Abstract
Dette arbeidet rapporterer bruk av lag analyse for å hjelpe fluorescens levetid diagnosen cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) fra H E farget cervical vev seksjoner. Gjennomsnitt og standardavvik for liv i én region av interesse (ROI) av livmorhals epitel ble tidligere vist å korrelere til gullstandarden histopatologisk klassifisering av tidlig livmorhalskreft. Disse tidligere definerte enkelt ROIs ble jevnt fordelt på lag for analyse. En 10-lags-modellen viste en jevn økning i fluorescens levetid fra de indre til de ytre epitel-lag av friske vevssnitt, noe som tyder på et nært samarbeid med cellulær modning. Jo kortere levetid og minimal levetid økning opp mot overflaten av CIN-berørte regionene er i god overensstemmelse med fravær av cellemodning i CIN. Mean lag liv i den øverste halvdelen livmorhals epitel ble brukt som har vektorer for ekstreme læring maskin (ELM) Klassifiserings diskriminering. Det ble funnet at den foreslåtte lag analyseteknikken forbedrer sensitiviteten og spesifisiteten til 94,6% og 84,3%, henholdsvis, som bedre kan supplere de tradisjonelle gullstandarden livmorhals histopatologiske undersøkelser
Citation. Gu J, Fu CY, ng BK, Liu LB, Lim-Tan SK, Lee CGL (2015) Forbedring av tidlig livmorhalskreftdiagnose med epithelial lag Analyse av fluorescens levetid Images. PLoS ONE 10 (5): e0125706. doi: 10,1371 /journal.pone.0125706
Academic Redaktør: Margaret McLaughlin-Drubin, Brigham and Women Hospital /Harvard Medical School, USA
mottatt: 26 desember 2014; Godkjent: 18 mars 2015; Publisert: 12. mai 2015
Copyright: © 2015 Gu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forfatterne erklærer at dette arbeidet er støttet av en intern oppstart stipend (SUG /NBK /2014) fra Nanyang Technological University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år rundt 300.000 kvinner dør av livmorhalskreft med ca 510 000 nye tilfeller diagnostisert [1, 2]. Forut for invasiv kreft er saktevoksende cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) fase hvor tidlig oppdagelse og behandling er gjennomførbart. Derfor har mange cervixscreening protokoller er iverksatt for å oppdage pre-maligne livmor endringer og livmorhalskreft assosiert dødsfall har gått betydelig ned.
Den primære screening metode for tidlig livmorhalskreft er den Papanicolaou (PAP) celleprøver. Celler fra livmorhalsen vegg med mistenkt tegn på neoplasi samles for mikroskopisk undersøkelse. Imidlertid er det Pap test komplisert og arbeidskrevende, og det viser en samtidig lav følsomhet (≤58%) og spesifisitet (69%) [3, 4], innebærer behovet for gjentatte tester for å redusere de falske-negative. I tillegg har kolposkopi som senere skal utføres for å bekrefte den unormalt. I kyndige hender kolposkopi kan oppnå utmerket følsomhet ( 90%), men lav spesifisitet ( 50%), som krever videre en rettet biopsi for definitiv diagnose [5]. Den tynt skiver biopsi er farget med hematoksylin og eosin (H E) for å forbedre visuell kontrast for histopatologiske evalueringer. Haematoxylin flekker kjerner lilla mens eosin flekker den intracellulære og ekstracellulære protein rosa. Morfologiske funksjoner, for eksempel cellen form, kjernekraft størrelse og kjernefysisk til cytoplasma (N /C) Forholdet blir ofte brukt som diagnostiske kriterier ved histopatologer å identifisere unormale celler [6, 7].
Cervical forstadier til kreft er beskrevet av en veldefinert tre-lags graderingssystem som heter cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) [8, 9]. CINS er klassifisert i karakterer, nemlig CIN1 (mild dysplasi), CIN2 (moderat dysplasi) og CIN3 (alvorlig dysplasi) [10]. De tre grader av CIN refererer til tykkelsen av epitel påvirkes av unormale celler [11]. Når den basale tredjedel av epitel er erstattet av unormale celler, blir vevet histologisk definert som CIN1. CIN2 brukes når midten og basal tredje epitel er okkupert av neoplastiske celler mens komplett utskifting av unormale neoplastiske celler definerer CIN3. I de fleste sykehus, identifisere CIN grad av H E farget vevssnitt regnes som gullstandarden for livmorhalskreft diagnose [12, 13]. Imidlertid kan store variasjoner eksistere i diagnostiske resultater på grunn av den arbeidskrevende prosedyre og subjektiv tolkning involvert [14]. I tillegg gjennomføringen av denne tilnærmingen krever omfattende infrastruktur, personell og økonomiske ressurser. Kvinner, spesielt de fra regioner med lav ressursinnstillingene, kan ikke ha tilgang til disse screening-programmer [15]. Derfor er nye automatiserte bildediagnostikk som gir rom for ikke-invasiv og mer nøyaktig vurdering av livmorhalskreft ville overvinne disse begrensningene og betraktelig bedre forebygging av livmorhalskreft.
Flere optiske teknikker har blitt utviklet for å hjelpe in vivo og in vitro diagnostisering av livmorhals forstadier til kreft [5, 16-21]. Disse teknikkene avvike fra gullstandarden diagnose på hvordan vev behandles. Spesielt har refleksjonsspektroskopi, elastisk spredning spektroskopi og fluorescens-spektroskopi i stand til å karakterisere morfologiske og biokjemiske informasjonen er benyttet for diagnostiske formål. Bruken av H E farget cervical vev viste at fluorescens levetid imaging (FLIM) var spesielt nyttig for å oppdage unormale biokjemiske endringer knyttet til CIN. Den FLIM teknikken har den fordelen av å være følsomme for biokjemiske forandringer i vevet mikromiljø som korrelerer til vev patologi [26, 27]. Videre H E farget livmorhals vevssnitt ble undersøkt med FLIM. H E farget livmorhals vevssnitt klassifisert den i kategorier av normal og cervical intraepitelial neoplasi (CIN1, CIN2, CIN3) ble brukt for fluorescens levetid bildebehandling og analyse. Levetid verdier ble først analysert på en 3-lags modell etter standarden (CIN) diagnose. Deretter ble epitelceller regioner av disse cervikale vevssnitt delt opp i 10 like lag og analysert. Den 10-lags Modellen er basert på funnene at epitelet er vanligvis sammensatt av omtrent 10 sjikt [11]. Basallaget som fester seg til basalmembranen er en celle tykk. Over dette lag er de parabasal celler som er to til tre celler i tykkelse. Disse parabasal cellene modnes og danner den øvre mellom og overfladiske laget. Et slikt lag divisjon ble brukt for å vurdere de diagnostiske verdiene av fluorescens levetidsdata målt fra hvert cellelag. Funksjons vektorer som omfatter levetider fra forskjellige lag av epitelvev ble matet inn i et nevralt nettverk ekstrem læremaskin (ELM) sorter [30, 31] for diskriminering mellom normal og CIN. ELM klassifikator ble valgt på grunn av dens evne til å detektere komplekse trender med god generalisering ytelse ved ekstremt rask læring hastighet.
Dette arbeidet viser at det finnes et optimalt antall cervikale epitel-lag for å vurdere i analysen ved hvilken den diagnostiske nøyaktighet er maksimert. Nøyaktigheten her ble evaluert i form av sensitivitet og spesifisitet. Interessant, identifiserte vi den øverste halvdelen epitel som den effektive sone for FLIM diagnose med samtidig høy følsomhet (94,6%) og spesifisitet (84,3%). Den oppnådde gjennomsnitt av sensitivitet og spesifisitet er omtrent 1,5 ganger bedre enn de i hel-epitel og 3-lags epitel-modeller. Den foreslåtte lag analyse av FLIM diagnose kan ytterligere hjelp og utfylle tradisjonelle histopatologiske undersøkelser av livmorhalssykdommer med bedre diagnostisk nøyaktighet.
Materialer og metoder
Prøver
Det er totalt 32 H E farget livmorhals vevssnitt av 32 pasienter fra KK kvinne- og barnesykehus (KKH), Singapore ble brukt for analyse utført i denne studien. Hver valgt seksjon har klare stratifisert lag som letter lag analysen skal gjøres for denne pilotstudien. Disse vevssnitt ble patologisk undersøkt av en overlege fra KKH og de identifiserte områdene i epitelet ble klassifisert som normal, CIN1, CIN2 og CIN3. Prøvesettet inneholder 10 normal, 8 CIN1, 6 CIN2 og 8 CIN3 cervical vev seksjoner. Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av lokal etisk komité (KK kvinner og barnesykehus (KKH), Singapore) og Institutional Review Board (CIRB 2010/745 /C). Skriftlig samtykke ble innhentet fra deltakerne for bruk av informasjon i medisinske studier.
Imaging Protocol og Lifetime Beregning
Bilde protokollen var identisk med den som brukes i vårt tidligere arbeid [25]. Hvitt lys mikroskopi ble opprinnelig brukt til å lokalisere de identifiserte områdene-of-interesse og en tids løst fluorescens målesystem, som består av en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 510, Carl Zeiss, Tyskland) og en tids korrelert enkelt foton telling (TCSPC) systemet ble anvendt for fluorescens levetid avbildning. Belysningen Lyskilden er en femtosecond Ti: safir laser (Coherent Mira 900, 76 MHz, 200 fs) som opereres ved en bølgelengde på 760 nm. En 20 x objektiv (Fluar, Carl Zeiss, NA = 0,75) ble anvendt for å fokusere laserstrålen eksitasjon til vevsprøven, og å samle fluorescensemisjonen. Fluorescens levetid bildene ble tatt i en scanning tidsvindu på 10 ns med en tidsmessig oppløsning på ca 39 ps. Kjøpet tid for et bilde bestående av 256 × 256 piksler var 60 s. Bildet har en pikselstørrelse på ca 1,8 um.
fluorescens levetid
τ
er definert som den tid som utslipps fluorescensintensiteten reduseres til 1 /e av den opprinnelige verdi etter en fluorofor er eksitert av en lyspuls. Nedbrytningsmekanismen fluorescensemisjonen intensitet
I
(t) er beskrevet ved [32] 🙁 1) hvor τ = 1 /(Kr + Knr), Kr og Knr er at strålingen og ikke-strålingen overgang priser, henholdsvis, og
t
er tiden utløp siden lys eksitasjon. Fluorescens levetid ble beregnet med den kommersielle programvare SPCImage (Becker E farget vev avsnitt (b) False farge fluorescens levetid bilde med skala bar fra 0 til 2 ns. Basalmembran ble markert med hvite stiplede linjen
L Hotell og epitel overflaten ble avgrenset av hvit stiplet linje
M
. (C) piksler i hver delt lag ble oppnådd ved å flytte basalmembran piksler i retning vinkelrett på basalmembranen opp mot overflaten. Layers er nummerert trinnvis fra 1 til 10. piksler i hver delt lag utgjør ROI.
Extreme Learning Machine Klassifisering Algoritme
Diskriminering mellom normal og forstadier (CIN1, CIN2, CIN3) cervical vev ble utført ved å bruke et nevralt nettverk ELM klassifikator. I forhold til andre konvensjonelle neurale nettverk klassifiserere som for eksempel støttevektormaskin (sammendragsverdimetrikker) og tilbake-forplantning (BP) -metoden, har ELM en bedre generalisering ytelse med større læring hastighet fordi alle vekter i de skjulte noder blir tilfeldig generert uten å måtte bli iterativt innstilt [36]. ELM læring algoritmen er implementert som følger. Vurdere et treningssett Ψ = {(
x
i
t
i)
