Abstract
Ammonium er et metabolsk avfall produkt hovedsakelig detoxified av leveren. Hepatisk dysfunksjon kan føre til akkumulering av cytotoksiske sirkulerende ammonium og etterfølgende encefalopati. Transmembran ammonium transport er en utbredt prosess sikret av den svært konserverte proteiner av Mep-Amt-RH-superfamilien, inkludert pattedyr Rhesus (Rh) faktorer. De regulatoriske mekanismer som er involvert i kontrollen av
RH
gener uttrykk forbli dårlig undersøkt. Her adressert vi uttrykket regulering av en av disse faktorene,
RHBG
. Vi identifiserer HepG2 leverkreft celler og SW480 kolon adenokarcinomceller som uttrykker
RHBG Hotell og vise at dens uttrykk er avhengig av β-catenin signalering. siRNA-mediert β-catenin knockdown resultert i betydelig reduksjon av
RHBG
mRNA i begge cellelinjer. Pharmaceutical hemming av TCF4 /β-catenin interaksjon eller knockdown av transkripsjonsfaktoren TCF4 også downregulated
RHBG
uttrykk. Vi identifiserer en minimal
RHBG
regulatorisk sekvens viser en promoter aktivitet og vise at β-catenin og TCF4 binder seg til dette fragmentet
in vivo
. Vi endelig karakter rollen som potensiell TCF4 bindingssteder i
RHBG
regulering. Til sammen tyder våre resultater
RHBG
uttrykk som en direkte mål for β-catenin regulering, en sti ofte deregulert i mange kreftformer og tilknyttet tumorigenesis
Citation. Merhi A, De Mees C , Abdo R, Victoria Alberola J, Marini AM (2015) Wnt /β-catenin Signa Regulerer Expression av Ammonium permease Gene
RHBG
i humane kreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0128683. doi: 10,1371 /journal.pone.0128683
Academic Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 19 januar 2015; Godkjent: 29 april 2015; Publisert: 01.06.2015
Copyright: © 2015 Merhi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den belgiske Fonds de la Recherche Scientifique FRS-FNRS (FRSM 3.4633.09, MISF4.521.10.F), Føderasjonen Wallonie-Bruxelles ( handling de Recherche Concertée), International Brachet Stiftung, Jean Brachet og Alice et David Van Buuren stiftelser. ER. er et vitenskapelig forskning arbeidstaker støttet av en Télévie stipend, C.D. ble en vitenskapelig forskning arbeidstaker av F.R.S.-FNRS, JVA ble støttet av en da Vinci-programmet, og A.M.M. er en senior forskning medarbeider av F.R.S.-FNRS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ammonium, heretter refererer til summen av NH
3 og NH
4
+ molekylarter, tjener som hovednitrogenkilde for mikroorganismer og planter [1]. Det er imidlertid for det meste beskrevet for de cytotoksiske konsekvensene av en oppkonsentrering i dyr [2]. Hepatisk metabolisme av ammonium overfor urea og glutamin syntese er kritisk for å opprettholde en lav plasmanivå av ammonium som kommer fra nedbrytningen av proteiner og aktiviteten av tarmfloraen. Nedskrivningen av ammonium avgiftning skjer i tilfelle av leverfunksjon kan føre til utvikling av hepatisk encefalopati, og i akutte tilfeller, til dødelig cerebral lammelse. Parallelt med disse toksiske effekter, renal ammonium produksjon fra glutaminolysis og utskillelsen påfølgende urin er en avgjørende prosess for å sikre at pH i blodet homeostase [3]. Utsikten at trans fluks av ammonium er den eneste konsekvensen av NH
3 gratis diffusjon ble holdt i flere tiår, inntil de første gener som koder for spesifikke ammonium permeases ble identifisert [4-6]. Sekvensanalyse aktivert for å definere en ny og vidt konservert familie av proteiner betegnet Mep-Amt-Rh, representert i virveldyr ved de kjente humane Rhesus blodgruppefaktorer [7]. Ikke-erytroide Rh faktorer, RhBG og RhCG, ble senere oppdaget og særlig funnet å bli uttrykt i spesifikke epitelceller hos flere organer, inkludert mus og human lever og nyre [8-14]. Mus knockout studier viste rollen Rhbg og Rhcg ved nedsatt urin ammonium utskillelse mens potensial engasjement i leveren fysiologi forblir uløst [15-17]. Av notatet,
RHBG
vises overexpressed i menneskelig leverkreft bærende aktiverende mutasjoner i β-catenin [18], noe som tyder på en sammenheng mellom Wnt /β-catenin signalering og menneskelig
RHBG
regulering. Denne sammenhengen ser ut til å holde til stede i en normal mus lever sammenheng som transgene modeller muliggjør målrettet inaktivering eller aktivering av β-catenin signal showet downregulation eller oppregulering av
RHbg
uttrykk, henholdsvis [19,20]. Wnt /β-catenin veien er svært konservert over metazoans og regulerer celledeling, differensiering og overlevelse [21-23]. De utskilte proteiner av WNT familien er i stand til å binde spesifikke Frizzeld /LRP-reseptorer og aktivere signaloverføringen via forskjellige mekanismer. I den kanoniske Wnt /β-catenin mekanisme, er fravær av Wnt signalering fulgt av en lav cytosoliske β-catenin nivå. Den β-catenin stabilitet reguleres ved en ødeleggelse kompleks, dannet ved Axin, adenomatøs polypose kompleks (APC), kasein kinase 1 og glykogensyntasekinase-3β (GSK-3 β) som fosforylerer β-catenin ved dets N-terminale ende og fører til sin ubiquitylation og påfølgende proteasomal degradering [21,22]. Wnt signal utløser dissosiasjon av β-catenin /ødeleggelse kompleks [23-25]. Den resulterende inhibering av fosforylering fører til cytosoliske β-catenin akkumulering og translokasjon inn i kjernen. Beta-catenin kan deretter aktivere transkripsjon av ulike målgener som en kofaktor bundet til medlemmer av T-celle faktor (TCF) /lymfoid enhancer faktor (LSF) transkripsjonsfaktor familie og drive Wnt-spesifikke transkripsjons programmer [23]. Unormal aktivering av Wnt /β-catenin signalering, på grunn av tap-av-funksjon mutasjoner i APC eller aktiverende mutasjoner i β-catenin har blitt knyttet til tumorgenese i mange innstillinger, inkludert melanom, bryst, tykktarm og hepatocellulært karsinom [21,23].
de regulatoriske mekanismer som er involvert i kontrollen av menneskelige
RH
gener uttrykk og signalveier potensielt impliserte er så langt dårlig dokumentert. Her søkte vi å identifisere menneskelige kreftcellelinjer som uttrykker
RHBG
genet for å studere dens uttrykk regulering og løse potensielle direkte påvirkning av Wnt /β-catenin signalering. Vi viser at
RHBG
er sterkt uttrykt i HepG2 hepatomceller og er avhengig av β-catenin signalering. Tilsvarende er
RHBG
uttrykk avslørt i SW480 tykktarmskreftceller avhengig av β-catenin, ytterligere støtte rollen som β-catenin signalisering i
RHBG
regulering. Arrangøren analyse og kromatin immunoutfellingsstudier analysene er konsistent med en direkte involvering av TCF4 /β-catenin i
RHBG
oppregulering i HepG2 celler.
Materialer og metoder
Cellekultur og reagenser
Den menneskelige leverkreft (HepG2 og Hep3B) og humane embryonale nyre (HEK293T) cellelinjer ble vennlig levert av professor Claude Szpirer, Université Libre de Bruxelles, Belgia. Den menneskelige kolon adenokarsinom (SW480) cellelinje ble kjøpt fra CLS (Tyskland). HepG2, Hep3B, SW480 og HEK293T celler ble dyrket i DMEM avansert medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (BioWest), 2 mM L-glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt i en inkubator med fuktig luft (5% CO2) ved 37 ° C. PFK118-310 (# K4394) ble kjøpt fra Sigma og brukes på en 0,2 eller 0,4μM konsentrasjon fra en DMSO løsning.
plasmider bygging
DNA fragment (2492 bp) som tilsvarer den potensielle
RHBG
promoteren ble amplifisert ved bruk av polymerase kjedereaksjon med F-PR- BG- og R-Pr-BG (tabell 1) primere og det humane genomiske DNA av HEK293T celler som et templat. PCR-produktet ble spaltet med SacI og Bglll restriksjonsenzymer og klonet inn i pGL3-Basic (Promega) som har blitt linearisert med de samme restriksjonsenzymer. Delesjonsmutanter ble deretter konstruert ved å bruke pGL3-RHBG plasmid som templat og de angitte primere (tabell 1). PCR-produktene ble spaltet med SacI og Bglll restriksjonsenzymer og klonet inn i pGL3-Basic. Alle konstruksjonene ble verifisert ved sekvensering.
RNA ekstraksjon og QRT-PCR
Total cellulær RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. DNase-behandling ble gjort ved hjelp av en DNA Removal Kit (Invitrogen, # AM1906). En mikrogram total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Realtime RT-PCR ble utført på en StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ved hjelp GoTaq qPCR Master Mix (Promega) ved hjelp av de angitte primere (Tabell 2) og normalisert til p-aktin mRNA nivå målt parallelt.
immunfluorescens farging
Cellene ble dyrket i Millicell EZ 8 kammer lysbilde (Millipore). Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter og deretter permeabilisert med 0,1% TritonX-100 i 3 minutter og ble deretter blokkert med geiteserum (5%) i 30 minutter. Celler ble inkubert med β-catenin-antistoff (Cell signale # 8480, 1: 100 i 5% geiteserum) over natten ved 4 ° C. Platene ble vasket og inkubert med anti-kanin IgG (H + L) F (ab «) 2 fragment (Alexa Fluor 594 konjugat, Cell signale, 1: 250 i 5% geiteserum) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med PBS, ble platene montert med forlenge Gold antifade reagens med DAPI (Invitrogen).
Western Blot analyse
Totalt proteiner ble hentet ved hjelp av RIPA (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) lyseringsbuffer supplert med cocktail av fosfatase og proteasehemmere (Roche). Etter sentrifugering ble proteiner kvantifisert ved hjelp av Pierce Micro BCA Protein Assay Kit reduserende middel Kompatibel assay (Thermo Scientific). Like mengder (~ 20 ug) av proteiner ble deretter separert ved Mini-Protean TGX geler (Bio-Rad). Proteiner ble overført til nitrocellulosemembran (Protran, VWR). Membranene ble blokkert med 5% melk og inkubert med anti-β-catenin (cellesignalisering, # 8480, 1: 1000), anti-TCF4 (# 2569, 1: 1000), anti-glutamin-syntetase (Abcam, # ab73593, 1 : 1000) eller anti-β-Actin (Sigma, # A2228, 1: 2000). Primære antistoffer ble detektert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus-IgG sekundære antistoffer (GE Healthcare) etterfulgt av måling av kemoluminescens (Lumi-LightPLUS, Roche).
RNA interferens
Celler ble omvendt transfektert med pre-designet lyddemper velge ikke-måls kontroll (Invitrogen, # 4390843) eller sirnas rettet mot β-catenin (Invitrogen, # s438) eller TCF4 (Invitrogen, # s13880) med Lipofectamine siRNAMAX (Invitrogen). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 72 eller 96 timer, og den indikerte mRNA og proteiner nivå ble undersøkt ved QRT-PCR og Western blotting, henholdsvis.
Transfeksjon og luciferase assay
Celler ble midlertidig ko-transfektert med pTK Renilla-luciferase reporter-vektor (Promega) og tomt plasmid (pGL3-Basic, Promega) eller plasmidet inneholdende den indikerte
RHBG
promotorkonstruksjoner i 48 timer ved hjelp av Viafect transfeksjon reagens (Promega). Luciferase aktivitet i totale cellelysater ble målt ved hjelp av Dual-Glo luciferase reporter analysen (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Luminescens ble målt ved hjelp av GloMax-96 Mikro luminometer (Promega).
Chromatin immunoprecipitation (CHIP) assay
CHIP analysen ble gjort ved hjelp av SimpleChIP Enzymatisk Chromatin IP Kit (magnetiske kuler, Cell signalering) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene fiksert med 1% formaldehyd-oppløsning for å kryssbinde histon og ikke-histonproteinene til DNA. Nuclear kromatin ble spaltet med Micrococcal nuklease i 20 minutter ved 37 ° C og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med enten anti-β-catenin (cellesignalisering, # 8480, 01:50), anti-TCF4 (# 2569, 1: 50) Normal Rabbit IgG (Cell signalering, # 2729). Etter vasking med lave og høye salt Chip buffere ble protein-DNA komplekser elueres og tverrforbindelser ble deretter omgjort. Etter proteinase K-fordøyelse, er DNA renset og kvantifisert ved sanntids-PCR som beskrevet tidligere ved bruk av primere som er oppført i tabell 2 og er utformet for å forsterke de angitte promoter-regioner av målgener.
Statistisk analyse
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM Statistiske sammenligninger ble vurdert av Student
t
-UNDERSØKELSER bruker Graph Pad Prism versjon 5.00 software (Graph Pad Software). Forskjeller ble betraktet som signifikant når p-verdien er under 0,05 (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001), n = 3, med unntak av Chip forsøk hvor n = 2.
Resultater
RHBG
er sterkt uttrykt i HepG2 hepatomceller
Den menneskelige
RHBG
genet ble funnet å være overuttrykt i en undergruppe av lever kreft [18], men de regulatoriske mekanismer som er involvert forbli ukjent. For å identifisere en kreftcellelinje som kunne bli brukt til å adressere regulering av
RHBG
, evaluerte vi dens uttrykk nivåer i HepG2 og Hep3B hepatomceller. HepG2-celler bærer en heterozygot delesjon i exon3 av β-catenin
CTNNB-1
genet, produserer en avkortet β-catenin protein som mangler nøkkelrester for dets fosforylering av ødeleggelse komplekse og dermed resulterer i sin cellulære akkumulering [ ,,,0],26-28]. Hep3B celler er hentet fra en hepatitt B-smittet lever svulst, og inneholder ikke mutasjoner i β-catenin gen [29,30].
RHBG
genet dukket sterkt uttrykt i HepG2 sammenlignet med Hep3B celler, idet sistnevnte viser noe høyere ekspresjon nivå sammenlignet med den i HEK293T celler tatt som en normal cellemodell (fig 1 A). Ekspresjonsnivået av
GLUL
, genet for glutaminsyntetase (GS) ble også oppregulert i HepG2-celler sammenlignet med Hep3B (figur 1B). Som GS-genet er et mål rapportert av β-catenin [31,32], kan dette være i samsvar med en mer effektiv β-catenin signalisering i HepG2 celler sammenlignet med Hep3B.
GLUL
uttrykk nivåer ble bekreftet av de resulterende GS protein nivåer som dukket opp høyere i HepG2 forhold til Hep3B celler (fig 1c). Ved å kontrollere ekspresjonen av den andre ikke-erytroide
RH
genet,
RHCG
, svært lave nivåer ble funnet i HepG2, Hep3B og HEK293T celler (figur 1D). Disse dataene dermed peker på HepG2 celler som er egnet for studiet av
RHBG
uttrykk.
a) nivået av mRNA uttrykk for
RHBG
i HEK293T, HepG2 og Hep3B celler ble bestemt ved QRT-PCR og normalisert til p-aktin. B) mRNA uttrykk for
GLUL
i HepG2 og Hep3B ble bestemt ved QRT-PCR. C) Western Blot-analyse av GS-protein fra de totale cellelysatene av HepG2 og Hep3B celler. D) Nivået av mRNA uttrykk for
RHCG
i HEK293T, ble HepG2 og Hep3B celler bestemmes ved QRT-PCR og normalisert til p-aktin. E) Western Blot analyse av β-catenin protein fra totale cellelysater av HEK293T, HepG2 og Hep3B celler.
Vi neste sjekket β-catenin protein nivåer i HepG2, Hep3B og HEK293T celler. I samsvar med tidligere rapporter [33,34], HepG2 celler næret to β-catenin arter trolig tilsvarende villtype og forkortede former (Fig 1E). En β-catenin protein med størrelsen av villtype-form ble påvist i både HEK293T og Hep3B, med ingen åpenbare akkumulering i den sistnevnte cellelinje. Det ble tidligere vist at β-catenin er til stede i kjernen av HepG2-celler i motsetning til Hep3B celler [34]. Disse dataene antyder en sammenheng mellom
RHBG
uttrykk i HepG2 celler og kjernefysiske lokalisering av β-catenin.
stanse av β-catenin korrelerer med
RHBG
nedregulering i HepG2 celler
neste brukte β-catenin siRNA å teste om
RHBG
genuttrykk observert i HepG2 celler er relatert til p-catenin funksjon. Transfeksjon av HepG2-celler med β-catenin siRNA i 72 timer førte til en reduksjon i β-catenin mRNA nivå sammenlignet med celler transfektert med ikke-målsøkende siRNA (figur 2A). Reduksjonen av β-catenin mRNA resulterte i en reduksjon av β-catenin proteinnivåer (figur 2B). Av notatet,
RHBG
genekspresjon ble i stor grad redusert ved β-catenin stanse (Fig 2C). Tilsvarende uttrykk nivåer av
Axin2 Hotell og
Cyclin D1
, to mål av β-catenin regulering [35-38], ble også redusert med β-catenin stanse (fig 2D og 2E). I motsetning til dette ble det lave ekspresjonsnivået av
RHCG
observert i HepG2 celler ikke påvirket av β-catenin stanse (figur 2F). Derfor er inhibering av β-catenin ledsaget av nedregulering av
RHBG
genekspresjon i HepG2-celler.
AF) HepG2-celler ble transfektert med omvendt β-catenin eller kontroll (scramble) siRNAs. 72 timer etter transfeksjon, uttrykk nivåer av
β-catenin
mRNA (A), β-catenin protein (B),
RHBG
mRNA (C),
Axin2
mRNA (D),
Cyclin D1
mRNA (E) og
RHCG
mRNA (F) ble bestemt.
Beta-catenin stasjoner
RHBG
uttrykk i SW480 tykktarmskreftceller
Mutasjoner som induserer β-catenin aktivering er blitt identifisert i ulike typer svulster, inkludert melanom, prostata, bryst og tykktarm kreft [21,33,39,40]. Vi neste testet om β-catenin signal kan være korrelert med
RHBG
uttrykk i en annen kreftcellelinje husing β-catenin signal aktive mutasjoner. De SW480 tykktarmskreftceller bære en avkorting mutasjon i
APC
genet, noe som resulterer i stabilisering og kjernefysisk akkumulering av β-catenin og fører til konstitutiv aktivering av β-catenin signal [41-44]. Konsekvent, immunfluorescens eksperimenter viste en sterk nukleær lokalisering av β-catenin i disse celler (figur 3A). Transfeksjon av SW480 celler med β-catenin siRNA i 72 timer førte til en nedgang i både mRNA og protein nivåer av β-catenin (Fig 3B og 3C). I likhet med HepG2 celler, ble β-catenin stanse ledsaget av en stor nedgang i
RHBG
uttrykk i SW480 celler (figur 3D). Uttrykket nivåer av
Axin2
, og
CylcinD1 plakater (Fig 3E og 3F) ble også redusert på β-catenin stanse, i samsvar med β-catenin signale hemming.
RHCG
uttrykk ble ikke signifikant påvirket ved β-catenin stanse (fig 3G).
A) Representative resultatene av immunfluorescens av β-catenin lokalisering i SW480 celler ved hjelp av β-catenin antistoff. Kjerner ble farget med DAPI. B-G) SW480 celler ble omvendt transfektert med β-catenin eller kontroll (rykke) sirnas. 72 timer etter transfeksjon, uttrykk nivåer av
β-catenin
mRNA (B), β-catenin protein (C),
RHBG
mRNA (D),
Axin2
mRNA (E),
Cyclin D1
mRNA (F) og
RHCG
mRNA (G) ble bestemt.
Disse resultatene indikerer at korrelasjonen mellom β-catenin signalering og
RHBG
uttrykk kan utvides til SW480 tykktarmskreftceller.
Aktivering av β-catenin korrelerer med
RHBG
genet induksjon i HEK293T celler
Vi neste adressert om aktivering av β-catenin i en cellelinje med ingen store kjernefysisk aktivitet av β-catenin kan være tilstrekkelig til å indusere
RHBG
uttrykk. LiCl er rapportert å inhibere GSK3p kinase [45,46], noe som fører til p-catenin stabilisering og atom akkumulering [47,48]. Vi behandlet derfor HEK293T celler med LiCl (10 og 20 mm) for å aktivere Wnt /β-catenin veien. I tråd med tidligere observasjoner, immunfluorescens og vestlige blot eksperimenter viste at behandling av HEK293T celler med LiCl i 24 timer induserte en kjernefysisk akkumulering og stabilisering av β-catenin (fig 4A og 4B). Av notatet, LiCl behandling samtidig induserte en økning i mRNA nivå av
RHBG
på en doseavhengig måte (fig 4C). Dette resultatet indikerer at
RHBG
ekspresjon kan bli oppregulert ved kunstig aktivering av β-catenin signalering og antyder at aktivering av denne reaksjonsvei kan være tilstrekkelig til å indusere
RHBG
uttrykk i HEK293T cellene.
A) HEK293T celler ble behandlet med LiCl (20 mM) i 24 timer. β-catenin lokalisering ble bestemt ved hjelp av immunofluorescens β-catenin antistoff. Kjerner ble farget med DAPI. B) HEK293T celler ble behandlet med LiCl (10 eller 20 mM) i 24 timer. β-catenin proteinnivået ble bestemt i totale cellelysater ved immunoblotting hjelp β-catenin antistoff. C) samme kulturen vilkår som i B.
RHBG
mRNA nivå ble bestemt ved QRT-PCR.
RHBG
uttrykk i HepG2 celler er avhengig TCF4
Wnt /β-catenin sti driver Wnt-spesifikke transkripsjonsprogrammer via interaksjon med DNA-bindende faktorer av TCF /LSF familie [21,22]. Imidlertid er det rapportert at β-catenin kan også aktivere genuttrykk i en TCF4 uavhengig [49-51]. For å ta en rolle av TCF4 /β-catenin kompleks i
RHBG
uttrykk, vurderte vi effekten av å hemme β-catenin aktivitet i HepG2 celler ved hjelp av en antagonist av TCF4 /β-catenin kompleks, PKF118 -310. Denne forbindelse forstyrrer TCF4 /β-catenin komplekset og inhiberer ekspresjon av TCF4 avhengige gener [52]. Behandling av HepG2 celler med PKF118-310 ble ledsaget av en nedgang i
RHBG
uttrykk (Fig 5A).
GLUL
uttrykk nivå ble også redusert med behandling, i samsvar med en sannsynlig reduksjon av TCF4 /β-catenin mediert transkripsjon i disse forholdene (Fig 5B).
AB) HepG2 celler ble behandlet med PKF118-310 (0,2 eller 0,4 mm) i 24 timer.
RHBG product: (A) og
GLUL product: (B) mRNA nivåer ble bestemt ved QRT-PCR. C-G) HepG2 celler ble omvendt transfektert med TCF4 eller kontroll (krafse) sirnas. 72 timer etter transfeksjon, nivåer av
TCF4
mRNA (C), TCF4 protein (D),
RHBG
mRNA (E),
Axin2
mRNA (F), og
Cylcin D1
mRNA (G), ble bestemt.
for å hevde ytterligere en rolle TCF4 i
RHBG
uttrykk, vi testet effekten av TCF4 knockdown i HepG2 celler. Transfeksjon av de sistnevnte cellene med TCF4 siRNA i 72 timer sank både mRNA og proteinnivåene av TCF4 sammenlignet med celler transfektert med ikke-målsøkende siRNA (Figur 5C og 5D). Viktigere,
RHBG
mRNA-nivået ble redusert ved TCF4 stanse (fig 5E) Tilsvarende
Axin2 Hotell og
cyclin D1
mRNA nivåer ble også redusert (figur 5F og 5G ), i tråd med tidligere observasjoner som beskriver de tilsvarende gener som mål for TCF4 [38,40]. Videre lignende TCF4 stanse eksperimenter utført i SW480 tykktarm adenokarcinomceller også redusert
RHBG
,
Axin2 Hotell og
cyclin D1
mRNA nivåer (fig 6A-6E).
AE) SW480 celler ble omvendt transfektert med TCF4 eller kontroll (krafse) sirnas. 72 timer etter transfeksjon, nivåer av
TCF4
mRNA (A), TCF4 protein (B)
RHBG
mRNA (C),
Axin2
mRNA (D), og
Cyclin D1
mRNA (E), ble bestemt.
Disse resultatene sammen tyder på at β-catenin-mediert uttrykk for
RHBG
er minst delvis TCF4 avhengig i både HepG2 og SW480 celler.
RHBG
promoter aktiveres ved β-catenin /TCF4
for å videre studier
RHBG
uttrykk og identifisere potensielle regulatorer, en genomisk fragment (figur 7) som inneholder 2349 bp oppstrøms og 142 bp nedstrøms for
RHBG
spådd transkripsjonen start hotellet (TSS) ble retnings subklonet inn i pGL3-grunn ildflue luciferase reporter vektor. For å teste om dette fragmentet besitter en promoter aktivitet,
RHBG
promoter konstruksjon (pGL3-RHBG) og den innfødte pGL3-basisvektoren ble brukt for transient ko-transfeksjon av HepG2 cellene sammen med PTK-Renilla luciferase reporter vektor som transfeksjon kontroll. 48 timer etter transfeksjon, luciferaseaktiviteten i pGL3-RHBG transfekterte celler var omtrent 30 ganger høyere enn med den pGL3-basis plasmid som indikerer at det klonede
RHBG
sekvens inneholder en aktiv promoter (figur 8A).
Den potensielle menneskelige
RHBG
promotorsekvens ble hentet fra eukaryote promoter database (https://epd.vital-it.ch/). Svart pil (↓) indikerer spådd transkripsjon start hotellet (TSS), som er utpekt nukleotid 0. GC boksene er skygget. Et utvalg av potensielle bindingsseter (med 0 eller mindre enn 5% ulikhet) av transkripsjonsfaktorer som er identifisert ved hjelp av PROMO [54,55] er understreket. Potensielle TCF4 bindingssteder er angitt med tomme bokser. Horisontale piler (→) indikerer start rest posisjonen til hver promoter konstruksjon analysert i figur 8.
HepG2 celler ble transfektert med tom plasmid (pGL3) eller
RHBG
promoter (pGL3 -RHBG) sammen med Renilla plasmid. 48 timer etter transfeksjon,
RHBG
promoter aktivitet i totale cellelysater ble bestemt av luciferase assay. B) HepG2 celler ble transfektert med
RHBG
promoter (pGL3-RHBG) eller den angitte konstruksjonen sammen med Renilla plasmid. 48 timer etter transfeksjon,
RHBG
promoter-aktivitet ble bestemt ved å måle luciferaseaktiviteten i totale cellelysater. Data er uttrykt som gjennomsnittet av målinger in triplo verdier ± S.E.M. av pGL3-RHBG konstruere relativt til pGL3-Basic. C) HepG2-celler ble transfektert med de indikerte konstruksjonen sammen med Renilla plasmid. 48 timer etter transfeksjon,
RHBG
promoter aktivitet ble bestemt ved å måle luciferase aktivitet i totale cellelysater.
Sekvensanalyse av
RHBG
regulatorisk sekvens ikke avsløre en potensiell TATA-boks, mens regionen proksimalt for den forutsagte TSS ble anriket i G /C-innhold, noe som indikerer at
RHBG
promoter sannsynligvis korresponderer med en TATA-lavere GC-rik promoter. To potensielle GC boksene ble avbildet, forankret i potensielle Sp-1 bindingsseter (figur 7). For ytterligere å dissekere regioner som er viktige for aktivitet av klonede
RHBG
promoteren, ble en serie av konstruksjoner som genereres bærende progressive delesjoner i denne DNA-fragment (figur 7 og 8).
Selv om svingninger bemerket i henhold til det betraktede fragment, alle konstruksjonene som inneholder -60 /+ 142 region produsert en luciferase-aktivitet meget nær eller høyere enn full-lengde pGL3-RHBG konstruere (figur 8B). Av oppmerksom på -60 /+ 142 regionen fragment H, omfatter bare én av både GC bokser, beholdes høy luciferase aktivitet. Konstruksjonene bærer videre 5 «avkorting i denne regionen har ført til en stor reduksjon av
RHBG
arrangøren funksjonen, -22 /+ 142-regionen som viser en svært lav luciferase aktivitet (figur 8B). Dette understreker viktigheten av DNA-segmentet mellom fragment H og I, og viser at uttrykket funksjon er mest sannsynlig på grunn av tap av den andre GC-boksen. I tillegg er analysen av -60 /+ 142 funksjonelt segment viste nærvær av tre CTTTG /CAAAG motiver som kan tjene som TCF4 bindingsseter (figur 7). Disse motivene er enten sidestilt til eller nedstrøms for den antatte TSS. For å evaluere et potensielt bidrag fra disse motivene til regulering av
RHBG
genekspresjon, arrangøren konstruerer bærer -60 /+ 142 regionen fragment H med sletting av potensiell TCF4 bindende motiv 2, eller motivene 2 og 3, ble generert. Begge konstruksjoner viste en promoter aktivitet (figur 8C). Men sletting av motiv 2 redusert arrangøren aktiviteten til halvparten av fragment H, og samtidig sletting av motivene 2 og 3 ytterligere redusert arrangøren aktivitet, noe som tyder på et bidrag på disse motivene til funksjonaliteten til
RHBG
promoter .
Vi har endelig gjennomført kromatin immunoprecipitation (chip) analyser for å fastslå om TCF4 og β-catenin er i stand til å binde -60 /+ 142 segment av
RHBG
arrangøren
in vivo
. Nukleære ekstrakter oppnådd fra HepG2-cellene ble utsatt for protein /DNA-kompleks tverrbinding og immunoutfelling ble utført ved anvendelse av antistoffer som er målrettet mot enten β-catenin, TCF4 eller IgG, som en kontroll. qPCR bruker primere innenfor H regionen viser at TCF4 og β-catenin binder seg til dette fragment av
RHBG
promoter (figur 9). Konsekvent, TCF4 og β-catenin gjorde også binde til
Axin2
promoter, tas som kontroll, som tidligere rapportert [37,53].
HepG2 celler ble tverrbundet med formaldehyd, etterfulgt av kromatin fordøyelsen. Kromatin immunoutfellinger ble utført ved anvendelse av antistoffer som er målrettet mot enten β-catenin, TCF4 eller IgG, som en kontroll. Renset DNA ble analysert ved qPCR hjelp av de angitte primere. Mengden av immunopresipitert DNA med hvert antistoff er representert som signal i forhold til IgG (tilsvarende en) (n = 2).
Disse resultater indikerer at TCF4 /β-catenin binder spesifikt til -60 /+ 142 regionens av
RHBG
promoter, og sannsynligvis forsterker
RHBG
uttrykk i HepG2 celler.
Diskusjoner
Denne studien identifiserer hepatom HepG2 celler som uttrykker
RHBG
genet som koder for et ammonium transport protein. Vi viser at i disse cellene
RHBG
uttrykk er i stor grad avhengig av β-catenin funksjon. Vi utfører en funksjonsanalyse av
RHBG
oppstrøms regulatorisk sekvens, avslører en minimal region bærer en promoter aktivitet. Våre data tyder på at
RHBG
regulatorisk sekvens er en TATA-mindre GC-rik promoter. Vi viser at β-catenin og TCF4 er begge i stand til å binde minimal promoter regionen
in vivo Hotell og karakterisere potensielle TCF4 bindende motiver viktige for arrangøren aktivitet. Våre data støtter en direkte rolle for β-catenin /TCF4 i reguleringen av
RHBG
uttrykk i denne cellelinjen, og videre indikerer at
RHBG
kan tjene som en direkte reporter av Wnt /β-catenin sti i bestemte kreftcelle sammenhenger.
leverkreft er den vanligste voksen leveren kreft og mange bevisføringer knytte hyperaktive av Wnt /β-catenin vei til sin initiering og utvikling [56]. Unormal aktivering av Wnt /β-catenin signalering, på grunn av tap-av-funksjon mutasjoner i APC eller aktiverende mutasjoner i β-catenin har vært knyttet til forskjellige humane maligniteter, inkludert melanom, bryst, kolon og karsinomer [22]. For eksempel kan mer enn 80% av kolon kreft bærer trunkeringer i APC, noe som resulterer i aktiv β-catenin opphopning i kjernen, den innledende fasen av transformasjon [56-58].
