Abstract
Det er økende bevis for at embelin, en aktiv del av
Embelia Ribes
, induserer apoptose i humane kreftceller, men de detaljerte mekanismene er fortsatt uklart. Her har vi undersøkt effekten av embelin på veksten av humane prostatacancerceller. Embelin sterkt hemmet cellevekst, spesielt i menneskelige prostata kreft cellelinjer, inkludert PC3, DU145, LNCaP-LN3 og normal prostata epitel celle, RWPE-en sammenlignet med brystkreft (MDA-MB-231, MCF-7, og T47D), hepatoma (HepG2, Hep3B, og he-7), eller choriocarcinom (JEG-3). Vi har observert at embelin induserte apoptose av PC3-celler i en tidsavhengig måte korrelert med redusert ekspresjon av Bcl-2, Bcl-xL, og Mcl-1, økt translokasjon av Bax inn i mitokondriene, og en reduksjon i den mitokondrielle membranpotensiale. Videre embelin indusert spenningsavhengig anion kanal (VDAC) 1 uttrykk og oligomerisering, som kan fremme cytokrom
c Hotell og AIF utgivelse. Fordi embelin var i stand til å hemme Akt aktivering og cyklooksygenase-2-ekspresjon, ble virkningene på Wnt /β-catenin signale bestemt. Embelin aktivert glykogensyntasekinase (GSK) -3β ved å hindre fosforylering og undertrykte β-catenin uttrykk. Dempningen av β-catenin-mediert TCF transkripsjonen aktivitet og gentranskripsjon, for eksempel cyklin D1, c-myc, og matriks-metalloproteinase (MMP) -7, ble vist i embelin-behandlede celler. Endringene i β-catenin nivåer i respons til embelin ble blokkert ved litiumklorid, en GSK-3-inhibitor, noe som indikerer at embelin kan redusere β-catenin ekspresjon via GSK-3β aktivering. Videre eksponering av PC3-celler til embelin resulterte i en signifikant reduksjon i cellemigrering og invasjon. I konklusjonen, disse funnene tyder på at hemming av Akt signalering og aktivering av GSK-3β bidrar delvis til pro-apoptotisk effekt av embelin i prostatakreftceller
Citation. Park N, Baek HS, Chun YJ (2015 ) Embelin apoptose av menneskelige prostata kreft celler er mediert gjennom Modulation av Akt og β-catenin signale. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10,1371 /journal.pone.0134760
Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Sør-Korea
mottatt: 04.03.2015; Godkjent: 13 juli 2015; Publisert: 07.08.2015
Copyright: © 2015 Park et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr 2015R1A5A1008958). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Embelin (2, 5-dihydroksy-3-undecyl-1, 4-benzokinon), isolert som den aktive komponenten av frukten av
Embelia Ribes
Bur (fredløsfamilien), har vært brukes til behandling av feber og vist seg å ha anti-inflammatorisk, anti-kreftfremkallende [1], anti-oksidanter [2], anti-konvulsiv [3], og anti-bakterielle aktiviteter [4,5]. Embelin er kjent for å være en potent inhibitor lite molekyl av X-bundne hemmer av apoptose protein (XIAP) som opphever binding av XIAP til procaspase-9 [1]. Embelin virker som en potent inhibitor av NF-KB
κ
B [6,7] og viser cytotoksiske virkninger på en rekke forskjellige kreftcellelinjer [8]. Selv embelin er kjent for å undertrykke celledeling og indusere apoptose i mange humane kreftceller, de molekylære mekanismene for disse effektene er fortsatt uklar. Apoptose spiller en stor rolle i å kontrollere cellular integritet og er strengt regulert. To hoved distinkte apoptotiske veier har blitt utviklet, de indre og ytre trasé. Innvielse signaler for indre vei er generert av utviklings stikkord eller celleskader som forårsaker tap av mitokondrie membran potensial og frigjøring av pro-apoptotiske proteiner [9, 10]. Men de mekanismer som apoptogenic initiativtakerne krysser ytre mitokondriemembran (OMM) har ennå ikke blitt fullstendig løst. Spenningsavhengig anion kanal (VDAC) 1, som ligger i den OMM har vært foreslått som en viktig komponent i permeabiliteten overgangs pore (PTP), som fører til frigjøring av cytokrom c og apoptose induserende faktor (AIF) [11,12]. Oligomerisering av VDAC1 for å danne en stor porestruktur som reaksjon på flere pro-apoptotiske signaler kan være nødvendig for cytokrom c meldingen [13]. Videre interaksjon av VDAC1 med Bax, en proapoptotiske Bcl-2-familien protein kan danne større kompleks enn VDAC1 alene eller Bax alene og fremmer åpning av PTP [14]. Imidlertid anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner slik som Bcl-2, Bcl-xL, eller Mcl-1 hindre PTP åpning og er forbundet med behandling motstand og progresjon i mange typer kreft, inkludert prostatakreft [15]. Ifølge tidligere studier, er Mcl-en en viktig regulator av apoptose og differensiering og er overuttrykt i de fleste av prostata kreft celler [16]. Chen et al. rapporterte en ny vei, som består av Akt, syklooksygenase-2 (COX-2), og Mcl-1, for ervervet resistens mot apoptose i kreftceller [17]. Akt regulerer cellulære signalnett som er involvert i prosesser knyttet til cellulær proliferasjon, differensiering og metabolisme og aktiverer en COX-2-mediert anti-apoptotiske reaksjonsvei som involverer Mcl-1 [18,19]. Fosforylering av Akt i Ser ni rest av GSK-3β fører til dets inaktivering [20, 21], noe som resulterer i stabilisering av β-catenin, noe som er korrelert med økt transkripsjon av nedstrøms målgener [22]. Videre hemming av GSK-3β fosforylering tydelig undertrykker β-catenin ekspresjon og resistens mot apoptose. Denne studien viser at embelin induserer mitokondrie-avhengig apoptose og undertrykkelse av β-catenin uttrykk via Akt hemming og GSK-3β aktivering i menneskelige prostata kreft celler.
Materialer og metoder
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC prostatakreft cellelinjer PC3, DU145, og LNCaP-LN3, human prostata epitel cellelinje RWPE-en, human lever leverkreft cellelinje HepG2, Hep3B, og Huh-7 eller human brystkreft cellelinje MDA- MB-231, MCF-7, og T47D-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Den humane choriocarcinoma-cellelinjen JEG-3 ble kjøpt fra den koreanske cellelinje Bank og ble dyrket i DMEM medium med 10% (volum /volum) varme-inaktivert FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Reagenser
Embelin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). En 100 mM løsning av embelin ble fremstilt i dimetylsulfoksyd, som er lagret som små alikvoter ved -20 ° C og deretter fortynnet etter behov i cellekulturmedium. En 8M løsning av litiumklorid ble oppnådd fra Sigma-Aldrich og fortynnet etter behov i cellekulturmedium. FBS og RPMI 1640 medium ble kjøpt fra HyClone (Logan, UT). The Neon transfeksjon system, JC-en analysesett og COX-4 antistoff var fra Life Technologies (Carlsbad, California). Den bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit og ECL kit var fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Antistoffer mot fosfor-Akt (Ser 473), GSK-3β, fosfor-GSK-3β, eller BCL-2 var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot Total-Akt, VDAC1, BCL-XL, Bax, β-catenin, cyclin D1, GAPDH eller geit anti-kanin IgG-Texas Red og Ultra Cruz montering mellom var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Cyklooksygenase-2 (COX-2), Mcl-1, cytokrom
c
, AIF, β-catenin, c-myc eller histon H1 antistoffer var fra Millipore Co. (Bedford, MA). Alle andre kjemikalier var av høyeste renhet eller molekylær biologi klasse og ble oppnådd fra kommersielle kilder.
Celleviabilitet analysen
Cells (1 × 10
4 celler /brønn) ble lagt til en 96-brønns rundbunnet mikroplate og ble inkubert i den angitte tid ved 37 ° C. Etter behandling i den angitte tid, ble cellene behandlet med 10 ul av EZ-CyTox (Daeil Lab tøy, Korea) ble tilsatt til hver brønn. Etter 2 timers inkubasjon ved 37 ° C ble absorbansen målt ved 450 nm ved anvendelse av en GENIOS Pro mikroplateleser (TECAN, Sveits).
Annexin V /PI apoptose assay
Celler ble pelletert ved 1200 rpm og vasket en gang med 1 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS). Den resulterende pellet ble resuspendert i 1 ml av 1 x bindingsbuffer. Den resulterende blanding ble holdt på is i 60 minutter, hvoretter cellene ble permeabilisert med 50 ug /ml annexin V-FITC og 50 ug /ml propidiumjodid i 1 x bindingsbuffer. Prøvene ble holdt ved 37 ° C i 60 min og analysert umiddelbart med en BD FACScan flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, California).
Måling av mitokondriemembranen potensial (Δ
ψ
m)
Celler dyrket på poly-D-lysin-belagte dekkglass ble behandlet i 24 timer med embelin i vekstmedium, hurtig vasket med PBS, og deretter merket med 2 uM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Etter vasking flere ganger med PBS, ble objektglassene er montert på objektglass ved hjelp av Ultra Cruz monteringsmedium. Fluorescens signaler ble analysert med en LSM 510 META Confocal Laser Scanning Microscope (Zeiss, Jena, Tyskland).
Transient transfeksjon
For transient transfeksjon ble cellene transfektert med pece myr-Akt eller menneskelig COX -2 promoter luciferasepreparater konstruerer og PRL-Renilla (Promega) vektorer ved hjelp av Neon transfeksjon system som anbefalt av produsenten. I korthet, en dag før transfeksjon ble omtrent 5 x 10
5 celler pr 60 mm skål ble sådd ut i RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble vasket i PBS og deretter resuspendert i Opti-MEM serumfritt medium. Transfeksjon ble utført med 2 ug av plasmid-DNA i 5 timer ved 37 ° C. Etter transfeksjon ble cellene holdt i RPMI-medium inneholdende 10% FBS i 48 timer.
subcellulære fraksjone
Etter behandling ble cellene høstet og vasket med iskald PBS. Subcellulære fraksjonering ble utført ved hjelp av Mitokondrier Isolasjon kit for dyrkede celler og NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning kit fra Thermo Scientific. Western blotting ble utført ved anvendelse av antistoffer mot de følgende kontroll markørproteiner. GAPDH for den cytosoliske fraksjonen, COX-4 for den mitokondrielle fraksjon eller histon-H1for den nukleære fraksjonen
Western blot-analyse
cellene ble solubilisert med iskald lyseringsbuffer (pH 7,4) inneholdende 25 mM HEPES, 1% triton X-100, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF og 1 ug /ml leupeptin. De ekstraherte proteiner (30 ug) ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på 10% polyakrylamidgeler, og ble elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert i 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann i 2 timer ved 4 ° C og deretter ble inkubert over natten med primære antistoffer ved en 1: 1000 fortynning i 5% (w /v) Tris- bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20. Etter inkubasjon med sekundært antistoff i 2 timer, ble proteiner visualisert ved ECL og bandet intensitet ble analysert ved hjelp av en ChemiDoc XRS densitometer og kvantifisert ved Mengde En programvare (Bio-Rad, Richmond, CA). Proteinkonsentrasjoner ble estimert ved hjelp av BCA-metoden i henhold til leverandørens anbefalinger ved hjelp av bovint serumalbumin som en standard.
Immunofluorescence
Celler dyrket på poly-D-lysin-belagte dekkglass ble behandlet i 24 timer med embelin i vekstmedium, hurtig vasket med PBS, og deretter behandlet med vekstmedium, inkludert 100 nM MitoTracker sonder (Invitrogen). Etter 1 time ble cellene fiksert med 3,7% (w /v) paraformaldehyd i PBS, pH 7,4, i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS ble cellene blokkert i 15 minutter i PBS inneholdende 5% geiteserum og 0,2% Triton X-100, og deretter inkubert med primært antistoff (1: 1000) i 1 time, vasket grundig, og farget i 1 time med geit-anti-kanin-IgG-Texas Rød (1: 500). Etter ytterligere vaskinger ble objektglassene er montert på objektglass ved hjelp av Ultra Cruz monteringsmedium. Fluorescens signaler ble analysert ved hjelp av en LSM 510 META Confocal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss, Tyskland).
Cross-linking av VDAC
Etter behandling med embelin, sulfo-EGS i DMSO ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 250 uM. Etter 25-minutters inkubasjon ved 30 ° C, ble tverrbindingsmidlet stanset ved tilsetning av 1 M Tris-HCl (pH 7,5) til en endelig konsentrasjon på 20 mM. Prøvene ble så oppløst i 1% NP-40 og sonikert i 7 s fem ganger med en 30% puls ved hjelp av en Vibra-Cell sonikator (Sonics og Materials, Newtown, CT).
DNA fragmenteringsanalyse
DNA-fragmenter ble hentet med Exgene Cell SV genomisk DNA rensing system (GeneAll, Korea) i henhold til produsentens protokoll. DNA-fragmentene ble separert ved hjelp av gelelektroforese på en 1% agarosegel. Lastet DNA ble visualisert ved ChemiDoc XRS (Bio Rad).
Dual luciferase reporter analysen
Cells (1 × 10
6 celler /brønn) ble transfektert med to mikrogram av menneskelig COX 2 promoter luciferasepreparater konstruerer og PRL-Renilla (Promega) vektorer eller to mikrogram av TOPFlash luciferasepreparater vektorer med villtype TCF bindingssteder og FOPFlash luciferase vektor med mutasjonen TCF bindingsseter i henhold til produsentens protokoll med Neon transfeksjon system. Etter 48 timer ble cellene behandlet med 30 uM embelin i de angitte tidsrom, og lysert med passiv lyseringsbuffer, og luciferase-aktivitet ble målt etter hverandre ved bruk av dual Luciferase Assay System (Promega) med en FilterMax F3 mikroplateleser (Molecular Devices, CA) .
sårtilheling analysen
Cells (1 × 10
6 celler /brønn) ble sådd i 6-brønners cellekulturplater. Celler ble tillatt å vokse til konfluens i RPMI1640 medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble vasket med PBS og inkubert med 25 ug /ml mitomycin C i 30 min. A1 mm bred scratch ble gjort over cellelaget med en steril pipette tips. Platene ble fotografert etter den angitte tiden.
Invasion analysen
Cell invasjonen ble målt ved hjelp av celle invasjon analysen kit (Chemicon, Temecula, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene utsådd på en invasjon kammer innsats inneholdende en 8 um porestørrelse polykarbonatmembran belagt med et tynt lag av polymerisert kollagen. Invaderer celler på bunnen av innsatsen membranen ble farget og fotografert.
Gelatin Zymografi
Betinget media ble analysert for gelatinaser av gelatin zymografi. For gelatinaser, ble prøvene separert under ikke-reduserende betingelser på 10% SDS-polyakrylamidgeler inneholdende 0,1% gelatin. Etter SDS-PAGE ble gelen inkubert med renatureringsbuffer i 15 minutter tre ganger. Deretter ble gelene erstattet i utvikling buffer ved 37 ° C over natten. Gelene ble vasket og fotografert etter farging med 0,5% Coomassie blue-løsning i 30 minutter.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av enveis variansanalyse fulgt av Dunnetfs multiple sammenlignings parvis t-test med GraphPad Prism programvare (GraphPad Software Inc., CA) når det er hensiktsmessig. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på *
p
0,05.
Resultater
Embelin hemmer spredning av menneskelige prostata kreft celler
Ulike menneskelige kreftcellelinjer, inkludert prostata kreft celler (PC3, DU145 og LNCaP-LN3), human prostata epitelcellelinje (RWPE-1), brystcancer-celler (MDA-MB-231, MCF-7, og T47D), hepatomceller (HepG2, Hep3B, og Huh-7), og choriocarcinoma-celler (JEG-3) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av embelin for å bestemme effektene av embelin på cellulær proliferasjon (fig 1). Embelin vesentlig hemmet veksten av humane prostata kreftceller i forhold til dens virkninger på andre kreftceller. Celleviabilitet ble redusert med embelin i menneskelig prostata kreft cellelinjer og prostata epitelceller inkludert PC3, DU145, LNCaP-LN3 og RWPE-en med IC
50 verdier av 23,6 mikrometer, 11,0 mikrometer, 32,0 um, og over 200 mikrometer henholdsvis når cellene ble dyrket i 24 timer (figur 1E). Prostata kreft cellelinjer ble tydelig hemmet av embelin, men normal prostata celle ble ikke påvirket av embelin i lav konsentrasjon i 24 timer. For ytterligere undersøkelser ble 30 pM konsentrasjon av embelin utvalgt for behandling av PC3-celler.
Celler ble behandlet med embelin ved forskjellige konsentrasjoner av de angitte tider. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av CCK. Formazan-dannelse ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 450 nm. Prosentandelen av celler overlevende i hver gruppe i forhold til kontrollgruppen ble beregnet. (A) PC3 celle. (B) DU145 celle. (C) LNCaP-LN3 celle. (D) RWPE-1 celle. (E) IC
50 verdier av embelin i ulike humane kreftcellelinjer. IC
50 verdier ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige bestemmelser. * Signifikant forskjellig fra de ubehandlede kontrollceller (
p
0,05).
Induksjon av apoptose ved embelin
For å belyse hvorvidt embelin induserer apoptose i PC3 celler, flowcytometrisk analyse ble utført med annexin V- og propidiumjodid (PI) -stained celler. Behandling med 30 mikrometer embelin i opptil 48 timer førte til en kraftig økning i frekvensen av apoptose. Celler ble behandlet med 30 uM embelin i 12 timer og 24 timer viste en 15,6-ganger og 17,2 gangers økning i apoptose sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2A). Etter 48 timers inkubering, ble det observert en signifikant økning i nekrose i embelin-behandlede celler. Behandling med embelin induseres også kromosomalt DNA-fragmentering i en tidsavhengig måte (figur 2B). Fordi mitokondrie permeabilitet overgang kan føre til apoptose, bestemt vi effekten av embelin på mitokondriemembranen potensial (Δ
ψ
m). Fig 2C viste at embelin sterkt redusert Δ
ψ
m, angitt som den rød /grønn fluorescens forholdet i en tidsavhengig måte. Disse resultater antyder at embelin er i stand til å indusere apoptose ved å endre mitokondriemembranen permeabilitet.
(A) Celler ble inkubert i de angitte tidsperioder med embelin (30 uM), og ble farget med annexin V-FITC og PI . Apoptose ble målt ved flow-cytometri. De cellepopulasjoner ble diskriminert i hver kvadrant som levedyktige celler i nedre venstre (annexin V negativ /PI negative), tidlig apoptotiske celler i øvre venstre (annexin V positive /PI negative), sent apoptotiske celler i øvre høyre (annexin V positive /PI positiv), og nekrotiske celler i nedre høyre kvadrant (annexin V negativ /PI positive). (B) Induksjon av DNA fragmentering i PC3 celler ved embelin. Cellene ble inkubert i de angitte tidsperioder med embelin. Kromosomalt DNA ble isolert og DNA-fragmentering ble bestemt. M, men da DNA; P, paclitaxel (1 mm). (C) Etter PC3-celler ble inkubert med embelin for tidsperioder, ble celler merket med 2 M JC-1 i 30 minutter og Δ
ψ
m ble bestemt ved konfokal mikroskopi. Forholdet mellom JC-1 aggregat (rød) til monomer (grønn) intensitet ble beregnet ved bilde J programvare. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige bestemmelser. * Signifikant forskjellig fra de ubehandlede kontrollceller (
p
0,05).
For å avgjøre om embelin påvirker nivåene av apoptose relaterte proteiner i mitokondriene, målte vi mengden av Bax (pro-apoptotiske), BCL-2, BCL-XL, og Mcl-en (anti-apoptotiske). Som vist i figur 3A og 3B, har vi funnet at embelin (30 uM) sterkt indusert translokasjon av Bax fra cytosol til mitokondriene. Uttrykket nivåer av anti-apoptotiske Bcl-2 familien proteiner som BCL-2, BCL-XL, og Mcl-en ble signifikant redusert med embelin. Ved 24 timer etter behandling embelin, nivåene av Bcl-2, Bcl-xL, og Mcl-1 var 15%, 58% og 28% av kontrollnivået. Offentliggjøring av cytokrom
c
fra mitokondriene til cytosol ble også forbedret i nærvær av embelin (Fig 3C). Ved 24 timer etter behandling embelin, cytokrom
c
-nivået ble redusert til 45% i mitokondriene, men i cytosol cytokrom
c
nivå ble øket til 1,8 ganger av kontrollnivået. Confocal mikroskopisk analyse viste også at embelin forbedrer Bax translokasjon til mitokondriene og cytokrom
c
utslipp til cytosol (fig 3B og 3D). Vi fant også at embelin induserer translokasjon av apoptose induserende faktor (AIF) fra mitokondrier, gjennom cytosol, og til slutt til kjernen (figur 3E). Konfokalt mikroskopisk analyse viste at behandling med embelin forbedrer AIF translokasjon til kjernen (figur 3F). For å avgjøre om embelin induserer oligomerisering av VDAC å fremme endringer i Δ
ψ
m, og frigjøring av cytokrom
c
og AIF, celler ble behandlet med sulfo-EGS å generere kryss- binding mellom VDAC, og oligomerisering av VDAC ble bestemt ved Western blotting ved å bruke et anti-VDAC1 antistoff. Når cellene ble behandlet med embelin (30 uM) i opp til 24 timer, embelin klart indusert ekspresjon og dimerisering av VDAC1 i en tidsavhengig måte (figur 3G). Disse resultatene antyder at VDAC1 kan være en mediator av embelin-indusert apoptose, og at VDAC oligomerisering indusert av embelin potensielt kan bestemme sin gating kapasitet for utstrømningen av mitokondrielle proteiner, så som cytokrom
c
og AIF.
(A), (C), (E) translokasjon av pro-apoptotiske protein (Bax), cytokrom
c
, AIF, og nivået av anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2, Bcl-xL , Mcl-1) ble analysert ved western blotting. Cellene ble behandlet med embelin for de angitte tidsperioder. Etter inkubering ble cellene høstet og cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner ble isolert. Ekstraherte proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse ble utført. GAPDH nivå ble bestemt som lasting kontroller for cytosol og total lysatene. COX-4 nivå ble bestemt som en lasting kontroll for mitokondriene. Histone H1 nivå ble bestemt som en lasting kontroll for kjernefysisk brøkdel. C, cytosoliske fraksjon, M, mitokondrie fraksjonen, N, nukleær fraksjon. Tallene mellom blottene er prosenter av intensiteten av båndene etter normalisert med kontroll. (B), (D), (F) translokasjon av Bax (B), cytokrom
c product: (D), og AIF (F). Celler ble dyrket på mikroskopiske objektglass og behandlet med embelin i 24 timer. Etter behandling ble cellene fiksert, permeabilisert, og deretter farget ved å bruke spesifikke antistoff. Cellene ble deretter farget med Texas Rødt-merkete-sekundært antistoff. Fluorescens ble bestemt ved bruk av konfokal mikroskopi. G, Expression of VDAC1 og oligomerisering av VDAC1. Embelin-behandlede celler ble høstet, og deretter inkubert med sulfo-EGS (250 pM) i 25 minutter ved 30 ° C. Etter at proteinene ble oppløst ved SDS-PAGE (8%), ble VDAC1 proteiner målt ved anvendelse av Western blot-analyse. En 33 kDa båndet representerer VDAC1 monomerer mens et band på 65 kDa representerer VDAC1 dimer. Mitokondrielle fraksjon ble isolert og løst ved hjelp av SDS-PAGE (12%) og Western blot-analyse ble utført. COX-4 nivå ble bestemt som en lasting kontroll for mitokondriene.
Hemming av embelin av Akt aktivering og β-catenin veien
Tidligere Chen et al. rapporterte en ny bane som består av Akt, og COX-2 for ervervet resistens apoptose i kreftceller [17]. Fordi vi fant ut at embelin undertrykker Akt fosforylering og COX-2 uttrykk ble bestemt. Celler ble behandlet med 30 uM embelin til 6, 12 eller 24 timer, og nivåene av fosfo-Akt (Tjen 473), total Akt, og COX-2 ble målt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 4A, fosforylering av Akt i Ser 473 og ekspresjon av COX-2 ble signifikant redusert med embelin, selv om de totale Akt nivåene ikke endres vesentlig. Ved 24 timer etter embelin behandling var fosfor-Akt og COX-2-nivåene redusert med 99% og 52%, henholdsvis, fra nivået av kontrollceller. Samtidig, evaluerte vi inhibering av Akt-aktivering i PC3-celler, ble fosforylering av Akt og cellenes levedyktighet ble redusert med Akt inhibitor IV (0,3 pM) (figur 4B). Når celler ble transfektert med pece-Myr-Akt plasmid for ekspresjon av konstitutivt aktiv Akt, embelin-formidlet reduksjon av Akt fosforylering på Ser 473 (fig 4C). Videre fant vi at embelin-mediert nedgang i celle levedyktighet ble forhindret av Myristoylated Akt uttrykk. Embelin inhiberte også COX-2 promoteraktivitet, som bestemmes av luciferase reporter-analysen, noe som indikerer at embelin kan hemme Mcl-1-ekspresjonen ved blokkering av Akt-COX-Mcl-en reaksjonsvei.
(A) Celler ble behandlet med 30 uM embelin for de angitte tidsperioder, og hele cellelysater ble fremstilt, og ekstraherte proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse ved anvendelse av fosfo-Akt, total Akt, og COX-2-antistoffer ble utført. Tallene mellom blottene er prosenter av intensiteten av båndene etter normalisert med kontroll. (B) Celler ble transfektert med Myr-Akt-plasmid og deretter behandlet med 30 pM av embelin i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av CCK. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige bestemmelser. * Signifikant forskjellig fra de ubehandlede kontrollceller (
p
0,01) og **, vesentlig forskjellig fra den embelin bare-behandlede celler (
p
0,001). Helcellelysater ble fremstilt og nivåene av total Akt og fosfo-Akt ble bestemt ved Western blot-analyse. (C) AKT-inhibitor IV behandles cellelysater ble fremstilt og ekstraherte proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse ved bruk av fosfor-Akt, total Akt, og GAPDH-antistoffer ble utført. Celler ble behandlet med 0,312 uM av AKT-inhibitor IV i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av CCK. Formazan-dannelse ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 450 nm. Prosentandelen av celler overlevende i hver gruppe i forhold til kontrollgruppen ble beregnet. (D) Celler ble transfektert med COX-2-luciferase vektor og Renilla luciferase-vektor i 48 timer. Celler ble utsatt for dual-luciferase-assay. Den relative ildflue luciferase-aktivitet, normalisert med Renilla luciferaseaktiviteten er vist. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige bestemmelser * signifikant forskjellig fra ubehandlet kontroll (
p
0,05)..
Forrige rapport tyder på at β-catenin spiller en avgjørende rolle i flere vekstsignaler i menneskelige prostata kreft celler [23]. For å bestemme effekten av embelin på β-catenin ekspresjon, ble PC3-celler behandlet med embelin (30 uM) i opptil 24 timer og Western blotting ble utført. Figur 5A viser at embelin er i stand til å redusere den β-catenin nivå i et tidsavhengig måte. Ved 24 timer etter embelin behandling, ble nivået av β-catenin redusert med 40% i forhold til nivået i kontrollceller. Vi har fastslått TOP flash luciferaseaktivitet for å måle nivået av β-catenin nukleær translokasjon og TCF transkripsjonen aktivering. Embelin (30 pM) hemmet signifikant TOPflash aktivitet til 19% av kontrollen ved 24 timer behandling (figur 5B). Konfokalt mikroskopisk analyse bekreftet også at behandling med embelin tydelig redusert nivået av β-catenin i PC3-celler (figur 5C). Transkripsjon av mål-gener i β-catenin, for eksempel cyklin D1, c-myc, eller MMP-7 var også signifikant undertrykt av embelin (figur 5D). Interessant, mRNA transkripsjon av MMP-7 ble nesten fullstendig blokkert etter 12 timers behandling med embelin. Western blot-analyse viste også at embelin sterkt redusert cyklin D1, c-Myc, og MMP-7 proteinnivåer (figur 5D).
(A) Hele cellelysatene ble fremstilt og ekstraherte proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse ved bruk av β-catenin, fosfo-β-catenin, eller GSK-3P-antistoffer ble utført. Tallene mellom blottene er prosenter av intensiteten av båndene etter normalisert med kontroll. (B) Luciferase-analyse. TOPFlash eller FOPFlash-transfekterte celler ble behandlet med embelin. Luciferase-aktiviteten ble målt og den relative ildflue luciferase-aktivitet, normalisert med Renilla luciferaseaktiviteten er vist. (C) Cellene ble sådd ut på dekkglass i 24 timer og behandlet med 30 uM embelin opp til 24 timer. Deretter ble cellene farget med β-catenin antistoff og fluorescens ble bestemt ved bruk av konfokal mikroskopi. (D) Ekspresjon av cyclin D1, c-Myc og MMP-7 ble bestemt ved hjelp av kvantitativ PCR og Western blot-analyse. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige bestemmelser *,
#
§, vesentlig forskjellig fra den ubehandlede kontroll (
p
0,05).. Tallene mellom blotter er prosenter av intensiteten av båndene etter normalisert med kontroll.
Forrige rapport antydet at GSK-3β modulerer β-catenin nivåer ved fosforylering av β-catenin på Ser 33/37 og Thr 41 [24]. Vi undersøkte hvorvidt embelin er i stand til å forbedre GSK-3β stabilitet og aktivitet. Som vist i figur 6A, har vi funnet at embelin sterkt hindret fosforylering av GSK-3β videre Ser 9 av Akt aktivering. Embelin sterkt indusert fosforylering av β-catenin på Ser 33/37 /Thr 41 og kan fremme β-catenin degradering. Vi antok at embelin-mediert økning i fosforylering av β-catenin kan være forårsaket av GSK-3β aktivering fordi den reduserte β-catenin nivå ved embelin behandling var nesten fullstendig gjenvunnet ved behandling med LiCl (20 mM), en GSK-3β hemmer . LiCl også redusert den embelin-mediert induksjon av β-catenin fosforylering. Som behandling med LiCl ikke gjenvinne embelin-formidlet reduksjon av GSK-3β fosforylering, kan LiCl hemme GSK-3β aktivitet, men som ikke endrer GSK-3β fosforylering. Interessant nok var det Mcl-1-nivået øket 1,4 ganger etter LiCl behandling og redusert nivå av Mcl-1BY embelin var signifikant gjenvunnet ved LiCl (figur 6A). Disse resultater antyder at Mcl-1-ekspresjonen moduleres av GSK-3β aktivitet. Maurer et al. rapporterte at hemming av GSK-3β gjennom Akt aktivering indusert Mcl-1-ekspresjon [25]. Våre data også bekreftet at GSK-3β aktivering av embelin-mediert Akt hemming undertrykker Mcl-1 uttrykk. Videre LiCl indusert TOPFlash aktivitet 2,5 ganger av kontroll og embelin inhiberte TCF transkripsjonelle aktivering forårsaket av LiCl-induserte økning i β-catenin (figur 6B). Confocal mikroskopisk analyse viste at behandling med embelin nesten fullstendig hemmet β-catenin uttrykk (Fig 6C). Behandling med LiCl gjenvunnet embelin-mediert reduksjon i β-catenin uttrykk.
