Abstract
Tumor celledød moduleres av en iboende celledød vei styrt av pro – og anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien. Oppregulering av anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer er blitt vist å undertrykke celledød i prekliniske modeller av human kreft og er implisert i human tumorprogresjon. Tidligere gain-of-funksjon studier i RIP1-Tag2 modell av bukspyttkjertelen holme kreftutvikling, med uniform eller fokale /tempoveruttrykk av Bcl-x
L, demonstrerte akselerert tumordannelse og vekst. For å vurdere spesifikt rollen til endogent Bcl-x i å regulere apoptose og tumorprogresjon i denne modellen utviklet vi et pankreas β-celle-spesifikke knockout av begge allelene til
Bcl-x
ved hjelp av Cre-loxP system homolog rekombinasjon. Overraskende, var det ingen merkbar effekt på tumorceller apoptose priser eller på tumorvekst i
BCL-x
knockout mus. Andre anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer ble uttrykt, men ikke i hovedsak endret på mRNA nivå i
BCL-x
-null svulster, som tyder på redundans uten kompenserende transkripsjonen oppregulering. Interessant nok var forekomsten av invasive karsinomer redusert, og tumorceller som mangler Bcl-x ble svekket på invasjon i en to-kammer trans-brønn assay under betingelser som etterligner hypoksi. Således, mens funksjonen av Bcl-x i å undertrykke apoptose og dermed fremme tumorvekst er tydeligvis overflødig, impliserer genetisk ablasjon Bcl-x i selektivt å tilrettelegge invasjon, i samsvar med en nylig rapport som dokumenterer en pro-invasiv evnen til Bcl-x
L på eksogene over-uttrykk
Citation. Hager JH, Ulanet DB, Hennighausen L, Hanahan D (2009) Genetisk ablasjon av Bcl-x demper Invasivitet uten å påvirke Apoptose eller tumorvekst i en musemodell for bukspyttkjertel Nevroendokrine Kreft. PLoS ONE 4 (2): e4455. doi: 10,1371 /journal.pone.0004455
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 23 august 2008; Godkjent: 26 desember 2008; Publisert: 11 februar 2009
Copyright: © 2009 Hager et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av AP Giannini Foundation for medisinsk forskningsetikk (DBU), The National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (NIDDK) (LH), og tilskudd fra National Cancer Institute (DH, R01CA45234). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
for alle til kreft for å øke massen og maligne potensial, må celleproliferasjon overgå celledød [1]. For dette formål, humane tumorer koble inn eller ut en rekke forskjellige veier for å unnslippe eller minimalisere apoptose. Nødvendigheten av å ned-modulere apoptose også stammer fra det faktum at aktiverende mutasjoner i onkogener, samt overekspresjon av vill-type onkogene alleler, fremkaller ikke bare hyperproliferasjon, men også celledød [2] – [4]. Et vesentlig bevismateriale understøtter påstanden om at, uten noen grad av undertrykkelse av apoptose, kan onkogen-uttrykkende celler ikke avanserer forbi forholdsvis små, pre-maligne proliferative lesjoner [1], [5].
Den første direkte genetisk sammenheng mellom modulering av apoptose og tumorvekst kom fra oppdagelsen at uttrykk for
BCL-2
genet ble dysregulerte via translokasjon i follikulært lymfom, og at dette genet er homolog til
C. elegans
regulator av celledød, ced-9 [6] – [9]. Bcl-2 viste seg å være prototypen på en familie av strukturelt beslektede apoptotiske regulatorer, delt inn i to undergrupper som alternativt undertrykker eller induserer apoptose [10]. Den anti-apoptotiske arm av Bcl-2-familien omfatter Bcl-2, Bcl-x (flere anti-apoptotiske spleisevarianter), Bcl-w, A1, Mcl-1 og Boo [10] – [12]. Aktivering av apoptose i respons til oncogen-indusert hyperproliferasjon er blitt beskrevet i en rekke av genetisk modifiserte musemodeller for kreft, og spesielt i to modeller av pankreatisk nevroendokrint islet celle kreft. I en slik modell, RIP1-Tag2 [13], [14], SV40-T-antigenene er konstitutivt uttrykt i p-celler i de endokrine pankreas under kontroll av rotte insulin-promoteren, noe som resulterer i en flertrinns vei til invasivt karsinom som er stokastiske i natur og timelig langvarig. Ved 2-3 ukers alder, den normale postnatal utviklingsmessige spredning av øyceller smalner av, og i voksen mus der er en forholdsvis langsom omsetning av p-celler, med en lav spredning hastighet motvirkes av en lav apoptotisk hastighet, noe som resulterer i en meget beskjeden økning i β-cellemassen med alderen. I motsetning til p-cellene i RIP1-Tag2 holmer begynne hyperproliferating ved 3-4 ukers alder sammen med en samtidig aktivering av apoptose. En tidlig studie rapporterte at apoptose nådde den angiogene holmen scenen, men var betydelig ned-modulert i svulster, noe som tyder på at motstanden mot celledød ble et avgjørende skritt for tumorutvikling fra angiogene holmen forløpere [15]. En nyere studie av denne modellen har vist at down-modulering er ikke alltid tilfelle, ved at sent stadium svulster (inkludert invasive karsinomer) i dagens backcross generasjoner har vanligvis apoptotiske priser tilsvarende de av angiogene holmer, noe som tyder på en mer subtil fenomener på spill i ekspansiv tumorvekst (ref [16]). To veldefinerte undertrykkere av apoptose er blitt identifisert i denne modellen: funksjonell inaktivering av p53 via stort T-antigen ekspresjon, og opp-regulering av overlevelsesfaktor IGF-II [17], [18]. Genetiske studier med kors til et IGF-II null allel indikerte at det i stor grad fungerer som en overlevelsesfaktor i denne modellen, ved at fravær av IGF-II fremkalt mye økt (5 ×) apoptotiske priser hyper-proliferative lesjoner, og de små svulster oppstår hadde en mindre ondartet celle fenotype; spesielt, forble spredning renten uendret [18], [19].
En demonstrasjon som anti-apoptotiske medlemmer av BCL-2 familien kan modulere celle-dødsfall i denne modellen kom fra eksperimentell over-uttrykk for
Bcl-x
L
i p-celler via rotte insulin-promoteren (
RIP-Bcl-x
L
), noe som resulterte i undertrykket apoptose og en økning i tumorbyrde , sammen med en generell «akselerasjon» av tumoren veien [15]. Mer nylig har den samme RIP
Bcl-x
L
transgenet har også vist seg å undertrykke apoptose i en annen musemodell av islet cell carcinoma, hvori en myc-fusjonsprotein, myc
TAM, ble uttrykt i p-celler under kontroll av rotte insulin-promotoren [20]. Myc
TAM er bare aktive i nærvær av tamoksifen, slik at for induserbar og reversibel genekspresjon. Postnatal behandling av mus med tamoxifen resulterer i en hurtig induksjon av myc
TAM uttrykk samtidig med hyper-proliferasjon av B-celler. Interessant nok ble denne hyper-spredning ledsaget av massiv β-celle apoptose som resulterte i holmen involusjon innen 6-10 dager. Over-ekspresjon av
Bcl-x
L
via den samme
RIP-Bcl-x
L
transgen trykkes denne apoptose, noe som resulterer i en økning i β-cellemasse og en rask progresjon til invasive karsinomer. Derfor, i to forskjellige transgene musemodeller av holmen cellekreft, fremkalt av to funksjonelt forskjellige teinene, over-uttrykk for
BCL-x
L
undertrykker apoptose, noe som resulterer i akselerert tumordannelse. Resultatene indikerer at apoptose er observert i disse tumortyper er, i det minste delvis mediert av mitokondrie død pathway. I denne rapporten undersøker vi hvilken rolle endogene Bcl-x spiller i moduler apoptose og tumorvekst i RIP1-Tag2 modell via målrettet sletting av genet i onkogen-uttrykke p-celler ved hjelp av Cre /loxP system.
Resultater
BCL-x uttrykk i RIP1-Tag2 holmen celle kreft
i situ hybridisering med en pan-isoform sonde til bukspyttkjertelen vevssnitt fra RIP1-Tag2 mus tidligere antydet at
BCL-x
mRNA var beskjedent oppregulert i tumorer i forhold til forstadier [15]. For å bekrefte at Bcl-x bart uttrykt på proteinnivået i løpet av holmen tumorigenesis, dro vi videre for å vurdere nivåene av Bcl-x protein ved Western blotting ved hjelp lysates fra normale holmer og fra de diskrete stadier av bukspyttkjertelen holmen tumorigenesis i RIP1-Tag2 mus. Som indikert i figur 1, et bånd som vandret ved 27 kDa i overensstemmelse med Bcl-x
L-isoform ble detektert ved tilsvarende nivå i normale øyer og i de tre neoplastiske stadier. I tillegg er en litt raskere migrerende bånd, som potensielt tilsvarer den alternative spleisevariant Bcl-x
β [21], [22], ble påvist i den angiogene holmen og tumorstadium, men ikke normale øyer eller hyperplastisk holmen trinnet. Dermed generelle nivået av Bcl-x protein er beskjedent forhøyet i angiogene holmen og tumorstadier.
Protein utdrag fra bassenger av normale, ikke-transgene holmer (N), hyperplastiske holmer (H), angiogene holmer ( A), og tumorer (T) fra RIP1-Tag2 mus ble immunoblottet med antistoffer mot Bcl-x og β-aktin som lasting kontroll. Den 27 kDa båndet representerer Bcl-x
L; jo raskere migrerende bandet til stede i angiogene holmen og tumorekstrakter kan representere den alternative spleisevariant, Bcl-x
β.
Generering av et β-celle spesifikt gen knockout av BCL-x
for å vurdere den funksjonelle rollen Bcl-x i RIP1-Tag2 tumorigenesis, inaktivert vi
BCL-x
genet i p-celler i det endokrine bukspyttkjertelen med Cre /loxP system av homolog rekombinasjon. RIP-Cre linje anvendes uttrykker Cre i ca. 82% av p-celler, medierer effektiv rekombinasjon ved loxP-seter [23], [24]. Den «floxed» allel av
Bcl-x
,
Bcl-x
fl /fl
, hvori eksoner 1 og 2 er flankert av loxP-seter, har vist seg å være en effektivt substrat for Cre rekombinase, som produserer en null allel følgende rekombinasjon i andre vev [23] – [25]. Vi først genererte
RIP-Cre
,
BCL-x
fl /fl
mus (og ulike kontroll genotyper) mangler onkogen, og alderen dem ut til 12 uker for å vurdere mulige effekter på β-celle utvikling og homeostase.
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
BCL-x
fl /fl
mus ble født i forventet mendelsk forholdstall, og nådde voksen alder uten tidlig dødelighet eller utilslørt patologi. Vi undersøkte H E farget i bukspyttkjertelen seksjoner fra
RIP-Cre: Bcl-x
fl /fl
, og
Cre
-negative kontroll mus ved hjelp av lysmikroskopi. Det ble ikke observert noen tydelig forskjell i holmen størrelse, fordeling, eller tall i en dobbel-blind undersøkelse av disse seksjoner (figur 2A). Resultatene antyder at β-celle utvikling og holme morphogenesis var i hovedsak normal i fravær av Bcl-x-funksjon, selv om subtile fysiologiske effekter ikke kan utelukkes ved denne analysen. En alternativ forklaring på den manglende åpenlys fenotype i
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus ville være at p-celler med slettet
BCL-x
døde, og dermed de vanlige holmer observerte ble avledet fra ikke-saman, » Escaper «p-celler som ikke uttrykker transgenet-avledet Cre. For å vurdere denne muligheten, isolert vi genomisk DNA fra bassenger av holmer isolert fra
RIP-Cre
;
Bcl-x
fl /fl
mus og utført av PCR-analyse med primere som vil forsterke og skiller et rekombinert allel fra en ikke-rekombinert allel (Figur 2B). Effektiv rekombinasjon ble oppdaget i
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
holmer. Som forventet ble det saman allel ikke oppdaget i kontrollene mangler RIP-Cre transgenet (eller i milt fra
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus, der Cre er ikke uttrykt)
(A) H E farget i bukspyttkjertelen seksjoner fra 12 uker gamle mus av følgende genotyper.
BCL-x
+ /+
;
RIP-Cre, Bcl-x
+ /+
;
og RIP-Cre, Bcl-x
fl /fll
. Flere deler av hver av dyrene som er vist på mikrofotografiene ble undersøkt. (B) Genomisk DNA fra bassenger av Langerhans øyer ble isolert fra mus av forskjellige genotyper. PCR ble utført ved anvendelse av en primer som binder oppstrøms for 5 «loxP område og en annen primer som binder seg 3» til nedstrøms loxP-området. PCR-fragmentet av det ikke-rekombinert allel og den rekombinerte allelet er 2.9 kb og 150 bp, respektivt. Pankreas holmer ble isolert (Materialer og metoder) fra 4-6 dyr av hver genotype og samlet.
Vurdere funksjonell rolle Bcl-x i RIP1-Tag2 tumorigenesis
For å undersøke rollen som Bcl-x i moduler apoptose under RIP1-Tag2 tumorigenesis, genererte vi sammensatte mus som var homozygote for
BCL-x
fl /fl
allel og enten gjennomføres både RIP1-Tag2 og RIP-Cre transgener, eller bare RIP1-Tag2 transgenet. Tilleggskontroller inkludert mus som bar den RIP1-Tag2 transgenet, og enten
BCL-x
+ /+ eller BCL-x
fl /+
alleler. Vi alderen ut årskull av disse musene til 13 ukers alder, og kvantifisert både tumorbelastning (volum) og tumor nummer. Den målrettede knockout av
BCL-x
ikke resultere i en betydelig forskjell i tumorbelastning (figur 3A). Dette i hovedsak «wild-type» tumorbyrde i knockout dyr ble ledsaget av en ca 40% reduksjon i tumor nummer, Men denne effekten ikke statistisk signifikant (figur 3B). For å finne ut om denne mangelen på utilslørt fenotypiske effekt på tumorvekst ble også reflektert i apoptotiske rente, utførte vi tunel analyser på formalinfiksert parafin seksjoner fra
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
dyr. Som foreslått av tumorbelastning og tumor talldata, var det ingen signifikant forskjell i apoptotiske raten i svulster fra «knockout» versus kontroll dyr (Figur 3C).
(A og B) Sammenligning av tumorvolum og Antall. Makroskopisk synlige svulster fra 13 uker gamle dyr ble skåret ut, festet eksokrine vev fjernet og målt med linjal. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen V = (x * y
2) × 0,52. Data representerer Mean ± SEM; + /+ Og FL /+: n = 7; FL /FL: n = 24; RIP-Cre, Fl /Fl: n = 22. Statistisk signifikans ble bestemt av ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). P = 0,98 (D) apoptotiske hastighet. Apoptotiske celler ble kvantifisert via TUNEL merking av pankreas seksjoner fra 13 uke gamle dyr. Data representerer Mean ± SEM (n = 5 mus /gruppe). Den prosentvise TUNEL
+ celler ble beregnet ut fra deler av 16-17 enkelte svulster /gruppe. Statistisk signifikans bestemt av ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). . P = 0,98
For å verifisere at
BCL-x
ble effektivt slettet i svulstene oppstår i
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus, overvåket vi rekombinasjon ved hjelp av en PCR-basert analysen på genomisk DNA fra 12 tilfeldig plukket svulster (område 5.2 mm
3-229 mm
3) : 10/12 tumorer oppviste fullstendig rekombinasjon, 1/12 viste delvis rekombinasjon, og 1/12 hadde ingen rekombinasjon (figur 4A og data ikke vist). Gitt det faktum at den Cre transgenet ikke er effektivt uttrykt i 10-20% av B-cellene, og å merke seg at forholdet av tumorer med rekombineres versus ikke-rekombinerte
Bcl-x
alleler var også -10 %, vi konkludere med at det ikke var noen vekst selektiv fordel av
Bcl-x
+ /+
celler som manifesterte seg i den klonale utvekst av p-celler som ikke-rekombinert alleler, i motsetning til situasjonen med andre gener som har viktige roller i RIP1-Tag2 tumorigenesis (f.eks VEGF [26]). Spesielt, noen av de største tumorer oppviste fullstendig rekombinasjon, igjen støtter ideen om at tapet av Bcl-x-funksjonen ikke er forringe tumorvekst. Som et annet mål på rekombinasjon effektivitet, vurderte vi
BCL-x
uttrykk ved kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første cDNA avledet fra 10 uavhengige
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster og 10
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
kontroller (Tall 4B og S1). Det var en betydelig reduksjon i
BCL-x
uttrykk i 9/10 av
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster sammenlignet med
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
kontroller, noe som indikerer at
BCL-x
ble slettet i de fleste p-celler i disse svulstene. Men en svulst uttrykte villtype nivåer av
BCL-x
, noe som tyder på at det oppsto fra en β-celle som ikke uttrykker Cre, og dermed næret en ikke-saman allel. Denne spådommen ble bekreftet ved screening alle 10 av
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster for grobunn uttrykk, og som spådde denne eksepsjonelle svulsten ikke uttrykke Cre, i motsetning til de 9 svulster som utstilt mye redusert
BCL-x
uttrykk (Figur 4C). Uten denne Cre-negative, Bcl-x-positive «escaper» svulst fra analysen er den gjennomsnittlige
Bcl-x
ekspresjon i «KO» svulster var 9,5 ganger lavere enn for kontrollene. Dermed sletting av
BCL-x
i β-cellerommet av disse svulstene resulterte i en ~90% reduksjon av
BCL-x
uttrykk, og bekrefter dermed at overvekt av
Bcl-x
uttrykk i RIP1-Tag2 svulster er β-celle opprinnelse og at Cre ble effektivt slette
BCL-x
tilsynelatende uten fenotypiske konsekvens. Den resterende
BCL-x
uttrykk sannsynlig stammer fra stromal komponent av lesjonene (hovedsakelig vaskulære og immuncelletyper), selv om vi ikke kan formelt utelukke muligheten for at disse svulstene er oligo-klonal, og at noen av rest
BCL-x
mRNA er avledet fra relativt sjeldne p-celler husing ikke-saman
BCL-x
alleler. For å avgjøre om betydelig reduksjon av
BCL-x
mRNA observert i BCL-x «KO» svulster resulterte i en tilsvar reduksjon i Bcl-x protein nivåer, gjennomførte vi en Western blot analyse på lysatene fra 5 uavhengige
RIP1-Tag2, RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster. I samsvar med den PCR-basert analyse av rekombinasjon og den kvantitative RT-PCR-analyse av
Bcl-x
mRNA-nivåer, Bcl-x proteinnivåer ble signifikant redusert sammenlignet med villtype (wt) tumorer (figur 4D) indikerer Cre-mediert sletting av
BCL-x
locus i de aller fleste av beta-cellene i
RIP1-Tag2, RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster. I tillegg er dette resultatet bekrefter at immunoreaktive bånd detektert i normale øyer og RIP1-Tag2 lesjoner (figur 1) var i virkeligheten utledet fra
Bcl-x
. Sammen data støtter konklusjonen om at Bcl-x ikke har en sentral rolle i modulering av tumor apoptose i denne bane, og at dens funksjon er enten ikke-essensielle, redundant, og /eller kan lett kompenseres for ved andre gener, så som annet anti-apoptotiske medlemmer av BCL-2 familien
(A) Effektiv rekombinasjon av
BCL-x
i
RIP1-Tag2
.;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster. Genomisk DNA ble isolert fra enkelte svulster fra
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /f
l
mus. PCR ble utført ved anvendelse av en primer som binder oppstrøms for 5 «loxP område og en annen primer som binder seg 3» til nedstrøms loxP-området. PCR-fragmentet av det ikke-rekombinert allel og den rekombinerte allelet er 2.9 kb og 150 bp, respektivt. (B)
BCL-x
uttrykk er betydelig redusert i
Bclx
-KO svulster. Kvantitativ RT-PCR (Taqman) ble utført på en
st tråd cDNA syntetisert fra RNA isolert fra enkelte svulster fra
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
. En sonde som strekker seg over det oppdaget at alle viktige anti-apoptotiske spleisevarianter ble anvendt. Genekspresjon var normalisert til og plottet som en funksjon av GAPDH uttrykk. (D) RIP-Cre transgenet ikke er uttrykt i
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
svulster som beholder
BCL-x
uttrykk. Cre-mRNA-ekspresjon ble overvåket ved hjelp av RT-PCR på en
st tråd cDNA syntetisert fra RNA isolert fra individuelle tumorer fra
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
mus. Etter 27 sykluser med PCR, ble cDNA fraksjonert på agarosegeler, og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. PCR-produktet er 520 bp. * Non-saman, Cre-negative svulst. (D) Bcl-x protein nivåer er betydelig redusert i
BCL-x
-KO svulster, som avslørt av Western blotting som i Figur 1. β-aktin brukes som en lasting kontroll.
Expression profilering andre BCL-2 familiemedlemmer i holmen tumorigenesis
Deretter søkte vi å finne ut om de 5 andre kjente anti-apoptotiske medlemmer av BCL-2 familien kan komme til uttrykk under RIP1-Tag2 tumorigenesis for derved potensielt å kompensere for fraværet av Bcl-x. Vi kvantifisert
BCL-2
,
BCL-w
,
A1
,
Mcl-1 Hotell og
Boo
mRNA nivåer ved hjelp kvantitativ RT-PCR-analyse (Taqman) på en
st cDNA fra normale holmer (isolert fra ikke-transgene mus), hyperplastiske holmer, angiogene holmer, og svulster fra RIP1-Tag2 mus. Som vist i figurene 5 og S2, fire av genene ble uttrykt; den femte,
Boo
, ble ikke påvist i noen av prøvene, og var svært variabel i gjentatte analyser, i samsvar med dets ekspresjon blir stor grad er begrenset til de mannlige og kvinnelige kjønnsorganer [27]. Blant de fire uttrykt medlemmer, bare
BCL-w
ble uttrykt på nivåer tilsvar til
BCL-x
. Ekspresjonsnivåer er vist i forhold til kontrollgruppen gen, GAPDH, som oppviste minst variable uttrykk i forhold til L19 og Gus mellom normale holmer og de forskjellige neoplastiske lesjoner holmen (fig S3). For å finne ut om en eller flere av de anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer var transcriptionaly oppregulert i fravær av Bcl-x og derfor potensielt funksjonelt kompensere for
BCL-x
«knockout», vi utførte kvantitativ RT-PCR-analyse på samme ti uavhengige
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl Hotell og 10
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
svulster som
BCL-x
uttrykk ble kvantifisert (i figur 4B). Det viste seg ikke å være noen signifikant forskjell i mRNA-ekspresjonsnivåene av disse 5 genene (figurene 6 og S4). I tillegg Taqman-analyse av de samme tumor cDNA for oppregulering av medlemmer av IAP klasse av anti-apoptotiske proteiner (CIAP1, CIAP2, Survivin, XIAP, og BRUCE) på lignende måte ikke klarte å avsløre noen vesentlig transkripsjonen oppregulering av disse genene i
BCL-x
-KO svulster (data ikke vist).
mRNA nivåer av pro-overlevelse BCL-2 familiemedlemmer
BCL-x
,
BCL-2
,
BCL-w
,
A1
,
Mcl-1 Hotell og
Boo
ble vurdert ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første tråd cDNA syntetisert fra total RNA bassenger (4-6 dyr pr pool) av normale, ikke-transgene holmer, og av hyperplastiske holmer, angiogene holmer og svulster fra RIP1-Tag2 mus. Genekspresjon ble normalisert til og plottet som en prosentandel av GAPDH uttrykket.
mRNA nivåer av
BCL-x
,
BCL-2
,
BCL-w
,
A1
,
Mcl-1 Hotell og
Boo
ble vurdert ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første tråd cDNA syntetisert fra total RNA isolert fra enkelte svulster fra
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl product: (n = 9 svulster fra 5 mus, en svulst funnet å ikke uttrykke Cre og utviser villtype nivåer av
BCL-x
ekskludert fra disse data) og
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
mus (n = 10 svulster fra fem individuelle mus). Relativ genekspresjon ble normalisert til og presentert som en prosentandel av GAPDH uttrykk. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. Statistisk signifikans bestemt av ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). P 0,05 ansett som signifikant
Role of Bcl-x i moduler invasjonen i RIP1-Tag2 tumorignesis
I tillegg til moduler apoptose i tumorceller, har det vært rapporter om at Bcl-. 2 familiemedlemmer kan i tillegg fremme kreftutvikling via effekter på tumorcelle invasjon [28] – [31]. I en rapport ble det observert en dissosiasjon mellom evnen til Bcl-x
L for å modulere apoptose og invasivitet av humane glioma-celler [29]. Mer nylig, oppregulering av Bcl-x
L av somatiske genoverføring i RIP1-Tag2 tumorigenesis ble rapportert å øke spredningsmåte, uten å redusere apoptose [32]. Motivert av disse resultatene, og ved tydelig mangel på effekt av tap av Bcl-x på samlet RIP1-Tag2 tumor celle apoptose og tumor byrde, en potensiell rolle for Bcl-x i tumorinvasjon ble vurdert. Svulster fra
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl Hotell og
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus ble scoret som ikke-invasive, innkapslede svulster (IT) eller invasive karsinomer (IC1-mikroinvasiv; IC2-svært invasiv) i henhold til kriteriene for Lopez og Hanahan [ ,,,0],16]. Interessant, var det en signifikant høyere andel av innkapslede, ikke-invasive svulster i
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus sammenlignet med
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
mus (22,8% vs. 4,3%, p 0,02) (figur 7 og S5)
Svulster i H . E-fargede seksjoner fra 13 wk
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl product: (n = 46 svulster fra 5 mus) og
RIP1-Tag2
;
RIP-Cre
;
BCL-x
fl /fl
mus (n = 35 svulster fra 5 mus) ble scoret som enten ikke-invasiv holmen svulster /adenomer (IT) eller invasive karsinomer (enten IC1 eller IC2) og andelen av tumorer i hver klasse ble beregnet. Fordeling av svulster typer ble sammenlignet mellom de to gruppene ved hjelp av Fishers eksakte test. p = 0,017.
For å underbygge effekten av tap av Bcl-x på invasjonen, kreftceller med villtype eller slettet
BCL-x plakater (βTC-BCL-x- wt eller βTC-Bcl-x-knockout [KO]) ble generert ved å utlede β-cellelinjer ( «βTC») fra svulster
RIP1-Tag2
;
BCL-x
fl /fl
mus, og infiserer cellene med adenovirus som gjør eller ikke uttrykker Cre (Ad-Cre-GFP eller Ad-GFP). To uker etter infeksjon med Ad-Cre-GFP ble nivåene av Bcl-x protein i cellen befolkningen redusert med ca 75-80% (figur 8A), som sannsynligvis gjenspeiler rekombinasjon av
BCL-x
-genet i de fleste celler; serum-sultet celler +/- Cre ble sådd i forkamrene av porøse Transwell inserts enten ubestrøket eller Matrigel-belagte å vurdere effekten av tap av
BCL-x
uttrykk om migrasjon og invasjon, henholdsvis. Å ta hensyn til eventuelle forskjeller i cellevekst mellom βTC-Bcl-x-wt eller βTC-Bcl-x-KO celler over tid løpet av migrasjon /invasjons analyser, ble likt antall celler belagt i tre eksemplarer, og totale celle tall fastsettes etter en 48-timers inkubasjon. I løpet av denne tidsperioden var det ingen synlig forskjell i cellevekst mellom villtype og Bcl-x-KO-celler (Figur 8B). Dette var konsistent med den manglende effekt for tap av Bcl-x-funksjonen på tumorvekst og apoptose in vivo. I tillegg var det ingen signifikant forskjell i antallet trekkende eller invaderende celler langs en serum-gradient (figur 8C, D). Imidlertid βTC cellene var dårlig invasiv i disse ex vivo-analyser, som rapportert tidligere [32], i motsetning til den vanlige utseende av invasive kreftceller i løpet av tumorprogresjon. Vi lurte derfor på om de typiske celledyrkningsforholdene kanskje ikke riktig modell invasjonen fremkallende mikromiljøet in vivo. Spesielt, en rekke rapporter, blant annet tidligere studier i RIP1-Tag2 modell, har vist en rolle for hypoksi ved stimulering av tumorinvasjon [33] – [36]. Vi gjentok derfor migrasjon /invasjons analyser under forhold som etterligner hypoksi, ved inkorporering av koboltklorid (CoCl
2), som har blitt vist å indusere biokjemiske responser tilsvarende de som ble observert under lave oksygenbetingelser [37], [38]. I denne tilstanden, ble samlet celle overlevelse redusert (figur 8B) om villtype celler dokumentert en to-fold økning i antall trekkende celler (p = 0,006), og en 1,5 ganger økning i invadere celler (p = 0,07 ) (figur 8C, D) i forhold til det totale antall overlevende celler. En tilsvarende økning i migreringen ble observert i respons til CoCl
2 behandling av de βTC-Bcl-x-KO-celler (p = 0,02) (figur 8C); i motsetning til dette ble disse cellene ikke utviser økt invasjon under disse pseudo-hypoksiske tilstander, og sammenlignet med villtype-celler utviste en beskjeden, men signifikant reduksjon (45%; p = 0,005) i det relative antall av invaderende celler (figur 8D) . Disse data, i samsvar med den in vivo-analyse, viser at mens ekspresjon av multiple Bcl-2-familiemedlemmer kan gjengi Bcl-x funksjonelt overflødig når det gjelder effekter på tumorcelle apoptose, kan Bcl-x utviser ikke-redundante og distinkte funksjoner i forbindelse til tumor invasivitet.
βTC-
Bcl-x
fl /fl
tumorceller ble infisert med adenovirus som uttrykker Cre eller kontrollere GFP og sådd ut i triplikat i nærvær eller fravær av koboltklorid å vurdere effekten av redusert Bcl-x uttrykk på celle migrasjon og invasjon. (A) Western blot av Bcl-x og aktin proteinnivåer i βTC-
BCL-x
fl /fl celler behandlet +/- Cre på tidspunktet for migrasjon /invasjon analyser. (B) cellevekst. 2 x 10
5 βTC-
Bcl-x
fl /fl
celler +/- cre ble platet i nærvær eller fravær av CoCl
2 og celler ble tellet etter 48 timer. (C og D) cellemigrering og invasjons analyser. Celler ble sådd ut i kontroll trans-brønners innsatser (C) eller Matrigel-belagte innsatser (D). For overføringen analysen, blir resultatene avsatt som det midlere antall migrerende celler /10 x felt (8 felt /membran telles), mens for invasjonen analysene det totale antall av invaderende celler /membran plottes. CoCl
2-behandling resulterte i en signifikant reduksjon i invasjon av βTC-Bcl-x-KO-celler sammenlignet med villtype-celler (P = 0,005). Resultatene som vises representerer gjennomsnitt ± SEM av resultater fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer og er korrigert for endringer i total celle nummer (fra B) sammenlignet med kontrollceller (-Cre, -CoCl
2).
Diskusjoner
i denne studien, søkte vi å finne ut om genetisk sletting av en fremtredende anti-apoptotiske medlem av BCL-2-familien, Bcl-x, ville påvirke tumorigenesis.
