 0,049). Vi videre en hypotese om at svulst celle uttrykk for AKR1C3 og konstitutivt aktive AR varianter kan være av betydning for den enkelte tumor respons på to
nd linje ADT og klinisk progresjon [8], og de 28 skjelettmetastaser vurderes for både AKR1C3 og AR-V uttrykket ble derfor delt i henhold til deres AR-V og AKR1C3 protein uttrykk nivåer, som vist i figur 5, for å demonstrere undergrupper av mulig klinisk relevans.
Høye nivåer AKR1C3 utgangspunktet ble funnet i metastaser med lav nivåer av AR-Vs og vice versa (P = 0,049, ifølge Chi-kvadrat test).
Spesielt, ingen av metastaser med homogen AKR1C3 flekker, dvs. brøkdel av positivt fargede celler over 75% viste høye AR-V nivåer sammenlignet med 7/15 metastaser med 75% positivt fargede celler (P = 0,004). Denne observasjonen fortjener å bli videre undersøkt, så det kan tyde på at høy AR-V nivåer indusert foretrekke i svulster celler uten endogen steroidogenesis. Dessverre var vi ikke i stand til å studere dette en hypotese heterogenitet blant kreftceller som antistoffer for immunhistokjemisk evaluering av AR-Vs ikke var tilgjengelig.
Diskusjoner
Intra-tumor syntese av testosteron og DHT har vært foreslått å bidra til CRPC vekst. I denne studien sammenlignet vi uttrykk nivåer av steroidogenic enzymer i CRPC benmetastaser med nivåer i metastaser hentet fra ikke-behandlede pasienter og, overraskende, fant ingen induksjon av de undersøkte enzymene i CRPC forhold til HN metastaser. Vi har imidlertid funnet høye uttrykk nivåer av visse steroidogenic enzymer; SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, og HSD17B10, i benmetastaser sammenlignet med ikke-ondartet prostatakreft og primærprostata svulstvev. Videre kunne vi vise tydelige forskjeller i uttrykk nivåer av AKR1C3 og nivåer av AR spleisevarianter i enkelte tilfeller av CRPC skjelettmetastaser, som vi hypoteser kan være av betydning for pasientens respons til 2
nd linje terapi.
Tissue androgener kan utledes ved
de novo syntese
fra kolesterol [20], [21], eller ved omdannelse av adrenal forløpere til mer potente steroider [22]. Våre resultater viser generelt høye nivåer av AKR1C3 og SRD5A1 i metastaser er i samsvar med tidligere rapporter [14], [15], [16] og kan tyde på syntesen av testosteron og DHT i ett og to trinn, henholdsvis fra adrenal-avledet androstendion . Av aktiviteten til SRD5A1, kan DHT også syntetiseres via 5α-reduksjon av androstendion til androstandion og deretter ved ytterligere reduksjon av androstandion til DHT ved AKR1C3. Denne ruten for DHT syntese, som forbigår testosteron, ble nylig vist av Chang og medarbeidere til å dominere i CRPC cellelinjer så vel som i pasientmetastaser eksemplarer stimulert med androstendion [23]. I tillegg de høye nivåene av AKR1C2 og HSD17B10 gjøre DHT syntese via androsterone og androstanediol mulig i enkeltsaker, i likhet med hva som har blitt observert i PC-cellelinjer så vel som i kastreringsresistent CWR22R transplantater på mus [24]. Intra-tumor syntese av androsterone og androstanediol kan stimulere tumorvekst, ikke bare som mellom steroider i DHT syntese, men også som kraftige AR aktivatorer i tilfeller med muterte ARS [25]. Likeledes kan androstenediol, presumingly produsert fra DHEA i metastaser med AKR1C3 aktivitet, aktivere ARS med spesifikke mutasjoner [26]. I motsetning til tidligere rapporter [14], [15], men på linje med Hofland og medarbeidere [16], fant vi lave nivåer av CYP11A1, CYP17A1 og HSD3B2 i både ubehandlede og CRPC metastaser. Høy CYP11A1, CYP17A1 og HSD3B2 mRNA nivåer i stedet ble funnet i ikke-ondartet prostatavevet, sannsynligvis på grunn av høy syntese av disse enzymene i normale prostata stromale celler, og det samme gjaldt for SRD5A2 og HSD17B6 [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Fra dette ønsker vi å konkludere med at adrenal-avledet androgener trolig bidra til vekst av CRPC benmetastaser av sine intra-metastatisk konvertering til mer potente androgener, mens
de novo
syntese av androgener fra kolesterol innenfor metastaser er mindre sannsynlig , bortsett fra kanskje i enkelte tilfeller med korrelerte uttrykk for CYP11A1, CYP17A1, og HSD3B2.
Vi fant høy uttrykk nivåer av AKR1C3 i en undergruppe av PC-skjelettmetastaser, som bekrefter resultater tidligere rapportert i kastrering-resistente primær prostatakreft [16], [31] og CRPC vev av forskjellig opprinnelse metastatisk [14], [15], [32]. En økning i AKR1C3 aktivitet kunne tydeligvis bidrar til omdannelsen av adrenal-avledede steroider til mer potente AR ligander, som diskutert ovenfor, og til AR aktivering i CRPC. Likeledes, Hamid og medarbeidere viste AKR1C3 avhengig syntese av testosteron i CRPC celler stimulert med DHEA [31]. Gunstige effektene av høye AKR1C3 nivåer i HN metastaser eller i metastaser med lav atom AR farging, som demonstrert for noen tilfeller i denne undersøkelsen, er mindre klart, men kan være avhengig av andre reaksjoner drevet av dette enzymet. I tillegg til 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD) aktivitet AKR1C3 besitter også prostaglandin F (PGF) syntase aktivitet som ville føre til spredning i PC-celler uavhengig av androgen og AR status som følge av dannelsen av PGF epimerer og aktivering av FP-reseptoren og også ved forebygging av PGJ2 dannelse og dens pro-differensierende og anti-proliferative effekter [33].
i konklusjonen, ønsker vi å understreke at økt tumor uttrykk for steroidogenic enzymer i den enkelte pasient er ikke klart forbundet med CRPC men bare i forbindelse med avansert tumorstadium, som det kan sees ikke bare i CRPC vev av forskjellig opprinnelse [14], [15], [16], [31], [32], men også i tidligere ubehandlet, HN, skjelettmetastaser (denne studien). Videre denne studien sammen med tidligere studier indikerer at CRPC svulster kan bli klassifisert i henhold til forskjellige uttrykk mønstre av steroidogenic enzymer, og dermed sannsynligvis ulike mekanismer bak kastrering-motstand (denne studien og [16], [32], [34]). Vi i tillegg viser at undergruppe av CRPC benmetastaser uttrykker høye nivåer av AKR1C3 er i stor grad forskjellig fra den undergruppen som uttrykker høye nivåer av LBD-avkortet, konstitutivt aktiv AR-Vs. Den mulige kliniske relevansen av dette er at pasienter med høyt AKR1C3 uttrykk og lav AR-V uttrykk kan være pasienter som viser god respons på behandling med abirateronacetat (CYP17 hemming, [35]) og /eller vil ha nytte av medikamenter rettet mot AKR1C3 [36] , mens pasienter med høyt uttrykk for konstitutivt aktiv AR-Vs sannsynligvis ikke vil svare på abirateronacetat eller på all behandling rettet mot androgen syntese eller LBD av AR.
En begrensning i dette arbeidet er det begrenset antall bein metastaser, og dessuten den eneste metastase prøven undersøkt fra hver pasient, som selvsagt gjør konklusjoner om denne heterogene sykdom og generell pasientstatus usikker. Vi er også klar over at uttrykket nivåer reflekterer ikke nødvendigvis biologiske aktiviteter og vår hypotese om at svulsten uttrykk mønster av steroidogenic AKR1C3 og konstitutivt aktive AR varianter ville forutsi respons på to
nd linje behandling av CRPC må testes på forhånd i kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primer sekvenser for real-time RT-PCR-analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077407.s001 plakater (DOC)
Takk
Dyktig teknisk assistanse ble gitt av Ms Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom, og Inger Lindström.
