Abstract
Bestråling og DNA-skade kjemoterapeutika er vanligvis brukes i kreft behandlinger. Følgende DNA skade FOXM1 protein nivåer er ofte forhøyet. I denne studien, søkte vi å undersøke potensialet rolle FOXM1 i programmert celledød indusert av DNA-skade. Humane kreftceller etter FOXM1 undertrykkelse ble utsatt for doksorubicin eller γ-bestråling behandling. Våre funn tyder på at FOXM1 downregulation av stabil eller forbigående knockdown bruker RNAi eller ved behandling med proteasomhemmere som er rettet mot FOXM1 sterkt sensibiliserte humane kreftceller av ulik opprinnelse til DNA-skade-indusert apoptose. Vi viste at FOXM1 undertrykker aktivering av pro-apoptotiske JNK og positivt regulerer anti-apoptotiske Bcl-2, noe som tyder på at JNK-aktivering og Bcl-2 nedregulering kan mediere følsomhet overfor DNA-ødeleggende middel-fremkalt apoptose etter målretting FOXM1. Siden FOXM1 er allment uttrykt i kreft hos mennesker, våre data støtte videre det faktum at det er et gyldig mål for kombinatorisk kreftbehandling
Citation. Halasi M, Gartel AL (2012) Undertrykkelse av FOXM1 sensitizes humane kreftceller til celledød indusert av DNA-skade. PLoS ONE 7 (2): e31761. doi: 10,1371 /journal.pone.0031761
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 14 september 2011; Godkjent: 18 januar 2012; Publisert: 29 februar 2012
Copyright: © 2012 Halasi, Gartel. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) innvilger 1RO1CA1294414 og 1R21CA134615 til Dr. Gartel. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
γ-bestråling og DNA-skade cellegifter spille en nøkkelrolle i kreftbehandling på grunn av deres evne til å indusere DNA dobbelttrådbrudd som fører til kreft celledød [1]. Siden kreftceller ofte bli resistent mot DNA-skadende midler, er det viktig å bestemme mekanismene for medikamentresistens. Flere studier har rapportert at i respons på IR, etoposid, daunorubicin eller doksorubicin behandlings FOXM1 proteinnivået øker på en doseavhengig måte [2] – [4]. FOXM1 er ansett for å være en hovedregulator av cellesyklusen [5], [6] ved å kontrollere ekspresjonen av gener som er avgjørende for G1 /S og G2 /M progresjon [7]. FOXM1 er rikelig uttrykt i et bredt spekter av humane cancere [8] – [11], som tyder på at målretting FOXM1 kan være et terapeutisk strategi mot humane ondartede sykdommer [12], [13]. FOXM1 har vært innblandet i DNA-skade svar pathway, for eksempel DNA-reparasjonsgener, ble XRCC1 og BRCA2 identifisert som direkte transcriptional mål for FOXM1 [2]. I tillegg har den rolle FOXM1 i respons til DNA-skade blitt undersøkt i sammenheng med humane cancerceller med villtype p53 [2], [11], [14], [15]. Imidlertid tumor suppressor p53 ble funnet å være en negativ regulator av FOXM1 og DNA-skade sterkt oppregulert nivået FOXM1 i fravær av p53 [3], [4]. Følgelig hypotese vi at DNA-skadende kjemoterapeutiske midler ikke være så effektiv i fravær av p53, som de stabiliserer FOXM1 proteinnivå som fører til beskyttelse mot DNA-skade-indusert apoptose. Siden FOXM1 er potensielt et oncogent transkripsjonsfaktor, og det er også involvert i invasjon og angiogenese [16] – [24], behandling av tumorer hvor p53 er mutert eller inaktivert med DNA-skadende midler kan være skadelig for pasienter. Vår gruppe tidligere rapportert at suppresjon av FOXM1 av tiazol antibiotika [25] – [28] og av proteasomhemmere [29] korrelerer med graden av apoptose som tyder på at FOXM1 kan virke som en potensiell inhibitor av apoptose [25] – [27]. Dessuten har det nylig blitt vist at brystcancerceller med forhøyede nivåer av FOXM1 ble ufølsom for Herceptin, paklitaxel [30] og cisplatin [11]. Derfor er det åpenbart at FOXM1 kan hemme apoptose indusert ved hjelp av forskjellige kreftmedisiner
c-Jun N-terminale kinaser (JNKs; også kjent som stress-aktiverte protein-kinaser, SAPKs). Svare på forskjellige ekstracellulære stimuli og miljø påkjenninger [31]. JNK-signalveien regulerer mange cellulære prosesser, for eksempel proliferasjon, overlevelse, apoptose og differensiering [32]. FOXM1 har vist seg å aktivere transkripsjonelt JNK1 å kontrollere cellesyklusprogresjon og invasjon [18]. Imidlertid er resultatet av JNK-aktivering bestemt av varigheten av JNK-signal [33], [34]. Short-term JNK-aktivering er knyttet til proliferasjon, mens vedvarende aktivering av JNK vanligvis fører til apoptose [33], [34]. B-celle lymfom 2 (Bcl-2) er en antiapoptotic medlem av Bcl-2-familien [35], [36]. BCL-2 har en sentral rolle i den iboende apoptotiske sti fungerer som vokteren av mitokondriene ved å hemme Bax aktivering [35], [37]. Tvunget overekspresjon av Bcl-2 i flere dyrkede cellelinjer dratt resistens mot kjemoterapi og strålebehandling [35].
I denne studien har vi undersøkt om FOXM1 spiller en rolle i celledød indusert av DNA-skader i menneskelig svulst cellelinjer med mutert p53. Vi viser at stabil eller transient knockdown av FOXM1 å bruke RNAi øker følsomheten av forskjellige humane kreftceller til DNA-skadende midler, inkludert doksorubicin behandling og γ-bestråling. Videre viser vi at kombinasjonen av proteasomhemmere som hemmer FOXM1 med DNA-skadende midler induserer apoptose meget robust. Våre funn tyder på at JNK-aktivering og Bcl-2 nedregulering kan ta hensyn til den økte celledød etter undertrykkelse av FOXM1 i kombinasjon med DNA-skade.
Materialer og metoder
Cellekultur, kjemiske forbindelser og behandlinger
MIA Paca-2 bukspyttkjertel (ATCC), Hep3B lever (ATCC), HCT 116 og HCT 116 shp53 kolon [38] humane kreftcellelinjer ble dyrket i DMEM medium (Invitrogen). MDA-MB-231 (ATCC) bryst humane kreftcellelinjen ble dyrket i RPMI-medium (Invitrogen). Mediene ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) og 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), og cellene ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2. Stabile cellelinjer (Fig. 1) ved hjelp av ATCC erholdte parentale celler ble samlet ved transduksjon av kontroll og FOXM1 shRNA lentivirale partikler (Sigma) etterfulgt av seleksjon med puromycin (Sigma). Doksorubicin (Fisher Scientific), tiostrepton (Sigma), bortezomib (VELCADE) (Millenium Pharmaceuticals) og JNK inhibitor SP600125 (A.G. Scientific) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (Fisher Scientific). Bestråling ble utført ved hjelp av en
137Caesium γ-kilde (JL Shepherd modell 6810, JL Shepherd, San Fernando, California). Ved en dose på 8 og 10 Gy
(A) HCT 116 p53 dyktig og mangelfulle menneskelige tykktarmskreftceller med FOXM1 knockdown ble behandlet med doksorubicin (Doxo) som angitt. Immunoblotting for FOXM1, p53, spaltet caspase-3, PARP og β-aktin som lastekontroll ble foretatt 24 timer etter behandlingen. (B) MIA Paca-2 vektor kontroll og FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av doxorubicin. Tjuefire timer etter behandling cellelysater ble immunoblottet for FOXM1, spaltet caspase-3, PARP og β-aktin som laste kontroll. (C) MDA-MB-231 vektorkontroll og FOXM1 knockdown brystcancerceller ble behandlet med doksorubicin som angitt. ble utført immunoblotanalyse for FOXM1, spaltet caspase-3 og β-aktin som laste kontroll 48 timer etter behandling. (D) Hep3B vektor kontroll og FOXM1 knockdown leverkreftceller ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av doxorubicin. Cellelysater ble immunoblottet for FOXM1, spaltet caspase-3 og β-aktin som laste kontroll 24 timer etter behandling. (E) kreft i bukspyttkjertelen celler MIA Paca-2 ble transfektert med kontroll og FOXM1 siRNA i 48 timer, og deretter behandles som angitt. Tjuefire timer etter behandling immunoblotting ble utført med FOXM1, kløyvde caspase-3 og p-aktin antistoffer. (F) brystcancerceller MDA-MB-231 ble transfektert med kontroll og FOXM1 siRNA i 48 timer, deretter behandlet med de angitte konsentrasjoner av doksorubicin. Førti-åtte timer etter behandling cellelysater ble immunblottet for FOXM1, kløyvde caspase-3 og β-actin som lasting kontroll.
immunoblotanalyse
Behandlet cellene ble høstet og bearbeidet for immunoblotting, som beskrevet i ref. [27] med antistoffer som er spesifikke for FOXM1 (kanin-polyklonalt antistoff mot FOXM1 ble beskrevet tidligere [45]), p53 (Santa Cruz), spaltet caspase-3 (celle signalisering), PARP-1/2 (Santa Cruz), Total og fosfor-SAPK /JNK (Cell signalering), BCL-2 (Santa Cruz), BCL-xL (Cell signalering) og β-aktin (Sigma). Kvantifisering ble gjort med bilde J-programvaren (NIH). Relative protein nivåer ble normalisert til de tilsvarende aktin nivåer.
Transfeksjon og siRNA
Control (AACAGUCGCGUUUGCGACUGGUU) små interfererende RNA (siRNA) og siRNA spesifikke for FOXM1 (GGACCACUUUCCCUACUUUUU) ble syntetisert av Sigma. 50 nM av siRNA tomannsboliger ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefaling. Cellene ble behandlet som indikert 48 timer etter transfeksjon.
Total RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time (QRT) -PCR
Hvis du vil trekke total RNA ble cellene høstet ved TRIzol reagens (Invitrogen). cDNA ble syntetisert ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Kvantitativ real time PCR ble kjørt med ABI 7900 HT (Applied Biosystems) maskin. De følgende primere ble anvendt: human Bcl-2 (Sense, 5′-TGG GAT GCC TTT GTG GAA CT-3 «, Antisense, 5′-GAG ACA GCC AGG AGA AAT CAA AC-3′) [46] og human cyklofilin (Sense, 5»-GCA GAC AAG GTC CCA AAG ACA G-3 «; Antisense, 5»-CAC CCT GAC ACA TAA ACC CTG G-3). [25]
Flowcytometri – propidium Iodide farging
Celler ble behandlet som indikert og høstes ved trypsinering. Deretter ble cellene vasket i PBS og fiksert i iskald 95% etanol. Etter fiksering ble cellene farget med propidiumjodid (50 ug /ml) (Invitrogen) i PBS /RNase A /Triton X-100 i 30 minutter ved romtemperatur og analysert ved strømningscytometri.
kolonidannende analyse
1 × 10
5 celler ble sådd ut på 100 mm skåler i duplikater og ble behandlet som angitt i 24 timer. Kolonier fikk lov til å danne for 10 dager, og deretter ble cellene farget med krystallfiolett.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med Microsoft Excel ved hjelp av Student
t
test (tosidige).
P
verdier av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater og Diskusjon
knockdown av FOXM1 sensitizes humane kreftceller til DNA-skadende midler
Først isogene HCT 116 p53 dyktige og manglende humane tarmkreftceller med FOXM1 knockdown ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av doksorubicin (Doxo) og celledød ble bestemt ved immunoblotting for markører for apoptose inkludert spaltede caspase-3 og PARP (fig. 1A ). Knockdown av FOXM1 økt følsomhet for tykktarmskreftceller til doxorubicin-mediert apoptose uavhengig av p53 status. p53 dyktige celler med FOXM1 knockdown gikk sterkere apoptose i forhold til sine p53 mangelfulle kolleger. Denne observasjonen kan forklares ved tilstedeværelsen av p53-avhengig apoptotiske signalering i p53-dyktig celler, men ikke på p53-manglende celler etter DNA-skade.
Ca 50% av humane tumorer havn mutant eller inaktivert p53; følgelig p53-avhengige apoptotiske reaksjonsvei kan ikke utnyttes for utrydding av kreftceller etter behandling mot kreft [39]. For å undersøke den mulige rolle FOXM1 i DNA-skade-indusert apoptose i cellelinjer med mutert p53, som vanligvis er mer resistente overfor kjemoterapi enn cancercellelinjer med vill-type p53, MIA PACA-2-vektorkontroll og FOXM1 knockdown human bukspyttkjertelkreft cellelinjer som bærer mutant p53 ble behandlet med økende konsentrasjoner av doksorubicin og immunblotting ble utført for FOXM1, spaltet caspase-3 og PARP (fig. 1B). I samsvar med tidligere undersøkelser [2] – [4], [11], [14], [40], vi også observert at følgende DNA-skade FOXM1 proteinnivå er forhøyet. Men enda viktigere, har vi funnet at fravær av FOXM1 sensibilisert kreftceller til celledød indusert av doksorubicin (fig. 1B) som detektert ved spalting av caspase-3 og PARP. For å bekrefte at dette fenomenet er ikke cellelinje bestemt, MDA-MB-231 human bryst (p53-mutant) (Fig. 1C) og Hep3B human lever (p53-null) (Fig. 1 D) vektor kontroll og FOXM1 knockdown kreftceller var behandlet med forskjellige konsentrasjoner av doksorubicin. Western blot analyse av spaltet caspase-3 viste at knockdown av FOXM1 også sensitiv bryst og lever kreftceller til doksorubicin-indusert apoptose.
I tillegg har vi testet om forbigående knockdown av FOXM1 resulterer i økt apoptose etter DNA-skade. For å oppnå tilstrekkelig forbigående knockdown av FOXM1 vi utnyttet små interfererende RNA (siRNAs) mot FOXM1. MIA PACA-2 bukspyttkjertel (fig. 1E), og MDA-MB-231 bryst (fig. 1F) kontroll og FOXM1 knockdown kreftceller ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av doksorubicin. Vi fant at celler med transiente FOXM1 knockdown var mer mottagelige for apoptose etter DNA-skade som påvist ved immunblotting for spaltede caspase-3, noe som ytterligere støtter ideen om at FOXM1 kan spille en rolle i DNA-skade-indusert apoptose.
for å bekrefte denne effekten, ble MIA PACA-2 og MDA-MB-231 vektorkontroll og FOXM1 knockdown-celler utsettes for ioniserende stråling. γ-bestråling også indusert apoptose robust som detektert ved spalting av caspase-3 i FOXM1 knockdown-celler (fig. 2A, B). I tillegg, for å vurdere kvantitativt graden av celledød indusert av γ-bestråling MIA PACA-2 og MDA-MB-231 vektorkontroll og FOXM1 knockdown cellene ble y-bestrålt med forskjellige doser, høstet og farget med propidiumjodid. Omfanget av apoptose ble målt ved flow-cytometri (fig. 2C, D). Begge bukspyttkjertelen og bryst FOXM1 knockdown celler utstilt betydelig økning i celledød etter behandling i forhold til de bestrålte kontroll kolleger. Til sammen disse dataene tyder på at undertrykke FOXM1 i humane kreftceller kan gjøre dem mer utsatt for celledød indusert av DNA-skadende midler.
(A) MIA Paca-to-kontroll og FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler var γ- bestrålt med 8 og 10 Gy. Sytti-to timer etter bestråling ble cellene høstet og immunoblotting ble utført med antistoffer for FOXM1 og kløyvet caspase-3. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (B) MDA-MB-231-kontroll og FOXM1 knockdown brystcancerceller ble utsatt for y-bestråling med de angitte doser. Førti-åtte timer etter bestråling ble cellene høstet og immunblotting ble utført for FOXM1, spaltet caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (C-D) Grad av celledød ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri følgende propidiumjodidfarging på MIA PACA-2 bukspyttkjertel og MDA-MB-231 bryst-kontroll og FOXM1 knockdown kreftceller, henholdsvis 48 timer etter γ-bestråling. Diagrammet viser kvantifisering som en prosentandel av apoptotiske celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller vektoren, ± SD av et representativt triplikat (C) eller like (D) eksperiment.
Behandling med proteasomhemmere sensitizes humane kreftceller til apoptose indusert av DNA-skade
Vår gruppe har rapportert tidligere at thiazole antibiotika Thiostrepton og Siomycin A er potente hemmere av FOXM1 [25] – [28] og fungere som proteasomhemmere [29]. Videre har vi vist at velkjente proteasomhemmere som bortezomib (VELCADE) og MG132 også målrette FOXM1 [29]. Nedregulering av FOXM1 er en av de midler, ved hvilke proteasomhemmere kan indusere celledød in vitro og in vivo [27], [29], [41], men det er selvfølgelig flere potensielle FOXM1 uavhengige mekanismer for proteasominhibitor-indusert celledød at vi ikke diskuterer i denne studien. For å teste FOXM1 /proteasomhemmere sammen med DNA-skadende midler, ble MIA PACA-2 bukspyttkjertelkreft cellelinje behandlet med kombinasjonen av doksorubicin og bortezomib (Bor) (fig. 3A) eller tiostrepton (thio) (Fig. 3B), respektivt . Vi har funnet at inhibitorer av FOXM1, tiostrepton og bortezomib trykkes FOXM1 uttrykket (data ikke vist) [27], [29] og i kombinasjon med doxorubicin oppviste sterkere spalting av caspase-3 eller PARP sammenlignet med behandling med medikamenter som enkle midler. I tillegg MIA PACA-2 kreft i bukspyttkjertelen celler ble y-bestrålt sammen med behandlingen av tiostrepton eller bortezomib (Fig. 3C). Western blot-analyse for spaltede caspase-3 viste at MIA PACA-2-cellene var mer følsomme overfor kombinasjonen av γ-bestråling og tiostrepton eller bortezomib, henholdsvis, enn til individuell behandling.
(A) bukspyttkjertelen kreftcellene MIA PACA-2 ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av doksorubicin og bortezomib (Bor) alene eller i kombinasjon. 24 timer etter behandling cellelysatene ble analysert ved immunblotting med spaltede caspase-3, PARP og p-aktin-antistoffer. (B) MIA PACA-2 kreft i bukspyttkjertelen celler ble behandlet med doksorubicin og tiostrepton (thio) alene eller i kombinasjon med de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Immunoblotting ble utført med antistoffer som er spesifikke for spaltede caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (C) bukspyttkjertelcancercellelinje MIA PACA-2 ble utsatt for y-bestråling og behandles i kombinasjon med tiostrepton eller bortezomib i 24 timer. Immunoblotting ble utført for spaltede caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (D) MDA-MB-231 brystcancerceller ble behandlet med doksorubicin i kombinasjon med tiostrepton eller bortezomib som indikert i 24 timer. Cellelysater ble analysert ved immunblotting med antistoffer som er spesifikke for spaltede caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (E) Hep3B leverkreftceller ble behandlet med doksorubicin og tiostrepton alene eller i kombinasjon, som indikert i 24 timer. Immunoblotting ble utført med antistoffer som er spesifikke for spaltede caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (F) brystkreft cellelinje MDA-MB-231 ble utsatt for y-bestråling og behandles i kombinasjon med tiostrepton eller bortezomib i 24 timer. Immunoblot-analyse ble utført med spaltede caspase-3 og p-aktin-antistoffer. (G-H) 1 x 10
5 MIA PACA-2 (G) eller MDA-MB-231 (H) humane kreftceller ble belagt og behandlet som indikert i 24 timer. 10 dager etter behandling ble cellene farget med krystallfiolett og representative plater vises. Grafen viser kvantifisering ± SD av dupliserte eksperimenter (*,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001).
For ytterligere å bekrefte denne effekten, ble MDA-MB-231 bryst og Hep3B leverkreftceller behandlet med doksorubicin (fig. 3D, E) eller bestrålt (fig. 3F) i kombinasjon med Thiostrepton eller bortezomib, henholdsvis. Analyse av spaltet caspase-3 ekspresjon ved western blot viste at kombinasjonen av DNA-skadende midler med FOXM1 /proteasomhemmere ført til økt apoptose i bryst og leverkreftceller sammenlignet med behandling med medikamenter alene. Siden behandling med DNA-skadende midler i forbindelse med FOXM1 /proteasomhemmere indusert slik merket apoptose, ble effekten av kombinasjonen også undersøkt om langtidsoverlevelse ved å utføre klonogene analysen. MIA PACA-2 og MDA-MB-231 humane kreftceller ble behandlet med γ-bestråling sammen med tiostrepton eller bortezomib og ble vurdert 10 dager senere (fig. 3 G, H) i kolonidannende evne. Vi har funnet at kombinasjonen av γ-bestråling og FOXM1 /proteasomhemmere inhiberte signifikant kolonidannelse som gir opphav til mye mindre antall kolonier i forhold til individuell behandling. Samlet utgjør disse data tyder på at kombinasjonen av brukte DNA-skade kjemoterapeutika og FOXM1 /proteasomhemmere kan anses som en behandlingsstrategi for å bedre terapeutisk respons i ulike kreftbehandlinger.
Følsomhet for DNA- skade etter undertrykkelse av FOXM1 er delvis tilskrives JNK-aktivering og Bcl-2 nedregulering
det er et interessant faktum at FOXM1, en kjent regulator av cellesyklusen, kan hemme DNA-skade-indusert apoptose. For å belyse mulig underliggende mekanisme viste vi til JNK-signalveien, fordi det har vært implisert i å svare på forskjellige stimuli, inkludert forskjellige apoptotiske stimuli [32]. Det har blitt rapportert at γ-bestråling fører til JNK-aktivering, som formidler strålings-indusert apoptose [33], [42] – [44]. For å bestemme virkningen av DNA-skade på aktivering av JNK i nærvær eller fravær av FOXM1, MIA PACA-2 vektorkontroll og FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler ble γ-bestrålt og immunoblottet for fosfo-SAPK /JNK (fig. 4A) . Det ble observert at i FOXM1-knockdown-celler ved induksjon av celledød følgende γ-bestråling ble ledsaget av økt fosforylering av JNK, noe som tyder på at FOXM1 kan hemme aktivering av JNK, i nærvær av DNA-skade. For å undersøke den potensielle rolle av JNK-aktivering i apoptose indusert av DNA-skader i FOXM1 knockdown-celler, MIA PACA-2 bukspyttkjertel og MDA-MB-231 bryst FOXM1 knockdown cancerceller ble y-bestrålt i nærvær av den spesifikke JNK inhibitor , SP600125 (fig. 4B-E). Western blot-analyse for spaltede caspase-3, viste at induksjon av apoptose ved bestråling ble svekket ved behandling med JNK-inhibitor, som tyder på at JNK-aktivering er delvis ansvarlig for programmert celledød etter DNA-skade.
(A) MIA PACA-2 kontroll og FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler ble y-bestrålt med de angitte doser. Syttito timer etter bestråling ble cellene høstet og immunblotting ble utført med antistoffer som er spesifikke for Phospho /Total-SAPK /JNK og spaltet caspase-3. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (B) MIA PACA-2 FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler ble forinkubert i en time med 10 pM av JNK-inhibitor, SP600125 og deretter ble y-bestrålt som angitt. Førti-åtte timer etter bestråling ble cellene høstet og immunblotting ble utført for spaltet caspase-3 og β-aktin som laste kontroll. (C) Grafene viser gjennomsnittsverdier ± SEM av fire uavhengige forsøk. (D) MDA-MB-231 FOXM1 knockdown brystcancerceller ble forinkubert i en time med 10 pM av JNK-inhibitor, SP600125 og deretter ble utsatt for y-bestråling med de angitte doser. Sytti-to timer etter bestråling ble cellene høstet og immunoblotting ble utført med kløyvde caspase-3 og p-aktin antistoffer. (E) Grafene viser gjennomsnittsverdier ± SEM av to uavhengige eksperimenter. (F) i bukspyttkjertelen MIA Paca-to-kontroll og FOXM1 knockdown kreftceller ble utsatt for ioniserende stråling med de angitte doser. Trettiseks timer etter bestråling ble cellene høstet og immunblotting ble utført med antistoffer som er spesifikke for Bcl-2 og Bcl-xL. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (G) Breast MDA-MB-231-kontroll og FOXM1 knockdown kreftceller ble y-bestrålt som angitt. Sytti-to timer etter bestråling ble cellene høstet og immunoblotting ble utført for BCL-2. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (H) MIA Paca-to-kontroll og FOXM1 knockdown kreft i bukspyttkjertelen celler ble høstet for RNA ekstraksjon. Kvantitativ RT-PCR ble utført med Bcl-2 og cyklofilin primere. Grafen viser gjennomsnittsverdier ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. (I) Å trekke ut RNA MDA-MB-231-kontroll og FOXM1 knockdown brystkreft celler ble høstet. Ved hjelp av Bcl-2 og cyclophlin primere QRT-PCR ble utført. Diagrammet viser gjennomsnittsverdier ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Vi har også sett på flere mekanismer som kan være involvert i allergi til DNA-skader i fravær av FOXM1. Bcl-2-familien av proteiner som er en av de store regulatorer av apoptose [35] – [37]. Bcl-2 er best kjent for å forhindre apoptose av styrende mitokondriemembranintegritet [35] – [37]. Bcl-2 ble også funnet å gi resistens mot kjemoterapeutiske midler og bestråling på forskjellige cellelinjer [35]. Immunoblot analyse av Bcl-2 og Bcl-xL uttrykk etter γ-bestråling avslørte at BCL-2 ble nedregulert i FOXM1 knockdown bukspyttkjertelen og brystkreftceller (Fig. 4F, G), mens BCL-xL proteinnivå forble uendret (Fig. 4F ). For å undersøke om BCL-2 er en transkripsjons mål av FOXM1 ble BCL-2 mRNA uttrykk vurdert av kvantitativ real-time (QRT) -PCR i vektor kontroll og FOXM1 knockdown bukspyttkjertelen og brystkreft celler. FOXM1 knockdown førte til 30-40% reduksjon av Bcl-2-mRNA-ekspresjon (Fig. 4 H, I), noe som tyder på at FOXM1 transkripsjonelt opp-regulerer Bcl-2. Senere eksperimenter for å bestemme hvorvidt Bcl-2 er et direkte mål for FOXM1. Disse dataene antyder at undertrykkelse av FOXM1 kanskje også bevisstgjøre humane kreftceller til DNA-skade via BCL-2 downregulation.
I sammendraget, vi demonstrert at FOXM1 undertrykkelse av stabil eller forbigående knockdown bruker RNAi (Fig. 1, 2 ) eller ved behandling med FOXM1 /proteasomhemmere (fig. 3) sensitizes humane kreftceller av forskjellig opprinnelse til apoptose indusert ved DNA-skadende midler, inkludert doksorubicin og γ-bestråling. Effekten av endogent FOXM1 knockdown i humane cancerceller i apoptose etter doksorubicin og γ-bestråling behandling har aldri blitt før undersøkt. JNK-aktivering og Bcl-2 nedregulering som et resultat av FOXM1 knockdown kan forklare motstanden FOXM1 dyktige celler i apoptose etter DNA-skade. Samlet sett våre funn i samsvar med tidligere rapporter [11], [14] bekrefte at målretting FOXM1 i kombinasjon med DNA-skade medikamenter eller med γ-bestråling kan være en verdifull terapeutisk tilnærming mot ulike typer kreft hos mennesker. Siden noen av FOXM1 /proteasomhemmere som bortezomib er allerede i klinisk praksis, de data som presenteres her antyder også at administrasjonen av brukte DNA-skade kjemoterapeutika i forbindelse med FOXM1 /proteasomhemmere eller med andre potensielle FOXM1 hemmere bør være berettiget seriøs vurdering for å bedre terapeutisk utfall.
takk
Vi ønsker å takke Dr. Bill Nogueira (University of Illinois i Chicago) for hennes hjelp til å utføre flowcytometrisk målinger. Vi takker også Dr. Jessica J. Gierut (Harvard Medical School) for å lese manuskriptet og for hennes verdifulle kommentarer.
