Abstract
Bakgrunn
Nedbryting av replikering faktorer fører ofte celledød i kreftceller. Nedbryting av Cdc7, en kinase avgjørende for initiering av DNA replikasjon, induserer kreft celledød uavhengig av p53 status, men de nøyaktige veier av celledød induksjon er ikke karakterisert.
metodikk /hovedfunnene
Vi har brukt den nylig utviklet cellesyklus indikator, Fucci, til nettopp karakterisere celledødsprosess indusert av Cdc7 uttømming. Vi har også genereres og benyttes tilsvarende fluoriserende cellesyklus indikatorer ved hjelp av fusjon med andre cellesyklus regulatorer for å analysere måter celledød i levende celler i begge p53-positive og -negative bakgrunn. Vi viser at forskjellige celle-syklusresponser induseres i p53-positive og -negative cellene ved Cdc7 uttømming. p53-negative celler overveiende arrestere timelig i G2-fasen, samler CyclinB1 og andre mitotiske regulatorer. Langvarig arrest i G2-fasen og brå inntreden i avvikende M-fase, i nærvær av akkumulerte CyclinB1 blir fulgt av celledød ved post-mitotiske tilstand. Oppheving av cytoplasma CyclinB1 opphopning delvis reduserer celledød. ATR-MK2 veien er ansvarlig for lagring av CyclinB1 med 14-3-3σ protein. I kontrast, gjør p53-positive kreftceller ikke akkumuleres CyclinB1, men ser ut til å dø for det meste gjennom inntreden i avvikende S-fasen etter Cdc7 uttømming. Kombinasjonen av Cdc7 hemming med kjente kreftlegemidler stimulerer betydelig celledød virkninger i kreftceller i en genotype avhengig måte, noe som gir et strategisk grunnlag for fremtidige kombinasjonsbehandlinger.
Konklusjoner
Våre resultater viser at bruk av Fucci, og lignende fluorescerende cellesyklus indikatorer har en praktisk assay-system som brukes til å identifisere cellesyklus hendelser assosiert med cancer celledød. De indikerer også genotype-spesifikk celledødsmåter forårsaket av mangelfull initiering av DNA replikasjon i kreftceller og dets potensial utnyttelse for utvikling av effektive kreftbehandling
Citation. Ito S, Ishii A, Kakusho N, Taniyama C, Yamazaki S, Fukatsu R, et al. (2012) Mechanism of Cancer Cell Død indusert av Nedbryting av en viktig Replication Regulator. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10,1371 /journal.pone.0036372
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 19. januar 2012; Godkjent: 30 mars 2012; Publisert: 04.05.2012
Copyright: © 2012 Ito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-i-Aid for grunnforskning (A) og en Grant-in-Aid for Scientific Research på innsatsområdet «Kromosom Cycle» fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (HM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cdc7 er en konservert serin-treonin kinase som spiller en kritisk rolle i avfyring av replikering opprinnelse [1] – [3]. En viktig substrat er MCM, en komponent av prereplicative komplekset (pre-RC), og fosforylering av MCM2, 4 og 6 subenheter av MCM-komplekset ved Cdc7 utløser foreningen av Cdc45 med pre-RC, et avgjørende trinn for generering av en aktiv replikasjonsgaffelen [4] – [6]. Cdc7 danner et kompleks med Dbf4, en aktiverings subenhet, for å danne et aktivt kompleks kinase [2]. Hos mennesker, to aktiverings subenheter, ASK og Drf1 /ASKL1, er kjent for å eksistere [2], [7] -. [9]
Knockout av Cdc7 i mus forårsaker tidlig embryodødelighet. Inaktivering av Cdc7 gener i mus ES-celler er også dødelig [10]; Cellene opphøre DNA-syntese, akkumuleres DNA-skader, og til slutt gjennomgår celledød i et p53-avhengig måte. Knockdown eksperimenter i pattedyrceller tyder på at ASK er avgjørende mens Drf1 /ASKL1 kan være unnværlig for levedyktighet [9], [11]. Faktisk, inaktivering av de ASK gener i mus ES-celler fører også til dødelighet [12]. Disse resultatene indikerer at Cdc7-ASK er essensiell for proliferasjon av pattedyrceller. På den annen side kan Drf1 /ASKL1 spille en dominerende rolle som en aktivator av Cdc7 i den tidlige utviklingen av amfibier [13], [14]. En ortolog av Drf1 /ASKL1 er ikke blitt identifisert i mus.
På cellenivå, knockdown av Cdc7 ble vist å forårsake celledød i kreftcellene, men ikke i normale celler, hvori p53-avhengig trasé rest cellecyklusen antagelig i G1 fase [15], [16]. Det ble også rapportert at Cdc7 knockdown indusert p38-avhengig celledød i HeLa-celler [17]. Imidlertid fører Cdc7 uttømming celledød også i p53-positive celler, noe som antyder at p53 alene kan ikke forhindre celledød indusert ved Cdc7 uttømming i kreftceller. I dag er de nøyaktige mekanismer for p53-uavhengig celledød i Cdc7-utarmet kreftceller ikke kjent. I denne studien, analyserte vi effekten av Cdc7 uttømming i kreftceller ved hjelp av den nylig utviklede cellesyklusen indikator Fucci [18], så vel som tilsvarende fluorescerende cellesyklus indikatorer. Våre resultater peker på ulike effekter av p53 på modus for celledød i Cdc7-utarmet kreftceller.
Resultater
Nedbryting av Cdc7 kinase i humane kreftceller fører til celledød
Nedbryting av Cdc7 i HeLa, U2OS eller andre kreftceller med siRNA resulterte i inhibering av DNA-syntese, akkumulering av kromosom skader [representert ved γ-H2AX foci) og eventuelt tap av levedyktighet levedyktighet [15], [19], [20] . Celledød ble indusert i begge p53-positiv eller p53-negative kreftceller, i samsvar med tidligere rapporter [15], [19]. FACS-analyser av DNA-innhold indikerte at Cdc7 uttømming fører i første omgang til redusert G1 befolkning, etterfulgt av økning av sub-populasjonen G1, en indikasjon på celledød (fig. S1A og fig. S2B).
For å undersøke måte celledød indusert av Cdc7 utarming, anvendte vi HeLa-celler som uttrykker cellesyklusen indikatoren, Fucci (Fluorescent ubiquitin-baserte cellesyklus indikator; [18]), som tillater visualisering av cellesyklusen tilstand (rød for G1 og grønt for S /G2 /M). HeLa-Fucci ble transfektert med Cdc7 siRNA og cellene ble overvåket for å bestemme den cellesyklus stadiet hvor de gjennomgår celledød. Celledød oppstår både post-mitotisk G1 og i løpet av S /G2 /M fase i HeLa-Fucci (Fig. 1A og C, filmer S1 og S2). Vi har også generert U2OS-Fucci og undersøkt celledød modus i U2OS etter Cdc7 uttømming. I U2OS, mer enn 70% av cellene døde i løpet av S /G2 /M fase (grønn, Fig. 1B og C). I kontrast, gjorde Cdc7 uttømming ikke indusere celledød i NHDF (normal menneskelig dermal fibroblast) celler og ledet det meste til G1 arrest som beskrevet tidligere (Fig. S1 og data ikke vist [15]).
(A og B) HeLa (A) eller U2OS (B) celler uttrykker Fucci ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA og time lapse bildet ble tatt opp med Olympus LCV100 (filmer S1 og S2). Bilder tatt fra tid forfalle data ved tidspunktene angitt presenteres. De øverste panelene (kontroll siRNA) viser celler som gjennomgår normal celledeling. Tall i hvert panel viser tid (timer) etter siRNA transfeksjon. Lavere to paneler (A og B) viser Cdc7 siRNA behandlede celler. Noen celler døde i rød farge (G1 fase, a), og andre celler døde i grønn (S /G2 /M fase, b). Lengder av cellesyklus stadier er angitt i panelene (G1, arrowed brutte linjer, S /G2 /M, arrowed heltrukne linjer). Bar, 20 mikrometer. (C) Døde celler i Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-Fucci (venstre, 324 celler) eller U2OS-Fucci (høyre, 180 celler) ble regnet fra tid lapse data for å bestemme fraksjoner av de døde cellene i rødt og grønt. Celledød skjer på både G1 og S /G2 /M faser i Cdc7 siRNA behandlet kreftceller. (D, E og F), HeLa-celler ble transfektert med kontroll eller Cdc7-D siRNA og ble høstet ved 48 timer (D) eller ved tidspunktene angitt (E og F). Hele celleekstrakter (D) eller CSK-oppløselige ekstrakter (E) ble analysert ved western blotting ved anvendelse av antistoffene som er angitt. (F) Cdc2-CyclinB1 kinase-aktivitet ble målt ved hjelp av CSK-oppløselige ekstrakter. Immunopresipitatene (IP) som benyttes for analyser og inngangs ekstrakter ble analysert ved western blotting. Omfanget av Cdc7 uttømming var lik mellom HeLa og U2OS. Cdc7 var ikke oppdages av western etter siRNA behandling i begge celler. (G) HeLa-celler ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA for angitte tidspunkter oppsamlet, vasket med PBS, svellet i 75 mM KCl i 20 minutter ved 37 ° C, og fiksert med iseddik /metanol (01:03) oppløsning tre ganger. Faste kromosomer ble droppet på et lysbilde glass, lufttørket og farget med 5% Giemsa løsning i 1/15 M PBS. Spre kromosomer ble observert etter All-in-One-mikroskopi (Keyence). Mitotiske celler med abnormt kondensert kromosomer ble talt og fraksjonene blir presentert. De innfellinger viser representative bilder av abnormt kondensert kromosomer observert i en Cdc7 siRNA behandlet HeLa celle (til venstre) og riktig kondensert kromosomer observert i en kontroll celle (høyre). Bar, 50 mikrometer. (H) HeLa-celler ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA i 48 timer, vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og deretter farget med Hoechst 33342. Cellene ble undersøkt under konfokal mikroskopi LSM510 (1427 celler [Cdc7] og 1023 celler [kontroll]), og cellene i M fase faser ble scoret. Fraksjonene av celler i hvert mitotisk trinn blir presentert. (I) Spread og faste kromosomer utarbeidet i U2OS som beskrevet ovenfor ble observert av FSX100 Olympus mikroskopi. Ingen signifikant forskjell ble observert i mitotiske celler etter Cdc7 uttømming. Imidlertid er tallene av apoptotiske celler økt i Cdc7-utarmet U2OS celler. Bar, 32 mikrometer. I C, G og H, «n» representerer antallet uavhengige eksperimenter utført.
Cytoplasmatiske opphopning av CyclinB1 protein i Cdc7-utarmet HeLa-celler
FACS analyse av Cdc7- utarmet HeLa-celler viste ikke akkumulering av G2 /M befolkningen (fig. S1 A og S2B fig.). Imidlertid, Western analyser av forskjellige proteiner etter Cdc7 uttømming i HeLa-celler tydet på at nivåene av CyclinB1, AuroraA og Plk1 proteiner økes (fig. 1D, E og F). Nivåene av både Cdc25C, Cdc25CS216 (Fig. 1E) og tyrosin 15 fosforylering av Cdc2 også økt (Fig. 1 F), noe som tyder på at G2 /M sjekkpunkt kan induseres i Cdc7-utarmet HeLa-celler. Selv om nivået av CyclinB1 protein økes, den CyclinB1-avhengig kinaseaktivitet Cdc2 var nesten det samme som for kontrollen (fig. 1F). Dette kan være på grunn av assosiasjon med 14-3-3 proteiner, som kan inhibere kinase aktivitet (se nedenfor), så vel som til sjekkpunktet induserte hemmende tyrosin 15 fosforylering. På den annen side, i p53-positiv U2OS, uttømming av Cdc7 ikke forårsake CyclinB1 akkumulering, og påvirket ikke CyclinB1-avhengig kinase Cdc2-aktivitet eller tyrosin 15 fosforylering av Cdc2 (fig. 1F).
Fargingen og observasjon av M fase kromosomer indikerte en økning av abnorme kondensert kromosomer i Cdc7 siRNA-behandlede celler (fig. 1G). Om lag 50% av mitotiske celler utstilt abnormt kondensert kromosomer i Cdc7-utarmet HeLa-celler. Også meta å telophase celle populasjoner redusert i Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-celler (fig. 1 H). Disse resultatene indikerer at en stor populasjon av celler arrestere eller redusere hastigheten på G2 etter uttømming av Cdc7 kinase i HeLa-celler med abnormt kondensert kromosomer, og en porsjon av cellene dør i løpet av G2 /M fase, eventuelt ved metafase. Imidlertid har presis timing av celledød i M fase ikke fastslått. I U2OS, er det ingen vesentlig forskjell for M-fasekromosomer mellom Cdc7-utarmet og kontrollcellene. Imidlertid er tallene av apoptotiske kjerner økt etter uttømming av Cdc7 i U2OS (fig. 1I). Således viser disse resultater også at tidspunktet for celledød indusert av Cdc7 uttømming kan variere i HeLa-celler og U2OS.
Vi analyserte deretter den cellulære lokalisering av CyclinB1 protein ved immunfarging. Vi bemerket økningen av CyclinB1-positive celler i Cdc7 siRNA-behandlede celler, som forventet fra en økning av det samlede CyclinB1 proteinnivå. Vi har også bemerkes at en betydelig populasjon av Cdc7-utarmet HeLa-celler som inneholder CyclinB1 proteinet i cytoplasma (fig. 2A og B). For å bekrefte dette resultatet, undersøkte vi effekten av Cdc7 uttømming bruker HeLa-celler som stabilt uttrykker mKO2-smeltet CyclinB1 protein. I denne cellelinje, de røde fluorescerende signalene først dukket opp i cytoplasma på ca 10-14 timer etter celledeling. Signalene var detekterbare i ca 5-6 timer. Siden synkroniserings eksperimenter tyder på at G2 /M faser i HeLa-celler som varer i ca 3-5 timer, vil trolig bli uttrykt fra slutten av S-fasen gjennom meta CyclinB1. Disse signalene translocate inn i kjerner og forsvinne etter metafase (figur 2C, øvre panel; film S3.), I overensstemmelse med den forventede adferden til det endogene CyclinB1 protein, som vist tidligere [21] – [23]. Når cellene ble behandlet med Cdc7 siRNA, populasjonen av cellene med sterke cytoplasmatiske røde signaler økes, og disse signalene oppholdt seg i cytoplasmaet for en lengre periode (fig. 2C, nedre panel og film S4). Den nødvendige tid for translokasjon av de røde signaler til kjerner etter sin opptreden i cytoplasma ble noen få timer i kontrollcellene, mens den økte i Cdc7-utarmet celler (Fig. 2C og D, filmer S3 og S4). Dette ble også observert med forskjellige Cdc7 sirnas (fig. S2 og data ikke vist). Disse resultatene er i overensstemmelse med ideen om at CyclinB1 akkumuleres i cytoplasma i HeLa-celler behandlet med Cdc7 siRNA. Vi har også generert HeLa-celler som uttrykker mKO2-AuroraA. Ekspresjon og aktivitet av AuroraA, en av de mitotiske kinaser, er kjent til topp på G2 /M fase [24]. Gjennomgående, de AuroraA signalene ut på G2 fase, og forsvant ved slutten av M fasen i kontrollceller, mens varigheten av AuroraA signalene ble mye lenger etter Cdc7 tømming (fig. S3, filmer S5 og S6). Denne effekten ble igjen observert med andre Cdc7 sirnas (fig. S3C og data ikke vist). Disse resultatene indikerer at Cdc7 uttømming forårsaker G2 cellesyklus-forsinkelses i HeLa-celler samtidig behandling med øket CyclinB1 og AuroraA proteinnivåer.
(A) HeLa-celler ble dyrket på dekkglass, transfektert med kontroll eller Cdc7-D siRNA for 48 timer, fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med anti-CyclinB1-antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert anti-mus-IgG og Hoechst33342. Venstre, Cdc7 siRNA; høyre, kontroll siRNA. Green, CyclinB1; blå, DNA. Bilder ble tatt av FSX100 Olympus mikroskopi. Bar, 16 mikrometer. (B) Mer enn 3000 celler ble undersøkt og celler med atom CyclinB1 signaler ble bedømt og fraksjonene blir presentert. «N» representerer antallet av uavhengige eksperimenter utført. (C) HeLa-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 ble behandlet med Cdc7-D siRNA eller kontrollere siRNA. Tid lapse bilder ble registrert av Olympus LCV100 (filmer S3 og S4). Bilder tatt fra tid forfalle data ved tidspunktene angitt presenteres. Øvre, kontroll siRNA; lavere, Cdc7 siRNA. Røde signaler viser mKO2-CyclinB1. Kontroll siRNA-behandlede celler indikerer de som gjennomgår periodisk cytoplasma utseende, kjernekraft overføring, og nedbrytning (øvre panel), mens Cdc7 siRNA-behandlede cellene vise vedvarende sterke cytoplamic signaler for en lang periode (nedre panel). Tall i hvert panel viser tid (timer) etter siRNA behandling. Bar: 20 mikrometer. (D) Den tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signal og dens translokasjon inn i kjernen ble målt i tid lapse bilder av kontroll eller Cdc7-D siRNA behandlet HeLa-celler. P-verdien av den tosidige uparet t-test ble beregnet ved Prism programvare.
Mange Cdc7-utarmet celler med høy cytoplasma CyclinB1 brått kommer inn mitose etter lang G2 arrest, og svært ofte gjennomgå tydelig celledød i følgende timer. Dette er i likhet med den mitotiske katastrofen tidligere rapportert [25], men cellene blir hindret i å fortsette til M fase ved inhibering av nukleær translokasjon av CyclinB1, ikke på det stadium av spindelen sjekkpunkt, som tidligere er rapportert i et annet system [26]. Faktisk, opphør av spindel sjekkpunkt ved siRNA rettet mot Mad2 påvirket ikke CyclinB1 oppbevaring i cytoplasma som oppstår i respons til Cdc7 uttømming i HeLa-celler (data ikke vist).
14-3-3σ sequesters CyclinB1 i cytoplasma etter Cdc7 uttømming
det neste spørsmålet er hvordan CyclinB1 akkumuleres i cytoplasma. 14-3-3σ er konservert, godt karakteriserte faktorer, som er kjent for å bindes til forskjellige cellesyklus regulatorer og holde dem i cytoplasma i noen tilfeller [25]. Hver av de syv 14-3-3 isoformene ble uttrykt, og dens interaksjon med Cdc2-CyclinB1 ble undersøkt. 14-3-3σ var blant de sterkeste bindemidler (data ikke vist). Vi undersøkte om den akkumulerte CyclinB1 er bundet til 14-3-3σ i Cdc7-utarmet HeLa-celler, og fant at CyclinB1 bundet 14-3-3σ betydelig økt i Cdc7-utarmet celler (fig. 3A, kjørefelt 2). Også immunoutfelling av transient uttrykte 14-3-3σ etter Cdc7 uttømming viste at CyclinB1 og Cdc2 er forbundet med 14-3-3σ (Fig. 3B). Men vi klarte ikke å registrere foreningen av 14-3-3σ og Cdc25C, som tidligere beskrevet [25], [27]. Disse resultatene tyder på at 14-3-3σ sequesters den Cdc2-CyclinB1 kompleks i cytoplasma etter Cdc7 uttømming i HeLa celler.
(A) HeLa-celler ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA i 24 timer. Ekstrakter ble fremstilt og immunopresipitatene med anti-CyclinB1 antistoff (kolonnene 1 og 2) og inngangs ekstrakter (banene 3 og 4, 20% av den ekstrakt som brukes for immunopresipitasjon) ble analysert ved western blotting. (B) HeLa-celler ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA, etterfulgt av transfeksjon av et flagg-merket 14-3-3σ-uttrykke plasmid. Ekstrakter ble fremstilt ved 48 timer etter siRNA transfeksjon og immunopresipitatene med anti-Flag-antistoff (kolonnene 1 og 2) eller normal (kontroll) IgG (banene 3 og 4) og inngangs ekstrakter (banene 5 og 6; 17% av den ekstrakt som brukes for immunoutfelling) ble analysert ved western blotting. Bindingen av Cdc2 /CyclinB1 med 14-3-3σ øker etter Cdc7 siRNA behandling, noe som tyder på at 14-3-3σ beholder CyclinB1 i cytoplasma etter Cdc7 uttømming i HeLa celler. (C og D) HeLa-celler ble behandlet med Cdc7-D siRNA, 14-3-3σ og Cdc7-D sirnas, 14-3-3σ siRNA og tak siRNA i 48 timer. (C) Western blot-analyse av hele celle-ekstrakter. (d) DNA-innholdet i cellene i C ble analysert ved hjelp av FACS (10.000 celler for hver), og den fraksjon av cellene i hver cellesyklustrinn er presentert. (E) HeLa-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 ble behandlet med Cdc7-D og /eller 14-3-3σ siRNA som angitt. Tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signaler og dens translokasjon inn i kjernen ble målt ved hjelp av Time lapse bilder, som startet ved 24 timer etter siRNA transfeksjon. P-verdien av den tosidige uparet t-test ble beregnet ved Prism programvare. Co-uttømming av 14-3-3σ førte til en reduksjon i det totale CyclinB1 protein-nivå (C), redusert celledød (D), og reduserte varigheten av dets cytoplasmiske retensjon (E).
reduksjon av cytoplasma opphopning av CyclinB1 delvis reduserer celledød
Siden cellene samler CyclinB1 i cytoplasma er utsatt for celledød, undersøkte vi om reduksjon av cytoplasma CyclinB1 motvirker celledød effekten av Cdc7 uttømming. Co-uttømming av både Cdc7 og 14-3-3σ i HeLa celler redusert CyclinB1, AuroraA, Plk1 og Cdc25C proteinnivåer (Fig. 3C). Den tid som er nødvendig for kjernefysisk translokasjon av CyclinB1 forkortet og sub-G1 celle befolkningen redusert (Fig. 3D og E). Disse resultatene antydet at fravær av 14-3-3σ letter G2-M overgang og progresjon inn i den neste cellesyklustrinn, delvis redde cellene fra celledød.
neste uttrykt mKO2-NLS-CyclinB1, som konstitutivt lokaliserer i kjerner i HeLa-celler ved sen S gjennom metafase. I disse cellene, kreves det tid for overgangen fra slutten av S til G2 /M ble forkortet sammenlignet med mKO2-CyclinB1 uttrykkende celler og celledød ble delvis omgått ved 48 timer etter Cdc7 tømming (fig. 4A og B). Dette stemmer overens med en tidligere rapport som ektopisk ekspresjon av NLS-CyclinB1 i HeLa-celler reduserte G2-forsinkelsen som forekommer som respons på røntgenbestråling [28]. Men celler som uttrykker mKO2-NLS-CyclinB1 fortsatt gikk apoptose på senere tidspunkter etter Cdc7 uttømming. Dette kan forventes fordi ekspresjon av kjerne CyclinB1 er kjent for å indusere apoptose i kreftceller [29]. Co-uttømming av CyclinB1 redusert G2-forlengelse og delvis reddet celledød indusert av Cdc7 uttømming (Fig. 4C, D). Disse resultatene støtter tanken om at cytoplasmisk akkumulering av CyclinB1 og dens brå translokasjon inn i kjernen i det minste delvis er ansvarlig for den observerte celledød i HeLa-celler indusert ved Cdc7 uttømming, og at celledød kan i det minste delvis hindres ved å tilrettelegge mitose.
(A) HeLa-celler som uttrykker mKO2-NLS-CyclinB1 (venstre) eller mKO2-CyclinB1 (til høyre) ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA og ble overvåket av Olympus LCV100. Døde celler ble talt i tiden lapse bilder ved tidspunktene angitt. Celledød ble undertrykt i mKO2-NLS-CyclinB1 uttrykker HeLa celler opp til 72 timer (der halvparten av de Cdc7-utarmet HeLa-celler er vanligvis død). mKO2-NLS-CyclinB1 plasmid ble konstruert ved innsetting av NLS-sekvensen (PPKKKRKVEDP) fra SV40 stort T-antigen i den mKO2-CyclinB1 plasmid mellom mKO2 og CyclinB1. Rundt 200 eller 60 celler som uttrykker mKO2-NLS-CyclinB1 eller mKO2-CyclinB1 henholdsvis ble talt. «N» representerer antallet av uavhengige eksperimenter utført. (B) HeLa-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 (WT) eller mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA og varigheten av CyclinB1 uttrykk før inntreden i M fase ble målt i tids lapse bilder. Ved Cdc7 utarming, gjorde NLS cellene ikke akkumulere merket CyclinB1 i cytoplasma, og fortsatte gjennom cellesyklusen mer eller mindre normalt. (C) HeLa-celler ble behandlet med angitte sirnas i 48 timer. DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av FACS (10.000 celler for hver), og de fraksjoner av sub-populasjonen G1 ble beregnet og presentert. Co-uttømming av CyclinB1 reduserte celledød indusert av Cdc7-D siRNA i HeLa-celler. (D) HeLa-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 (WT) ble behandlet med Cdc7-D eller Cdc7-D + CyclinB1 siRNA og tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signal og dens translokasjon inn i kjernen ble målt i de tid lapse bilder av hver celle befolkningen. Nedregulering av CyclinB1 uttrykk forkortet G2 arrest indusert av Cdc7 uttømming. I (B) og (D), ble P-verdier for de to-tailed uparet t-test beregnet av Prism software.
G2 forlengelse er forårsaket av utarming av Cdc7 i p53-negative celler gjennom MK2 aktivering
det ble tidligere rapportert at p38-MK2 pathway er aktivert i HeLa celler ved nedbryting av Cdc7 [17]. Derfor undersøkte vi om denne veien er involvert i cytoplasma opphopning av CyclinB1 i Cdc7-utarmet HeLa-celler. Først bekreftet vi at MK2 er hyperfosforylert ved Cdc7 uttømming i HeLa-celler, men ikke i U2OS eller NHDF celler (Fig. 5A). Denne aktivering av MK2 i Cdc7-utarmet HeLa-celler kan skyldes direkte aktivering av MK2 ved Cdc7-indusert replikering stress. Alternativt kan økningen av G2-faseceller ved Cdc7 uttømming bidra til aktivering av MK2, ettersom MK2 er kjent for å være mer aktiv i G2 og M fasene. Co-uttømming av Cdc7 og MK2 redusert cyclin B1 og AuroraA proteinnivåer og Cdc25C Ser216 fosforylering, som tyder på at mitose er delvis restaurert (Fig. 5B). Det er også redusert binding av 14-3-3σ og CyclinB1 /Cdc2 (Fig. 5C). Men hadde samtidig uttømming av Cdc7 og MK2 ikke hindre HeLa celledød, antagelig fordi MK2 uttømming alene indusert betydelig celledød (data ikke vist).
(A) HeLa (sporene 1, 2, 7 og 8 ), ble U2OS (banene 3 og 4) og NHDF (banene 5 og 6) celler ble behandlet med kontroll eller Cdc7 siRNA og hele celleekstrakter kjøres på en phosgel og analysert ved western blotting. Baner 7 og 8, ekstrakter fra Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-celler ble ikke-behandlede (-) eller behandlet med λ-fosfatase (+). Pilspisser indikerer fosforylert MK2 band. (B) HeLa-celler ble behandlet med kontroll siRNA (baner 1 og 5), Cdc7 siRNA (baner 2 og 6), Cdc7 og MK2 sirnas (banene 3 og 7) og MK2 siRNA (baner 4 og 8) i 48 timer, og CSK-løselige (spor 1-4, Sup) og -insoluble (spor 5-8, PPT) proteiner ble analysert ved western blotting. Tubulin og LaminB er vist som lasting kontroller. (C) glutation Sepharose 4B kuler som bærer GST-14-3-3σ protein ble inkubert i 1 time ved 4 ° C med CSK-løselige ekstrakter av HeLa-celler behandlet med siRNA, som vist. Bundede proteiner ble undersøkt ved Western blotting. «Input» tilsvarer bare ekstrakter uten tilsatt GST-14-3-3σ protein. Cdc7 og MK2 co-uttømming redusert bindingen mellom 14-3-3σ og Cdc2 /CyclinB1. (D) HeLa-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 ble behandlet med angitte sirnas. Tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signal og dens translokasjon inn i kjernen ble målt i tids lapse bilder. Co-uttømming av MK2, p38 (oppstrøms kinase av MK2) eller ATR redusert cytoplasma oppbevaring av CyclinB1 (G2 forlengelse) ble observert i Cdc7-utarmet HeLa-celler. P-verdier for den tosidige uparet t-test ble beregnet av Prism software. Cdc7-D siRNA ble brukt i alle forsøkene.
Den tid som er nødvendig for kjernefysisk trans etter samtidig uttømming av Cdc7 og MK2 ble forkortet nær kontrollnivået. Videre G2 forlengelse observert etter Cdc7 uttømming ble også avbrutt av co-uttømming av ATR eller p38 med Cdc7 (Fig. 5D). Disse resultatene indikerer at dette G2 sjekkpunkt avhenger av ATR-regulert MK2 aktivering.
Cytoplasmatiske opphopning av CyclinB1 ikke forekommer i p53-positive U2OS eller HCT116 etter Cdc7 uttømming
Selv om Cdc7 uttømming i U2OS celler (humant osteosarkom), induserte sterk celledød, nivåene av de mitotiske kinaser økte ikke (fig. 1). Vi etablerte derfor U2OS stabilt uttrykker mKO2-CyclinB1, og undersøkte effekten av Cdc7 siRNA på CyclinB1 dynamikk. I denne cellelinjen, gjorde vi ikke observere noen opphopning av CyclinB1 i cytoplasma etter Cdc7 uttømming. Den nødvendige tid for nukleær translokasjon i Cdc7-utarmet U2OS celler var lik den for kontrollceller (Fig. 6A). Imidlertid ble det lenger når p53 ble co-utarmet (Fig. 6A). Den CyclinB1 proteinnivået økte etter co-uttømming av Cdc7 og p53 i U2OS (Fig. 6B). Vi neste undersøkt en tykktarmskreft cellelinje, HCT116. I p53-positiv HCT116 kreftceller, er nivået av mitotiske proteiner som CyclinB1 og Plk1 sank etter Cdc7 uttømming antagelig på grunn av G1 arrest (Fig. 7A). Samtidig, Cdc2 /CyclinB1 aktivitet ble også redusert i Cdc7-utarmet p53-positive HCT116-celler (Fig. 7B). Den tid som er nødvendig for kjernefysisk translokasjon i Cdc7-utarmet p53-positive HCT116 cellene var lik som (Fig. 7C, venstre panel) kontrollceller. I motsetning til dette, Cdc2 /CyclinB1 aktivitet i p53-negative HCT116 etter Cdc7 uttømming var nesten det samme som for kontrollen (fig. 7B). Videre, som vist i HeLa-celler, kreves det tid for nukleær translokasjon i Cdc7-utarmet p53-negative HCT116-celler var lengre enn den i kontrollgruppen (fig. 7C, høyre panel). Dette G2 forlengelse ble avbrutt av co-uttømming av Cdc7 og MK2 i p53-negative HCT116-celler (Fig. 7C, panel til høyre). Disse resultatene indikerer at G2-fasen forlengelse etter Cdc7 uttømming avhenger av fraværet av p53-protein [15], [30] – [32]
(A) U2OS celler som uttrykker mKO2-CycinB1 ble behandlet med sirnas og tid. lapse bilder ble registrert av LCV100. Tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signal og dens translokasjon inn i kjernen ble målt i tid lapse bilder av hver celle befolkningen. I Cdc7-utarmet U2OS, betyr CyclinB1 ikke akkumuleres i cytoplasma. Men co-uttømming av Cdc7 og p53 forårsaket CyclinB1 opphopning i cytoplasma i en lengre periode. P-verdier for den tosidige uparet t-test ble beregnet av Prism software. (B) Western-analyse av fullcelle-ekstrakter av U2OS celler behandlet med den angitte sirnas i 48 timer. En phosgel ble brukt for påvisning av MK2. Andre proteiner ble oppdaget på en 4-12% gradient gel.
(A) p53-positive eller -negativ HCT116 cellene ble behandlet med kontroll eller Cdc7-D siRNA i 48 timer, og hele celleekstrakter ble analysert ved western blotting. (B) CSK-løselige ekstrakter ble fremstilt fra de samme celler som i (A) og immunoutfelling ble utført med anti-CylinB1 antistoff. Cdc2-CyclinB1 kinase-aktivitet ble målt med Histone H1 som et substrat (øvre panel), som beskrevet i «Materialer og metoder». Diagrammet nedenfor viser kvantifiseringen av graden av fosforylering. Nedre panel, western blotting analyser av CyclinB1 proteiner i immunopresipitatene som brukes for kinasebestemmelser. (C) p53-positive (venstre) eller -negative (høyre) HCT116-celler som uttrykker mKO2-CyclinB1 ble behandlet med angitt siRNA og tid lapse bilder ble registrert. Tiden (t) mellom den første opptreden av cytosoliske mKO2-CyclinB1 signal og dens translokasjon inn i kjernen ble målt i tids lapse bilder. P-verdiene av den tosidige uparet t-test ble beregnet ved Prism programvare.
Nylig ble det rapportert at FoxO3 transkripsjonsfaktor er involvert i G1 arrest, forårsaket av uttømming av Cdc7 i normale celler [16]. FoxM1, en annen Fox familiemedlem, er kjent for å regulere ekspresjon av mitotiske regulatorer som Plk, CyclinB1 og CyclinA etter DNA-skade [33] – [36]. Uttrykk for FoxM1 er negativt regulert av p53 [37], [38]. I HeLa, viser vi at mRNA-nivåene av FoxM1 øket etter Cdc7 tømming (fig. 8A), som også kan være delvis ansvarlig for en økning av FoxM1 proteinnivåer under de samme betingelser. Disse funnene tyder på at disse Fox familie transkripsjonsfaktorer kan være involvert i cellesyklus arrest og induksjon av celledød ved Cdc7 uttømming i p53-negative celler. Dobbel knockdown av Cdc7 og FoxM1 i HeLa celler dramatisk redusert CyclinB1 mRNA nivå i forhold til Cdc7 uttømming alene. Den CyclinB1 proteinnivå også redusert ved samtidig uttømming av Cdc7 og FoxM1, men ikke til den utstrekning av mRNA nivå (Fig. 8B). FoxM1 uttømming, imidlertid ikke oppheve G2 rest eller redusere celledød (fig. 8D, data ikke vist).
