Abstract
Ingenol-3-angelate (I3A) er en ikke-tumor fremme forbolester-lignende stoff identifisert i saft av
Euphoria peplus.
Likhet med kreft fremme forbolestere, I3A er et diacylglycerol (DAG) analog som bindes med høy affinitet til C1 domener av PKCS, rekrutterer PKCS til cellemembraner og fremmer enzymaktivering. Mange anti-kreft aktiviteter har blitt tilskrevet I3A og tilskrives I3A effekter på PKCS. Vi viser her at I3A også binder seg til og aktiverer medlemmer av RasGRP familien av Ras aktivatorer som fører til robust heving av Ras-GTP og engasjement av Raf-Mek-Erk kinase kaskade. Som svar på I3A, ble rekombinante proteiner som består av GFP smeltet hver for seg til full-lengde RasGRP1 og RasGRP3 hurtig rekruttert til cellemembraner, i samsvar med direkte binding av forbindelsen til RasGRP er C1 domene. I tilfelle av RasGRP3, IA3 behandling førte til positive regulatoriske fosforylering på T133 og aktivering av kandidaten regulatoriske kinase PKCδ. I3A behandling av utvalgte B non-Hodgkins lymfom cellelinjer resulterte i kvantitative og kvalitative endringer i BCL-2 familiemedlem proteiner og induksjon av apoptose, som tidligere demonstrert med DAG analoge bryostatin 1 og dens syntetisk analog pico. Våre resultater gir ytterligere innsikt i anticancer egenskaper I3A, støtter ideen om at RasGRPs representerer potensielle kreft terapeutiske mål sammen med PKC, og utvide den kjente serien av ligander for RasGRP regulering
Citation. Song X, Lopez- Campistrous A, Sun L, tilhørte NA, Kedei N, Yang J et al. (2013) RasGRPs er mål av Anti-Cancer Agent Ingenol-3-Angelate. PLoS ONE åtte (8): e72331. doi: 10,1371 /journal.pone.0072331
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 25 februar 2013; Godkjent: 08.07.2013; Publisert: 21 august 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Forskningen ble støttet med tilskudd til JCS fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR tilskuddet MOP14630, http: //www.cihr-irsc .gc.ca), Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI tilskudd 018 453, https://www.cancer.ca/Research.aspx), Alberta Cancer Foundation (ACF gi 26050, https://albertacancer.ca), og Alberta oppfinnsomhet-Health Solutions (200100408 https://www.aihealthsolutions.ca). Forskning ble også støttet av egenutført Research Program for Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Prosjekt Z1A BC 005 270). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
diacylglycerol (DAG) er en potent andre budbringer som genereres i cellene i respons til membran-reseptor-stimulering av fosfolipid metabolisme. DAG DAG og analoger så som PMA (forbol 12-myristat 13-acetat) binder konvensjonelle og nye former av protein kinase C (PKC) gjennom en konservert domene kalt C1. Denne prosessen bidrar til PKC membran lokalisering og enzymaktivering. Langvarig eksponering for DAG analoger kan også ha negativ innvirkning PKC aktivitet gjennom indusert enzymet degradering. Noen DAG analoger, slik som PMA, er kraftige tumor-promotorer. Andre DAG analoger, slik som prostratin og bryostatin en, er ikke-tumorpromotere eller kan faktisk hemme tumorvekst. Medisin DAG-analoger som for eksempel en bryostatin utøve en rekke anti-kreft-celle og immunmodulerende effekter. Basert på oppmuntrende prekliniske data, har bryostatin en vært gjenstand for omfattende kreft kliniske studier (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=bryostatin).
En annen medisinsk DAG analog klinisk interesse er ingenol -3-angelate (I3A). I3A ble identifisert som en aktiv agent i saft av
Euphorbia peplus
, som har en historie med bruk i tradisjonell medisin, herunder behandling av hudkreft [1]. Pep005, et topikalt formulering av I3A, blir kraftig evaluert i kliniske studier (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pep005 pg=2). Pep005 har vist seg effektiv ved behandling av aktinisk keratose [2], og er utviklet for behandling av basalcellekreft og karsinomer [1]. I forskjellige eksperimentelle modeller, kan I3A indusere tumorcelle primære nekrose [3], apoptose [4] og begynnende alderdom [5]. Tumorcelle-extrinsic anti-kreft-effekter av I3A omfatter forstyrrelse av tumorvaskulatur [6], rekruttering av nøytrofiler tumorici-dal [7] og generering av cytotoksiske T-celler med tumor regresjon av aktivitet [8]. I3A binder seg til renset klassiske og nye PKC isoformer
in vitro product: [9]. I3A behandling av dyrkede celler fører til raskere utflytting av disse enzymene til cellemembraner [9]. Dermed noen av de biologiske effektene sannsynligvis oppstå fra I3A aktivering av PKCS i levende celler.
Selv om tidlig forskning på DAG og Dag analoger fokusert på deres regulering av PKC familiemedlemmer, er det nå klart at flere familier av proteiner eksisterer med homologe DAG-bindende C1-domener, og at disse familiene betjene viktige biologiske roller [10], [11]. De RasGRPs er positive regulatorer av den lille GTPase Ras. De chimerins fungere som negative regulatorer av den lille GTPase Rac, som regulerer actin cytoskjelettet. MRCK (myotonic dystrofi kinase-relaterte Cdc42 bindende kinase) signaler nedstrøms av den lille GTPase Cdc42, kontrollere filopodia dannelse og påvirke tumorinvasjon. Munc13 familiemedlemmer regulere synaptisk vesikkel membran fusion og synaptisk aktivitet. Protein kinase D familiemedlemmer spiller en nøkkelrolle i cellulær proliferasjon og levedyktighet. DAG kinaser konvertere DAG til fosfatidinsyre, demping signaliserer gjennom de oven DAG-responsive protein familier så vel som potensielt øke fosfatidsyreinnhold-responsive signalveier. Forstå selektivitet av terapeutiske midler rettet mot de DAG-bindende C1 domenene til disse andre klasser av DAG-bindende proteiner er derfor viktig for å forstå deres terapeutiske potensial og deres virkningsmekanismer.
High-nivå uttrykk for RasGRP1 og RasGRP3 viser begrenset vev distribusjon, med fremtredende uttrykk i lymfocytter [12]. En voksende mengde bevis støtter hypotesen om at en nøkkelrolle av disse proteinene skal fungere nedstrøms av immun reseptorer i B og T-celler [12]. Immun reseptor stimulering fører til fosfolipase C aktivering og DAG akkumulering i membraner. DAG påvirker RasGRP1 og RasGRP3 gjennom to koordinerte mekanismer. Først C1 domener av RasGRP1 og RasGRP3 bind DAG og forbolester [13], [14], forårsaker RasGRPs å bli rekruttert til cellemembraner hvor de møter deres substrat, lipidert Ras. Sletting av C1 domene fører til tap av forbolester respons [15]. I tillegg RasGRP1 og RasGRP3 gjennomgår en aktiverings fosforylering av PKC, som selv er aktivert av DAG [16] – [19]. Ras-aktivering ved RasGRPs er viktig for thymocytt differensiering, T-celle-effektor funksjon, og lymfocytt homeostase [12]. RasGRP4, som RasGRP1 og RasGRP3, også sannsynlig binder DAG og aktiverer Ras [20], [21], selv om regulering av PKC har ikke blitt dokumentert. RasGRP4 viser fremtredende uttrykk i mastceller [21], men er også funnet i andre myeloide linjer og tidlig thymocytter [22], [23].
Vi har argumentert for at RasGRPs kan utgjøre levedyktige narkotika mål som kan manipuleres med DAG analoger til klinisk gunstige ender [24]. Spesielt har vi vist at ved å velge cellelinjer avledet fra visse former av B-non-Hodgkins lymfom (NHL-b) gjennomgår apoptose når RasGRPs stimuleres med Dag analoger som bryostatin en eller syntetisk analog «pico». I utgangspunktet har vi fokusert på DAG analog-indusert apoptose i cellelinjen Toledo, som trolig oppsto fra en germinalsenter-avledet malignitet. Vi viste at apoptose skjedd innen 48 timer og involvert pro-apoptotiske fosforylering av BH3-bare protein Bim gjennom RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk vei [25]. Mer nylig oppdaget vi en andre mekanisme for apoptose som ble sett i en Burkitt lymfom (BL) avledede cellelinje BL-2, og i 5 av 6 mantle celle lymfom (MCL)-avledede cellelinjer [26]. De fleste av disse cellelinjene ble Bim-mangelfull og apoptotiske mekanismen ble forbundet stedet med kvantitative endringer i andre BCL-2 familiemedlemmer: uttrykk for pro-apoptotiske BH3-bare familiemedlem Bik økt samtidig som de anti-apoptotiske medlemmer Bcl -XL og Mcl-en redusert. Denne andre mekanismen gikk mye saktere enn det som ble observert i Toledo celler.
Her viser vi at RasGRPs er mål for I3A i dyrkede celler. Videre I3A behandling av representative B-NHL cellelinjer aktiverer de to tidligere dokumentert RasGRP kombinert mekanismer som fører til apoptose.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dyreforsøk var ferdig i henhold til protokoller godkjent av Health Sciences Animal Regler og velferds~~POS=TRUNC ved University of Alberta, i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care retningslinjer.
Reagenser
Ingenol-3-angelate ble kjøpt fra Calbiochem (La Jolla, CA) og ble oppløst i DMSO ved 1 mM. Massen ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 100 nM i medium med mindre annet er angitt og sammenlignet med tilsvarende DMSO fortynnet. MEK-hemmere og reagenser som studerer apoptose ble beskrevet tidligere [25], [26]. PMA var fra LC laboratorier (Woburn, MA), Gö6983, protease cocktail satt en og NP-40 var fra Calbiochem (Billerica, MA).
Cell Kultur
Rat2 celler ble konstruert for å uttrykke retrovirus vektor pBabePuro eller vektorderivater inneholdende cDNA som koder for RasGRP1, RasGRP3 eller RasGRP4 som tidligere beskrevet [15]. Erte Rat2-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum supplert med penicillin, streptomycin og glutamin (Gibco, Burlington, ON, Canada). Humane lymfom cellelinjer ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) supplementert som ovenfor. Opprinnelsen til cellelinjene er blitt publisert [25], [26]. Den Ramos B-cellelinje, LNCaP prostata cellelinje og HEK-293 celler som uttrykker GFP-RasGRP3 [28] ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% FBS og 2 mM glutamin (ATCC, Manassas, VA).
mus
Rasgrp1 – /-
mus har blitt beskrevet tidligere [27] og ble opprettholdt på C57Bl /6J bakgrunn. C57Bl /6J mus ble brukt som villtype kontroller.
I3A in vitro bindingsstudier
bindingsaffiniteter av I3A til RasGRP1 C1 domenet og til RasGRP3 ble bestemt som beskrevet tidligere [13], [ ,,,0],14]. Inkubasjonstemperaturen, optimalisert for stabilitet av proteinene i henhold til bindingsbetingelser, var 37 ° C for RasGRP1 C1 domene og 18 ° C i RasGRP3.
Analyse av proteiner ved Immunoblotting
Analyse av aktive og total Ras, pErk1 /2, ERK1 /2 og Bcl-2-familiemedlemmer, med mindre annet er angitt, ble beskrevet tidligere, [25], [26]. For å analysere RasGRP3 fosforylering, ble Ramos-celler behandlet med PMA, I3A eller DMSO kontroll kjøretøy som indikert i 30 minutter, hvoretter de ble høstet i lyseringsbuffer (1% NP-40 i PBS med protease inhibitor cocktail angitt 1). I noen tilfeller ble cellene forbehandlet i 30 minutter med pan-PKC-inhibitor Gö6983 (5 uM). Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [28] ved hjelp av følgende antistoffer: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling, # 3334), PKCδ (Santa Cruz, sc-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Cell Signaling, # 9106), ERK1 /2 (Cell Signaling, # 9102), β-Actin (Santa Cruz, sc-47778). Etter utvikling av signalene fra ECL (forbedret chemiluminescence), ble filmene skannet og kvantifisering av signalet ble utført ved hjelp av ImageJ (National Institutes of Health).
Konfokalmikroskopi
Translokasjon av GFP- RasGRP1 i LNCaP-celler ble evaluert som beskrevet [29]. 60.000 LNCaP celler ble sådd ut på ibidi u-retter (Ibidi LLC, Verona, WI) og deretter tilført 48 timer senere med GFP-merket RasGRP1-koder plasmid bruker Lipofectamine reagens i kombinasjon med Plus reagens i henhold til produsentens (Invitrogen, Carlsbad, CA ) anbefalinger. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 1000 nM PMA eller I3A i konfokal medium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium uten fenol-rødt supplementert med 1% FBS), og time-lapse bilder ble tatt hver 30 s ved hjelp av Zeiss AIM-programvaren. Imaging var med en Zeiss LSM 510 eller Zeiss LSM 710 konfokalmikroskopi system (Carl Zeiss, Inc.) med en Axiovert 100 M invertert mikroskop som opererer med en 25 mW argon laser innstilt til 488 nm. En 63 × 1,4 NA Zeiss Plan-Apochromat olje-nedsenking objektiv ble brukt sammen med varierende zoom (1,4 til 2X). For å lage en vektor for disse studiene hRasGRP1 (NM-005739) ble satt inn i pQB125-fn1 vektor av klassisk kloning ved hjelp av
Nhe
restriksjonsenzym cleavage. DNA-sekvensene til de konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensanalyse (DNA, Minicore, CCR, NCI, NIH).
Membrane fraksjone
HEK-293 celler som uttrykker GFP-RasGRP3 [28] ble behandlet med PMA eller I3A (1000 nM eller 100 nM) i 30 minutter eller DMSO som vehikkelkontroll. Ved slutten av behandlingen ble cellene vasket i PBS, fjernet fra platene ved skraping og pelletert ved sentrifugering med lav hastighet (5000 rpm i 5 minutter i en Eppendorf mikrosentrifuge nedkjølt). Cellene ble ultralydbehandlet (3 x 6 sek) i PBS supplert med protease inhibitor cocktail angitt 1 og deretter sentrifugert ved lav hastighet som ovenfor for å fjerne ubrutte celler. Aliquoter av denne supernatant som representerer «total protein» ble reservert for analyse. Resten av supernatanten ble deretter underkastet høyhastighetssentrifugering (100.000 x g i 1 time) for å gi en supernatant «cytoplasmafraksjonen». Den høyhastighets pellet ble vasket, løst opp i 1% Triton-X-100, og detergent-uoppløselig materiale ble fjernet ved høyhastighetssentrifugering som ovenfor. Den resulterende endelige supernatant representerer «membranfraksjonen». Fraksjoner av totalt, cytoplasmatiske og membranproteiner ble utsatt for SDS polyakrylamid elektroforese og immunoblotting, med lik protein lagt i hvert kjørefelt.
apoptose og celleproliferasjon Analyser
Metoder for å studere legemiddelutløst apoptose og MTT analyse for levedyktig celle akkumulering er publisert [26].
Resultater
Binding av I3A til RasGRP1 og RasGRP3 in vitro
Både RasGRP1 og RasGRP3 C1 domener ble tidligere vist å binde DAG analoger inkludert forbolestere [13], [14]. Modellering viser at ingenol 3-estere bundet til C1-domener på en lignende måte til forbolestere og DAG [30]. Følgelig, vurderte vi bindingen av I3A ved hjelp av en konkurranseanalyse ved anvendelse av [
3H] forbol 12,13-dibutyrate, i nærvær av 100 ug /ml fosfatidylserin (tabell 1). RasGRP1 (C1 domene) og RasGRP3 (full-lengde) bundet I3A med 2- og 9- ganger høyere affinitet henholdsvis enn de bundet forbolester PDBu. Sammenlignet med PKCα, RasGRP1 og RasGRP3 bundet I3A med omtrent tilsvarende slektskap, noe som indikerer at det var ingen selektivitet mellom disse to familiene til mål, i hvert fall
in vitro
.
I3A aktiverer RasGRPs i dyrkede fibroblaster og Jurkat T-celler
Rat2 fibroblaster ikke påviselig ekspress endogene RasGRPs. Således, Rat2-celler konstruert for å uttrykke de enkelte RasGRPs, sammenlignet med celler konstruert for å uttrykke tom vektor, tilveiebringe et praktisk system for å fastslå om en DAG analog kan aktivere RasGRPs. Sammenlignet med celler som uttrykker den tomme vektoren, Rat2-celler som uttrykker RasGRP1 viste robust Ras-aktivering som vurdert ved hjelp av en rullegardin assay som gjenvinnes Ras-GTP bundet til Ras-bindende domene av Raf1 (Fig. 1A). I3A var så effektiv som PMA i denne analysen. Likeledes ekspresjon av RasGRP3 i Rat2-celler overdratt en evne til å aktivere Ras i respons til begge DAG analoger (Fig. 1B). Jurkat T-celler endogent uttrykker RasGRP1 men ikke nevneverdig mengder RasGRP3 eller RasGRP4. I3A behandling reproduserbart utløste reproduserbar Ras-aktivering i Jurkat T-celler, i likhet med det som sees med PMA (fig. 1C).
A. Kulturer av Rat2-celler konstruert med enten tom vektor eller RasGRP1 cDNA-uttrykkende vektor ble behandlet med I3A eller PMA i 10 minutter og sammenlignet med kontrollkulturer ved hjelp av Ras-GTP pull-down-analyse. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. B. I et enkelt eksperiment Rat2-celler som uttrykker RasGRP3 cDNA ble likeledes analysert. C. Jurkat T-celler ble analysert for DAG analoge-indusert Ras-aktivering i tre uavhengige forsøk. D. Et likt antall av C57Bl /6J (WT, villtype) og
Rasgrp1
– /- (KO, knockout) thymocytter ble behandlet med DMSO (negativ kontroll), I3A eller PMA som indikert i 10 minutter, og proteiner Lysatene ble sammenlignet med fosfor-Erk signalanalyse. Resultatene er representative for duplikate eksperimenter. Kvantifisering av forholdene av RasGTP /Ras eller p-ERK1 /2 /ERK1 /2 er presentert under de enkelte panelene.
Vi har tidligere vist at RasGRP1 var avgjørende for DAG analog-indusert aktivering av Ras i muse thymocytter;
Rasgrp1 Anmeldelser – /- thymocytter var helt ødelagt, mens villtype (C57Bl /6J) thymocytter utstilt sterk Ras aktivering [27]. Fordi vi hadde begrenset antall celler, brukte vi mer følsomme fosfor-Erk analysen som et surrogat for Ras aktivering. Som forventet, demonstrerte mutante thymocytter mye redusert signal til ERK etter enten PMA eller I3A behandling (Fig. 1 D). Sammen er disse resultatene viser at I3A, som PMA, kan aktivere RasGRP1 og RasGRP3. En høy basal Ras-GTP nivået i ubehandlede celler frustrert lignende eksperimenter som tar sikte på å evaluere RasGRP4 i Rat2-celler. Men ved hjelp av en celle morfologi analysen vi samlet indirekte bevis på at I3A og PMA hver kan aktivere RasGRP4 i Rat2 celler. RasGRP4-uttrykkerte Rat2-celler inkubert i 48 timer i PMA eller I3A antatt en transformert morfologi, som tidligere beskrevet for å uttrykke RasGRP1 Rat2-celler [15]. Denne effekten ble ikke sett med tomme vektor celler eller ubehandlede RasGRP4-uttrykke Rat2 celler (data ikke vist)
DAG analoger aktivere RasGRPs av PKC-mediert fosforylering samt ved direkte rekruttering til cellemembraner [16]. – [19]. Ved hjelp av Ramos B-cellelinje, bestemt vi avhengigheten dose I3A og PMA for å indusere fosforylering av endogent RasGRP3 på T133. Parallelt, undersøkte vi både aktiveringen av PKCδ, som kan vurderes ut fra sin tilstand av fosforylering ved S299 [31], så vel som den nedstrøms responsen av Erk fosforylering. For kinaser som PKC som er gjenstand for allosteric og posisjonsregulering, måling av aktiviteten av det isolerte kinase er ikke et pålitelig mål på graden av
in vivo
aktivitet. For PKCδ vises fosforylering på S299 for å rapportere sin ligand avhengig aktivering [31]. Dessverre, antistoffer ikke er kommersielt tilgjengelige for fosforyleringsseter som reflekterer aktivering av andre PKC isoformer, til forskjell fra de mange antistoffer som omhandler fosforylering av PKCS ved aktiveringen bue, sving motiv, og hydrofobe motiv. Disse sistnevnte områder er involvert i modningen av PKC som gjør det istand til å bli aktivert ved ligandbinding. Vi har derfor bare undersøkt aktivering av PKCδ svar på I3A og PMA. Andre PKC isoformer rapportert for Ramos-celler inkluderer PKCα, β, ε, og θ [32].
I dette cellesystemet, observerte vi at I3A og PMA viste omtrent like potenser for aktivering av PKC δ og for Erk ( fig. 2A). RasGRP3 fosforylering ved T133 var detekterbar ved en noe lavere konsentrasjon av enten liganden, noe som tyder på involvering av andre PKC isoformer i tillegg til PKCδ. For å bekrefte involvering av PKC i RasGRP3 fosforylering, undersøkte vi muligheten til general PKC-hemmer Gö6983 å blokkere disse fosforylering hendelser (Fig. 2B). Av seg selv, forbehandling med Gö6983 hatt liten effekt. I motsetning til dette ble respons på behandling med I3A eller PMA dramatisk redusert. Spesielt fosforylering av RasGRP3 ved T133 ble nesten fullstendig opphevet, i overensstemmelse med inhiberingen av PKCδ fosforylering, som var nedstrøms responsen av Erk fosforylering. Likeledes, i Jurkat T-celler i pannen PKC-inhibitoren bis-indolemaleimide I avskaffet nedstrøms respons på I3A av Erk fosforylering (Fig. 2C). Videre bekreftet vi at dette PKC-inhibitor sterkt redusert dannelse av Ras-GTP i respons til I3A, direkte viser at effekten av I3A på Erk fosforylering var oppstrøms for Ras, og overensstemmelse med den kjente krav for PKC-mediert aktivering av RasGRP1 i tillegg til kravet for ligandbinding til den RasGRP1 C1 domenet [15], [18], [19].
A. Ramos-celler ble behandlet i 30 minutter med de indikerte konsentrasjoner av I3A eller PMA, etterfulgt av analyse av cellelysater ved immunblotting. DMSO indikerer bilen kontroll. Linjene indikerer kvantifisering (gjennomsnitt ± SEM) av resultatene fra tre uavhengige forsøk. En representativ immunoblot er illustrert. Det skal bemerkes at selv om RasGRP3 antistoffet ikke er rettet mot et RasGRP3 fosforyleringssetet, det konsekvent gir en viss økning i signal under betingelser med RasGRP3 fosforylering. B. Ramos-celler ble behandlet med 3 nM I3A eller PMA, i noen tilfeller etter forbehandling med Gö6983 (5 uM til 40 min), og analysert som ovenfor. Linjene indikerer kvantifisering (gjennomsnitt ± SEM) av resultatene fra to uavhengige forsøk. En representativ immunoblot er illustrert. Et ytterligere eksperiment utført under tilsvarende betingelser ga lignende resultater. C. Jurkat T-celler ble stimulert i et enkelt eksperiment med I3A i 10 minutter med eller uten 10 minutter pre-inkubasjon med pan-PKC-inhibitor bisindolymaleimide I (4,6 uM), etterfulgt av analyse av Ras-GTP, total Ras, pErk1 /2 og totalt ERK1 /2 plan.
I3A aktiverer RasGRPs i Velg B-NHL cellelinjer
Vi har tidligere vist at Dag analoger som bryostatin en og syntetisk analog pico kunne aktivere RasGRPs i B-NHL cellelinjer som er blitt karakterisert som følsom for induksjon av apoptose av de samme forbindelsene [25], [26]. Etter å ha bekreftet ovenfor at I3A fungerte som en DAG analog på RasGRP1 /3, ønsket vi å utforske nærmere muligheten for denne forbindelsen å lokke fram Ras aktivering i representative DAG analoge sensitive B-NHL cellelinjer. Kort behandling av BL2 (Burkitt lymfom), Jeko-en, Z138 (både mantelcellelymfom) og Toledo (germinalsenter lymfom) resulterte i robust aktivering av Ras (Fig. 3).
I et enkelt eksperiment, cellene ble behandlet med 100 nM I3A eller DMSO kontroll i 10 minutter, etterfulgt av analyse av Ras-GTP ved å trekke ned analysen. Forholdet mellom Ras-GTP /Ras ble kvantifisert.
I3A behandling Årsaker Intracellulær Re-distribusjon av RasGRP1 og RasGRP3
DAG analoger binde seg til en hydrofil kløft i C1 domene, fullfører en hydrofob overflate og derved den drivende membran innsetting av DAG analoge – C1 domene kompleks [33]. DAG og Dag analoger bidra dermed RasGRP aktivering delvis ved å forårsake disse proteinene å finne igjen til cellemembraner hvor de kan fysisk samhandle med lipidert Ras [34]. Vi undersøkte derfor evnen til I3A å indusere protein omfordeling bruker både
in situ Hotell og subcellulære fraksjone tilnærminger.
For
in situ
studier ble GFP-RasGRP1 uttrykt i LNCaP celler. Etter behandling med I3A eller PMA, ble forandringer i den intracellulære mønster av merket protein visualisert ved konfokal mikroskopi. LNCaP celler ble valgt fordi deres godt spredt morfologi forenkler bildebehandling. De er enkle å transfektere og vi har hatt lang erfaring med effekten av ulike forbolestere på PKC trans i dette systemet [29]. Før behandlingen ble GFP-RasGRP1 fordelt gjennom cytoplasma (fig. 4). Ved PMA (1000 nM) tillegg GFP-RasGRP1 translocated til plasmamembranen innen 2 minutter. I3A også induserte en rask respons, men mønsteret var markert annerledes, med uttalt clustering på interne nettsider.
Celler som uttrykker GFP-RasGRP1 ble behandlet med 1 000 nM PMA eller I3A. Den trans mønsteret ble undersøkt i levende celler som en funksjon av tid. Resultatene av forsøk in duplo med I3A er vist. Bildene som vises er representative for fire uavhengige eksperimenter. Målestokk representerer 10 mikrometer.
Som en komplementær tilnærming, uttrykte vi GFP-RasGRP3 i HEK-293 celler, behandlet med I3A eller PMA, utsatt cellene til subcellulære fraksjonering, og undersøkte endringer i fordeling av GFP-RasGRP3 mellom cytoplasma og membranfraksjoner (fig. 5). GFP-RasGRP3 ble detektert både med et antistoff rettet mot RasGRP3 seg selv så vel som med et antistoff mot GFP-taggen. Til sammenligning har vi også undersøkt endringer i fordelingen av endogen PKCδ.
HEK-293 celler uttrykker GFP-RasGRP3 ble behandlet i 30 minutter med PMA eller I3A ved de angitte konsentrasjoner. Celle sonicates ble underkastet fraksjonering og subcellulære nivåer av PKCδ og RasGRP3 ble analysert ved immunoblotting. For RasGRP3, ble ekspresjon detektert både med et anti-RasGRP3 antistoff og med et antistoff mot GFP-taggen. Linjene indikerer kvantifisering (gjennomsnitt ± SEM) av resultatene fra tre uavhengige forsøk. En representant immunoblot er illustrert.
Behandling med I3A induserte en klar økning i nivået av GFP-RasGRP3 gjenfunnet i membranfraksjonen, oppdaget med enten antistoff, som ligner responsen observert med PMA. Tapet av GFP-RasGRP3 fra cytoplasmafraksjonen var mindre opplagt, men disse resultatene bør sees i forhold til observasjon at protein oppdaget i det totale proteinprøven ble litt forhøyet i DAG analoge behandlet prøvene, av ukjente grunner. I det samme eksperimentet, både I3A og PMA indusert omfordeling av PKCδ til membranfraksjonen.
I3A Behandling Påvirker BCL-2 proteiner i Velg B-NHL cellelinjer
I våre tidligere studier vi sammenlignet den DAG analog-sensitive cellelinje Toledo til RL, en DAG analog bestandig germinalsenter type B-NHL cellelinje [25]. Vi rapporterte at apoptose indusert av Dag analoger i Toledo B-NHL-celler var avhengig av pro-apoptotiske BH3-bare protein Bim [25]. I Toledo B-NHL-celler, behandling med bryostatin en eller pico resulterte i RasGRP-Erk signalering og fosforylering av Bim på en pro-apoptotiske område som er felles for både BimEL og BimL spleise former. Vi har også vist at anti-apoptotiske fosforylering på områder som er unike for BimEL ført til effektiv proteolyse i et proteosom-avhengig måte i DAG analog-resistent cellelinje RL. Men denne anti-apoptotiske mekanismen var mindre tydelig i Toledo. Våre nåværende resultater med I3A viser nøyaktig det samme mønsteret: BimL antatt redusert elektromobilitet, en indikasjon på fosforylering etter I3A behandling i både RL og Toledo (Fig 6A.). I3A også fremkalte fosforylering av BimEL i både RL og Toledo. Men BimEL nedregulering i Toledo var relativt ineffektiv etter I3A behandling (fig. 6A), akkurat som vi oppdaget tidligere for bryostatin en og pico [25].
De angitte cellelinjer ble ubehandlet eller behandlet for tre dag (BL2, UPN1, Z138) eller i 24 timer (RL og Toledo). Protein lysater ble analysert ved immunblotting med antistoffer mot de angitte proteiner. Panelene A og B ble avledet fra duplikate geler. Erk ble brukt som en lasting kontroll.
Mer nylig viste vi at pico behandling indusert apoptose i Burkitt lymfom cellelinje BL2 og i 5 av 6 Mantelcellelymfom cellelinjer, hvorav de fleste var Bim- mangelfull [26]. I disse tilfellene ble apoptose assosiert med økt ekspresjon av Bik og redusert ekspresjon av Mcl1 og Bcl-XL. I de foreliggende studier, har vi funnet at Bik ble indusert ved I3A behandling i BL2 og Z138, en representant mantle celle lymfom cellelinje (Fig. 6B). Spesielt i BL2, mye av det uttrykte Bik hadde økt elektromobilitet. Dette fenomen, som kan gjenspeile alternativ mRNA-spleising eller post-translasjonell modifikasjon, ble tidligere sett i pico-behandlede celler [26]. I kontrast, gjorde DAG analog-resistente UPN1 MCL cellelinje ikke viser I3A-indusert Bik uttrykk. Både BL2 og Z138 viste IA3-indusert redusert uttrykk for Mcl1 og BCL-XL, men disse effektene var ikke så tydelig i UPN1 celler (Fig. 6B). På alle måter, de resultater som er oppnådd her med I3A parallelt de som oppnås med bryostatin 1 og dens analoge pico i våre tidligere studier [25], [26].
I3A induserer apoptose i Velg B-NHL cellelinjer
for å finne ut om I3A kan indusere apoptose i B-NHL cellelinjer tidligere vist seg å være følsom for bryostatin en og /eller dens analoge pico, brukte vi tre forskjellige celle merking protokoller og flowcytometri, som tidligere beskrevet [25], [26]. Foruten de cellelinjer som er nevnt ovenfor, vi inkludert i analysen tidligere preget DAG-analog-sensitive MCL cellelinjer Mino, Rec1, og Sp53 og motstandsdyktig Burkitt lymfom cellelinjen Daudi. Den manglende evne av celler for å akkumulere TMRE (tetramethylrhodamine etylester) ble anvendt for å detektere tap av det mitokondrielle ytre membranpotensialet (fig. 7A). I enkelte tilfeller er inkludert vi MEK inhibitorer U1026 eller PD184352 å vurdere rollen til den kanoniske Ras-signalveien i apoptose. En fluoriserende caspase pseudo-substrat ble anvendt for å detektere global kaspase-aktivitet (Fig. 7B). DNA-ende-merking ved hjelp av dUTP og terminal transferase (TUNEL) ble anvendt for å overvåke nukleær DNA-fragmentering (fig. 7C). Representative resultater er vist i figur 7, og resultatene er oppsummert i tabell 2. Generelt I3A indusert apoptose omfattende i DAG analoge-sensitive cellelinjer (Toledo, BL2, Jeko-1), men mye mindre grad i resistente cellelinjer (RL , UPN1 og Daudi). Tap av TMRE farging indusert ved I3A i Toledo celler var i stor grad opphevet ved Mek-inhibitorer (Fig. 7A), men denne effekten var mindre dramatisk i noen av de MCL cellelinjer (data ikke vist).
A. RL og Toledo-celler ble behandlet i 24 timer, inkubert med TMRE, og analysert med hensyn til flekk opptak ved strømningscytometri. I noen tilfeller ble kulturene inkubert med enten U0126 eller PD184352 for å vurdere virkningene av hemming Mek. B. UPN1 og Jeko-1-celler ble inkubert med DMSO eller 100 nM I3A i 4 dager og deretter analysert med CaspACE ™ å detektere caspaseaktivering.
