Abstract
Eggstokkreft er den vanligste dødsårsaken fra gynekologisk kreft. Deregulering av p53 og /eller p73-assosiert apoptotiske baner bidrar til den platinabaserte motstand i eggstokkreft. NOXA, en pro-apoptotiske BH3-bare protein, er identifisert som en transkripsjon mål av p53 og /eller p73. I denne studien fant vi at genetiske varianter av BCL-2 proteiner finnes blant cisplatin-sensitive og -resistente eggstokkreft celler, og svarene av NOXA og Bax til cisplatin er regulert hovedsakelig av p53. Vi evaluerte ytterligere effekten av NOXA på cisplatin. NOXA indusert apoptose og sensitivisert A2780s og SKOV3 celler til cisplatin
in vitro Hotell og
in vivo
. Effektene ble formidlet av forhøyet Bax uttrykk, forbedret caspaseaktivering, frigjøring av Cyt C og Smac inn i cytosol. Videre genet Slå av Bax eller Smac betydelig svekket NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i kjemosensitiv A2780s celler, mens overekspresjon av Bax eller tillegg av Smac-N7 peptid betydelig økt NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i kjemoresistent SKOV3 celler. Så vidt vi vet, disse dataene viser en ny mekanisme som NOXA chemosensitized eggstokkreft celler til cisplatin ved å fremkalle endringer i Bax /Smac aksen. Til sammen våre funn viser at NOXA er potensielt nyttig som et chemosensitizer i eggstokkreft terapi
Citation. Lin C, Zhao X-y, Li L, Liu H-y, Cao K, Wan Y, et al. (2012) NOXA-Induced Endringer i Bax /Smac Axis øke følsomheten av eggstokkreft celler til Cisplatin. PLoS ONE 7 (5): e36722. doi: 10,1371 /journal.pone.0036722
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 28. mars 2012; Godkjent: 10 april 2012; Publisert: 09.05.2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Key Basic Research Program of China (2010CB529900) og Science Foundation of China Natural (30900744, 81071817 /H1609, 81001010). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den vanligste dødsårsaken fra gynecologic malignitet [1]. Selv om det er noen forbedringer, forblir langvarig overlevelse dårlig på grunn av doseavhengige toksisitet, eventuelt tumorresidiv og fremveksten av legemiddelresistent sykdom. For å overvinne disse hindringene, har undersøkelser i økende grad fokusert på nye terapeutiske strategier: modulering av mobilnettet kjemosensitivitet, rygge svulst motstand, og økende terapeutiske effekten av cellegift [2]. Emerging bevis tyder på at deregulert apoptose veien er en stor bidragsyter til startfasen, progresjon og utvikling av ervervet resistens mot anticancer behandling [3], [4].
Som en felles genetisk hendelse i ovarialcancer, p53 mutasjon er assosiert med resistens til platina-basert kjemoterapi [5]. Nye rapporter har vist at p73, et medlem av p53 familie proteiner, er en viktig regulator av apoptose mottakelighet for cisplatin (Cis) i A2780 eggstokkreft celler [6], [7], og at p73 avhengig transkripsjonen programmet er en viktig bidragsyter til den kjemosensitivitet banen i BRCA1-manglende ovarian carcinoma celler [8], noe som indikerer noen mekanismer som påvirker denne p73 uttrykk og funksjoner kan bidra til utvikling av resistens overfor cisplatin-indusert apoptose i eggstokkreft celler [7]. Alle disse observasjoner tyder på at deregulering av p53-avhengig og /eller p73-assosiert apoptotiske reaksjonsveier kan bidra til den platinabaserte motstand i eggstokkreft. Dermed kan restaurering av p53 og /eller p73 sti ved å aktivere seg selv eller sine nedstrøms mål være en attraktiv vei å forbedre effekten av kreftterapi.
NOXA ble først identifisert som en transkripsjons mål av p53 [9], og nylig ble det også vist seg å være regulert transkripsjonelt av p73 [8]. Som mange Bcl-2-familieproteiner som translocate til mitokondriene og modulerer mitokondriefunksjon, NOXA translocates til mitokondriene og deretter fører til cytokrom C (Cyt C) frigivelse og caspase-9-aktivering, og til syvende og sist fører til celledød [10], [ ,,,0],11]. NOXA funksjoner gjennom Bax og /eller Bak for å indusere apoptose i noen kreftceller, for eksempel humane Hela epitel-cervikale kreftceller [9], melanomceller [11], MCF-7 humane brystcancerceller [12], etc. Videre, en nylig rapporten viste en terapeutisk potensial på NOXA i behandling av human brystcancer [12]. Men rollen NOXA i terapeutiske svarene av eggstokkreft celler til platinabaserte legemidler mot kreft er fortsatt uklart.
I dette arbeidet må vi først valgte cisplatin-sensitive (A2780s, IGROV1 og OAW42) og motstandsdyktig ( A2780cp, OVCAR-3 og SKOV3) menneskelige eggstokkreft cellelinjer for å teste uttrykket varianter av prosurvival og proapoptotiske Bcl-2 familien proteiner. Da vi undersøkte cisplatin-indusert uttrykk nivåer av p53, p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax i flere menneskelige eggstokkreft cellelinjer med ulik p53 status inkludert A2780s (p53 villtype, p53 WT), SKOV3 ( p53 dobbel delesjonsmutant, p53 – /-), OVCAR-3 (husing mutant p53 R248Q) og A2780cp (inneholdende p53 villtype-gensekvens, men viste tap av p53-funksjon) [13], [14]. Vi fant at p53, p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax ble signifikant indusert ved cisplatin i p53-villtype A2780s-cellelinje, men i andre tre p53-mutant ovarie cancer-cellelinjer, er uttrykk for p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax forble uendret. Videre er svarene av NOXA og Bax til cisplatin reguleres hovedsakelig av p53 enn p73 i eggstokkreft cellelinjer. Tatt i betraktning den store regulerende funksjon av p53 på NOXA og Bax, to p53 og /eller p73 nedstrøms målgener, vi videre valgt p53 dobbel delesjonsmutant SKOV3-cellelinje som en modell av indre motstand [15] – [17], og p53- -wild typen A2780s cellelinje, som ble avledet fra en pasient med ubehandlet primær eggstokkkreft [17], [18], som en modell av indre kjemosensitivitet, for å evaluere effekten av NOXA på det kjemoterapeutiske effekten av cisplatin i A2780s og SKOV3 ovarial kreft modeller
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant ut at NOXA induserer apoptose uavhengig av p53 i både A2780s og SKOV3 celler, og at forhøyet uttrykk for NOXA kan forbedre følsomheten eggstokkreft celler til cisplatin gjennom endringer i Bax /Smac aksen. Så vidt vi vet, vi gir nye bevis for den potensielle anvendelsen av NOXA som chemosensitizer i eggstokkreft terapi.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle studier med mus var godkjent av Institutional Animal Care og behandling Committee of State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University.
Material
Smac-N7 peptid (AVPIAQKPRQIKIWFQNRRMKWKK) ble kjøpt fra Calbiochem, Inc. (San Diego , CA). Den ble modifisert for å være cellepermeabel ved kobling av den COOH-terminale lysin for arginin i en Antennapedia homeodomain 16-mer peptid via en linker prolin. De primære antistoffer for western blotting er som følger: Anti-Bcl-2 (sc-130 307), anti-Bcl-x
L (sc-8392), anti-Mcl-1 (SC-69839), anti-NOXA (sc-30209), anti-p53 (DO-1), anti-p73 (H-79), anti-p21
Waf1 /Cip1 og anti-β-aktin (Santa Cruz, CA); anti-Bax N-20 (sc-493); anti-caspase-3, anti-spaltet caspase-3, anti-caspase-9 og dens spaltet form (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); anti-Smac (klone FKE02, R D Systems, Minneapolis, MN); anti-Cyt C (sc-13156), cytokromoksydase subenhet IV (molekylære prober).
Plasmider
Både pcDNA3.1 (pc3.1) og pcDNA3.1 plasmid som koder for human NOXA genet (pcDNA3.1-hNOXA, pc3.1-hNoxa) ble renset ved to runder med føring over EndoFree kolonner (Qiagen, Chatsworth, CA), som rapportert tidligere [19]. pc3.1-Bax konstruksjonene ble generert i henhold til våre tidligere metoder [20].
Gene stanse med små interfererende RNA
Liten interfering RNA (siRNA) oligonukleotider ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO ) med sekvenser målrettet mot Bax (5′-AACUGAUCAGA ACCAUCAUGG-3 «) og Smac (5′-AACCCUGUGUGCGGUUCCUAU-3»). For Bax og Smac shRNA konstruksjon, ble det Bax og Smac siRNA klonet inn i pSilencer 2,1-U6 hygro plasmid.
Cell kultur og transfeksjon
A2780s, IGROV1, OAW42, A2780cp, OVCAR-3 og SKOV3 humane ovarie cancer-cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket i DMEM eller RPMI 1640 dyrkingsinneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), respektivt, ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine ™ 2000 i henhold til produsentens instruksjoner
Behandlinger av celler i
in vitro
eksperimenter
A2780s og SKOV3 celler ble behandlet som følger:. Control, cellene forble ubehandlet og høstet når dyrket i 72 timer. pc3.1 (tom vektor) ble cellene transfektert med pc3.1, og deretter høstet ved 48 h posttransfection. hNOXA, celler transfektert med pc3.1-hNOXA ble høstet ved 48 h posttransfection. Cisplatin, cisplatin (5 ug /ml) ble tilsatt når cellene ble dyrket i 48 timer. 24 timer senere ble cellene høstet. hNOXA og cisplatin, ble celler transfektert med pc3.1-hNOXA tilsettes cisplatin (5 ug /ml) ved 24 timer posttransfection. Tjuefire timer senere ble cellene høstet.
For genet Slå eller overekspresjon av Bax og Smac, tilsvarende sirnas eller plasmider ble ko-transfektert med pc3.1 /pc3.1-NOXA plasmider inn A2780s eller SKOV3 celler. Cellene som ble behandlet ovenfor ble det tilsatt cisplatin i ytterligere 12 timer ved 12 timer etter transfeksjon, og deretter høstet ved 24 timer etter transfeksjon.
Påvisning av ekspresjon hNOXA
in vitro
og
in vivo
for deteksjon av hNOXA uttrykk
in vitro
, A2780s celler ble behandlet i henhold til de planer som er beskrevet ovenfor. De høstede celler ble anvendt for å detektere hNOXA ekspresjon ved RT-PCR og western blot, respektivt. De tumorvev ble samlet for å påvise hNOXA uttrykk
in vivo
av RT-PCR. Primerne anvendt for amplifikasjon av hNOXA og GAPDH var som følger: NOXA-F 5′-AAGAACGCTCAACCGAGC-3’and NOXA-R 5′-GGTTCCTGAGCAGAAGAGT-3 «; GAPDH-F 5»-AATCCCATCACCATCTTCC-3 «og GAPDH-R 5′-CAT CACGCCACAGTTTCC-3».
Cell levedyktighet og apoptose analyser
Celleviabilitet ble vurdert av MTT-analyse [21] . Apoptose ble vurdert som følger: påvisning av DNA-fragmentering med celledød Detection ELISA-sett (Roche Diagnostics), western blot analyse av kaspase-aktivering, måling av apoptotiske celler ved flowcytometri (PI farging for sub-G1) og Hoechst 33258 farging. Celledød Detection ELISA kvantifisert apoptotiske celler ved påvisning av histon-assosierte DNA-fragmenter (mono- og oligo-nukleosomer) genereres av apoptotiske celler [20], [22].
flowcytometrisk analyse og Hoechst 33258 beising
Strømningscytometrisk analyse ble utført for å identifisere under G1 celler /apoptotiske celler og for å måle prosentandelen av sub-G1-celler i hypotonisk buffer som tidligere beskrevet [23]. Hoechst 33258 farging ble utført accordingto produsentens instruksjoner.
semikvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen). Semikvantitativ RT-PCR ble gjort for å forsterke NOXA og GAPDH.
subcellular fraksjonering og western blot
subcellulære fraksjonering ble gjort for å få mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner som tidligere beskrevet [24]. Totale cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [25]. Totalt cellelysater og subfraksjonering lysatene ble brukt til western blot analyse.
Animal tumormodeller og behandling
A2780s og SKOV3 celler (2 × 10
6 celler) ble implantert subkutant inn i de riktige flankene av 6- til 8 uker gamle hunn nakne mus, henholdsvis. For å utforske den terapeutiske effekt av NOXA og cisplatin, behandlet vi musene på dag 10 etter implanteringen av tumorceller, når tumordiameter nådde ~ 5 mm i diameter. Musene ble tilfeldig inndelt i 5 grupper (5 mus pr gruppe) og behandlet med: (a) 0,100 mL PBS; (B) 0,10 mikrogram pc3.1 plasmid /30 mikrogram liposombehandlede komplekser i 100 mL PBS; (C) 0,10 ug pc3.1 -hNoxa plasmid /liposom-komplekser 30 ug i 100 ul PBS; (D) 0,100 mL av 0,1 mg cisplatin (5 mg /kg kroppsvekt); (E) 0,10 ug pc3.1-hNoxa plasmid /liposom-komplekser 30 ug i 100 ul PBS og 100 ul 0,1 mg cisplatin. Musene ble behandlet med DNA-liposom-komplekset ved intravenøs administrering
via
halevenen to ganger i uken, og cisplatin intraperitonealt en gang i uken i 4 uker. Tumorvolumene ble beregnet ved den følgende formel: tumorvolum (mm
3) = 0,52 x lengde (mm) x bredde (mm) x bredde (mm) [26]. De tumorvev ble samlet for tunel eksperimenter.
Terminal deoksynukleotidyl-transferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse
TUNEL ble utført med en In situ celledød Detection Kit (Roche). Celle apoptose ble kvantifisert ved å bestemme prosentandelen av positivt fargede celler for alle kjernene i 20 tilfeldig valgte felt /seksjon ved 200 x forstørrelse. Lysbilder av apoptose studier ble kvantifisert i en blind måte av to uavhengige lesere to forskjellige tider.
Statistiske analyser
Den statistiske analysen ble utført med SPSS (versjon 17.0 for Windows). Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ANOVA og Tukey-Kramer multiple sammenligningstest ble brukt i sammenligningene. Overlevelseskurver ble konstruert i henhold til Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans ble bestemt av log-rank test.
p
verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. Feilfelt representerer SEM med mindre annet er angitt.
Resultater
Genetiske varianter blant cisplatin-sensitive og -resistente eggstokkreft celler
Western blotting-analyse viste at cisplatin-sensitive ( A2780s, IGROV1 og OAW42) cellelinjer uttrykke relativt lave endogene nivåer av BCL-2, Bcl-x
L og Mcl-en mens cisplatin-resistente (A2780cp, OVCAR-3 og SKOV3) cellelinjer var tvert imot. I motsetning til prosurvival BCL-2 familie proteiner, nivåene av proapoptotiske Bak og Bax i A2780s, IGROV1 og OAW42 cellelinjer er høyere enn de i A2780cp, OVCAR-3 og SKOV3 cellelinjer (figur 1A).
(A) Western blotting ble utført for uttrykket varianter av prosurvival BCL-2, Bcl-x
L og Mcl-en og proapoptotiske Bak og Bax proteiner blant cisplatin-sensitive (A2780s, IGROV1 og OAW42) og motstandsdyktig ( A2780cp, OVCAR-3 og SKOV3) eggstokkreft celler. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) A2780s (p53 WT) og SKOV3 (p53 – /-) celler ble behandlet med cisplatin (5 ug /ml) i 24 timer og analysert for ekspresjon av p53, p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax ved Western blotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) OVCAR3 (husing mutant p53 R248Q) og A2780cp (inneholdende p53 villtype-gensekvens, men viste tap av p53-funksjon) celler ble behandlet med cisplatin (5 ug /ml) i 24 timer og analysert for ekspresjon av p53, p73 , p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax ved Western blotting. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Vi videre undersøkt cisplatin-indusert uttrykk nivåer av p53, p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax i flere menneskelige eggstokkreft cellelinjer med forskjellig p53 status inkludert A2780s (p53 WT), SKOV3 (p53 – /-), OVCAR-3 (husing mutant p53 R248Q) og A2780cp (inneholdende p53 villtype-gensekvens, men viste tap av p53-funksjon). Alle de angitte celler ble behandlet med 5 pg /ml cisplatin i 24 timer. Som vist i figur 1B og C, p53, p73, p21
waf1 /cip1, ble NOXA og Bax funnet å være signifikant indusert av cisplatin i p53-villtype A2780s-cellelinje, men i andre tre p53-mutant cisplatin-resistente OVCAR-3, A2780cp og SKOV3 cellelinjer, uttrykk for p73, p21
waf1 /cip1, NOXA og Bax forble uendret. Videre er nivået av endogent Bax i cisplatin-resistente OVCAR-3, er meget lav (figur 1B og C) A2780cp og SKOV3 cellelinjer. Disse resultatene indikerer at svarene av NOXA og Bax til cisplatin er regulert hovedsakelig av p53 enn p73 i eggstokkreft cellelinjer.
Redusert levedyktighet av eggstokkreft celler
in vitro
av hNOXA og cisplatin
Den pro-apoptotiske funksjonen NOXA og mangel på NOXA induksjon i egen cisplatin-resistente SKOV3 (p53 – /-) på eggstokkene celler bedt oss om å undersøke om overekspresjon av NOXA undertrykker eggstokkreft cellevekst. Overekspresjon av hNOXA i transfekterte A2780s-celler ble bekreftet ved RT-PCR (figur 2A) og western-blotting-analyse (figur 2B), respektivt. Tatt i betraktning at NOXA funksjoner nedstrøms av p53-medierte apoptotiske reaksjonsvei, og at den cytotoksiske virkningen av cisplatin medieres av DNA-skade, som i sin tur transaktiverer målgener (egp53AIP, Puma, NOXA) for å forårsake apoptose, vi regner med at forhøyede NOXA uttrykk kan bevisstgjøre eggstokkreft celler til cisplatin. For å teste denne hypotese, vi først behandlet A2780s-celler med cisplatin ved indikerte konsentrasjoner, med en 24- eller 48-timers intervall, og fant at dosen av IC
50 av cisplatin varierte fra 5 ug /ml til 10 ug /ml (Figur 2C). Deretter, behandlet vi cellene med cisplatin på en suboptimal dose (5 mikrogram /ml), med en 24/48-timers intervall, i henhold til de forskjellige planene som er beskrevet i meterials og Metoder. Etter behandling, ble levedyktighet av celler bestemt ved MTT-analyse. Som vist i figur 2D, sammenlignet med kontrollen, enten hNOXA eller cisplatin signifikant redusert A2780s cellenes levedyktighet med 41% /47% (P 0,001), respektivt, og 43% /49% (0,001 P 0,001). I p53-mangel SKOV3-celler, sammenlignet med pc3.1 kontroll, hNOXA også betydelig redusert cellelevedyktighet (P 0,001), mens cisplatin viste bare en svak, men ikke statistisk signifikant effekt på SKOV3 cellevekst (24 t, p = 0,874; 48 h, p = 0,921). Imidlertid er kombinasjonen av hNOXA og cisplatin meget betydelig redusert SKOV3 cellenes levedyktighet med 65% /68% (P 0,001). (Figur 2E)
(A) RT-PCR-analyse av hNOXA uttrykk
i vitro
etter transfeksjon av A2780s celler. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Western blotting-analyse av hNOXA uttrykk
in vitro
etter transfeksjon av A2780s celler. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) behandling av cisplatin ved indikerte konsentrasjoner og perioder reduserte A2780s cellenes levedyktighet, og viser at dosen av IC
50 varierte fra 5 ug /ml til 10 ug /ml. (D) behandling av hNOXA og cisplatin redusert A2780s cellenes levedyktighet mer betydelig enn ved behandling av hNOXA alene eller cisplatin alene gjorde. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (24 h, ** P 0,001; 48 h,
## P 0,001). (E) Behandlingen av cisplatin alene hadde liten effekt på overlevelse av SKOV3-celler, og kombinasjonen av hNOXA og cisplatin redusert SKOV3 cellenes levedyktighet mer betydelig enn ved behandling av hNOXA alene eller cisplatin alene gjorde. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (24 h, ** P 0,001; 48 h,
## P 0,001). Andel av overlevelse ble beregnet. Resultatene er vist som middel ± SD fra tre brønner og triplikate eksperimenter. I hvert forsøk, middels eneste behandlingen (ubehandlet) indikerer 100% celleviabilitet.
Induksjon av apoptose av eggstokkreft celler
in vitro
av hNOXA og cisplatin
kvantitativ vurdering av sub-G1-celler ved flow-cytometri ble anvendt for å beregne antall apoptotiske celler. Som vist i figur 3A, i cisplatin-sensitive A2780s celler, de apoptotiske celler utgjorde 34,6% i hNOXA-behandlede gruppen sammenlignet med 15,6% i pcDNA3.1-behandlede gruppen og 8,7% i kontrollgruppen. De apoptotiske celler utgjorde 63,6% i kombinasjonsgruppen versus 48,3% i cisplatin-behandlede gruppen. Disse resultatene antydet at enten cisplatin eller hNOXA alene signifikant induserte apoptose av A2780s celler, og hNOXA og cisplatin ytterligere forsterket induksjon av apoptose. Lignende resultater ble oppnådd i egen resistente SKOV3-celler med unntagelse av at cisplatin alene ble funnet å ha liten evne til å indusere apoptose av SKOV3-celler (figur 3B).
(A) Representative DNA-fluorescens-histogrammer av PI-fargede celler. A2780s celler ble behandlet med hNOXA i 24 timer, deretter med 5 ug /ml cisplatin i ytterligere 24 timer. A2780s celler ble behandlet med pcDNA3.1 eller hNOXA, cisplatin alene eller hNOXA pluss cisplatin og grupper Ctrl, pc3.1, hNOXA, Cis og hNOXA + Cis svarer til disse fem behandlinger (den samme som vist i de påfølgende paneler), med 8,7 % (Ctrl), 15,6% (pc3.1), 34,6% (hNOXA), 48,3% (Cis) og 63,6% (hNOXA + Cis) sub-G1 celler (apoptotiske celler), henholdsvis, som vurderes av flowcytometri. (B) SKOV3-celler ble behandlet med hNOXA i 24 timer, deretter med 5 ug /ml cisplatin i ytterligere 24 timer. SKOV3 celler var ubehandlet, behandlet med tom vektor eller hNOXA, cisplatin alene eller hNOXA pluss cisplatin, med 4,9% (Ctrl), 6,4% (pc3.1), 38,4% (hNOXA), 9,1% (Cis) og 52,3% (hNOXA + Cis) sub-G1-celler (apoptotiske celler), henholdsvis, som målt ved flow-cytometri. (C) normal og apoptotisk kjernemorfologi av A2780s-celler ble analysert ved hjelp av Hoechst 33258 farging. A2780s celler ble behandlet med de samme betingelser som beskrevet ovenfor. (D) Normal og apoptotisk kjernemorfologi av SKOV3-celler ble analysert ved hjelp av Hoechst 33258 farging. SKOV3 celler ble behandlet med de samme vilkår som nevnt ovenfor.
Apoptose ble ytterligere evaluert av Hoechst 33258 farging. I likhet med de ovennevnte resultater, både A2780s og SKOV3-celler ble det observert antall kondenserte kjerner (intakte eller fragmenterte), som er karakteristisk for apoptose, i kombinasjonsgruppen enn i hNOXA- eller cisplatin-behandlede celler. Det var ingen signifikant kondensert kjerner i mellom bare- og pc3.1 behandlede grupper. Imidlertid bør det bli lagt merke til at cisplatin behandlet SKOV3 celler viste ingen tilsvar apoptotiske tegn (Figur 3C og D).
De sensibiliserende virkning av NOXA formidles av utgivelsen av Cyt C og smac inn i cytosol
NOXA induserer apoptose gjennom aktivering av Bax og /eller Bak å utløse mitokondriell dysfunksjon og caspase-9-aktivering [10], [11], [27]. Som forventet, på cisplatin-sensitive A2780s celler, enten hNOXA eller cisplatin alene resulterte i betydelig oppregulering av Bax og aktivering av kaspaser 3 og 9, og deres kombinasjoner ytterligere forbedret opp-regulering av Bax og aktivering av kaspaser (figur 4A ). Videre ble det apoptose ledsaget av frigjøring av Cyt C og Smac inn i cytosol (figur 4B). Lignende resultater ble også oppnådd i egen resistente SKOV3-celler, med unntagelse av at cisplatin alene ble funnet å ikke bevirke at opp-regulering av Bax og aktivering av kaspaser og frigjøring av Cyt C og Smac (figur 4A og B).
(A) A2780s og SKOV3 celler ble utsatt for de angitte behandlinger som beskrevet i materialer og metoder. Caspaseaktivering ble analysert ved Western blotting. Pilene viser aktive former for kaspaser. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) A2780s og SKOV3 celler ble utsatt for de angitte behandlinger som beskrevet i materialer og metoder. Offentliggjøring av Cyt C og Smac inn i cytosol ble analysert ved Western blotting. Cox-IV blotter indikere mitokondrielle lastkontroller mens β-actin ble brukt som en lasting kontroll for cytosoliske fraksjonen.
Endringer i Bax /Smac aksen bestemmer følsomheten eggstokkreft celler til cisplatin
Vi observerte at oppregulering av Bax og frigjøring av Smac inn i cytosol i NOXA behandlet A2780s og SKOV3 celler (figur 4), og at cisplatin førte også til Bax oppregulering og Smac utgivelse i A2780s celler (figur 4 ), men i SKOV3-celler, var det ikke forårsaket oppregulering av Bax (figur 1 og 4), og frigjøring av Smac inn i cytosol (figur 4). Disse observasjonene bedt oss å spekulere i at Bax /Smac akse kan være en av viktigste faktorene for kjemosensitivitet i cisplatin-resistent eggstokkreft celler, og at NOXA-induserte endringer i Bax /Smac Axis kan øke følsomheten for eggstokkreft celler til cisplatin. For å teste spekulasjon, bestemte vi oss for å undersøke om NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose ble svekket i cisplatin-sensitive A2780s celler ved behandling med siRNA rettet mot Bax eller Smac, og om NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose ble forbedret i cisplatin- resistente SKOV3 celler når forbehandlet med Bax konstruere eller Smac N7 peptid, henholdsvis.
Som forventet Bax siRNA betydelig svekket NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i A2780s celler (figur 5A). Lignende resultater ble også funnet i A2780s celler etter behandling med siRNA målretting Smac (figur 5B). Spesifisitet av Bax og Smac siRNA tomannsboliger ble evaluert ved å analysere Bax og Smac protein uttrykk i A2780s celler transfektert med tilsvarende shRNA konstruksjon (figur 5C). I pc3.1-Bax-transfektert SKOV3 celler, overekspresjon av Bax, som ble bekreftet av western blotting-analyse (figur 5D), betydelig økt NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose (figur 5E). Tilsvarende tillegg av en NH2-terminal Smac heptapeptide (Smac-N7) også betydelig forbedret NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose (figur 5F).
(A) sirnas målretting Bax betydelig svekket NOXA og /eller cisplatin indusert apoptose i kjemosensitiv A2780s celler (* P 0,01; ** P 0,001). (B) sirnas rettet mot Smac betydelig svekket NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i kjemosensitiv A2780s celler (
# P 0,05; * P 0,01; ** P 0,001). (C) nedregulering av Bax eller Smac av Bax siRNA eller Smac siRNA ble bekreftet ved Western blot. (D) Overekspresjon av Bax ble bekreftet ved Western blot. (E) SKOV3-celler ble ko-transfektert med NOXA og pc3.1-Bax plasmider i 12 timer, etterfulgt av 5 ug /ml cisplatin behandling i ytterligere 12 timer. Overekspresjon av Bax betydelig økt NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i kjemoresistent SKOV3 celler (* P 0,01). (F) SKOV3-celler ble behandlet med NOXA og /eller cisplatin som beskrevet ovenfor, og deretter med 20 umol /L Smac-N7 peptid i ytterligere 3 timer. Smac-N7 peptid økt betydelig NOXA og /eller cisplatin-indusert apoptose i kjemoresistent SKOV3-celler (
# P 0,05, * P 0,01)
Forbedret anti-tumor effekten av kombinasjonen av hNOXA. og cisplatin in vivo
Basert på
in vitro
vekst-hemmende og pro-apoptotiske virkninger av hNOXA og cisplatin, vi videre undersøkt antineoplastiske effekt av hNOXA pluss cisplatin på A2780s og SKOV3 svulster
in vivo
. Som vist i figur 6A og B, på dag 34 etter implantering, de A2780s og SKOV3 tumorer i mus behandlet med PBS nådd 1174,28 ± 70.43 og 823.82 ± 73.27 mm
3 i volum, henholdsvis. De A2780s og SKOV3 svulster behandlet med hNOXA var signifikant (A2780s modell,
P
0,001; SKOV3 modell,
P
0,001) mindre enn de som ble behandlet med PBS, nå kun 686,06 ± 81.39 og 429.38 ± 22,9 mm
3 i volum, henholdsvis. Kombinasjonen av hNOXA og cisplatin videre tumorveksten slik at A2780s og SKOV3 svulster nådde 342,84 ± 38,8 og 279.27 ± 47,16 mm
3 i volum, henholdsvis, som var signifikant (A2780s modell,
P
0,001) mindre enn kontroll svulster, og betydelig mindre enn de svulster behandlet med hNOXA (A2780s modell,
P
0,001; SKOV3 modell, p 0,05; SKOV3 modell,
P
0,001). Cisplatin også resulterte i en betydelig reduksjon i tumorvolum (577.08 ± 77,04 mm
3) sammenlignet med kontroll svulster (
P
0,001) i A2780s modell. Men i SKOV3 modell ble det ikke observert noen signifikant forskjell i tumorvolum (605,44 ± 80,51 mm
3) i den cisplatin-behandlede gruppe sammenliknet med den pc3.1-behandlede gruppe (695.57 ± 79,28 mm
3) (
P
= 0,222).
Tumor undertrykkelse og overlevelse fordel i mus. A2780s celler (A, C) eller SKOV3 celler (B, D) 2 × 10
6 ble inokulert subkutant i kvinnelig naken mus ved 6-8 ukers alder. Mus (fem per gruppe) ble behandlet med PBS, pcDNA3.1, pcDNA3.1-hNOXA, Cisplatin og pcDNA3.1-hNOXA + cisplatin. I A2780s tumormodell, signifikante forskjeller i tumor undertrykkelse (** P 0,001) og overlevelse (
AP 0,05) hos mus behandlet med hNOXA eller cisplatin versus PBS og pcDNA3.1 kontroller; signifikant forskjell for svulster behandlet med hNOXA + cisplatin versus PBS og pcDNA3.1 kontroller (** P 0,001;
ΔΔP 0,01), og betydelig forskjell for kombinasjonsbehandling versus hNOXA eller cisplatin monoterapi (
# P 0,05;
† P 0,05). Lignende resultater ble også funnet i SKOV3 modell, bortsett fra at ingen signifikante forskjeller i tumor undertrykkelse (
P
= 0,222) og overlevelse (
P
= 0,433) mellom cisplatin- og pcDNA3.1- behandlede tumorer ble funnet. (E-F) TUNEL-farging av tumorvev. Representative seksjoner ble tatt fra A2780s (E) og SKOV3 (F) tumorvev hos mus som fikk PBS, pcDNA3.1, hNOXA, cisplatin og hNOXA + cisplatin. (G) apoptotisk indeks innen A2780s og SKOV3 tumorvev ble talt opp. I A2780s modell, statistisk signifikant forskjell i apoptotiske indeksen for svulster behandlet med hNOXA eller cisplatin versus PBS og pcDNA3.1 kontroller (** P 0,001); signifikant forskjell for svulster behandlet med hNOXA + cisplatin versus de to kontrollene (** P 0,001); og signifikant forskjell for kombinasjonsbehandling versus hNOXA eller cisplatin monoterapi (
## P 0,001). Lignende resultater ble også funnet i SKOV3 modell, bortsett fra at ingen signifikant forskjell i den apoptotiske indeksen mellom cisplatin-behandlede tumor og pcDNA3.1-behandlede tumor (P = 0,981) eller PBS-behandlede tumor (P = 0,705) ble funnet. Den apoptotiske indeksen ble beregnet som et forhold av den apoptotiske cellen nummeret til det totale celleantall i hvert felt. (H) RT-PCR analyse av uttrykk for eksogene hNOXA in vivo.
Survival kurve analyse (figur 6C) viste at A2780s svulst bærende mus i PBS eller pc3.1 behandlede gruppene overlevde mindre enn 65 dager i gjennomsnitt. I motsetning til dette, enten hNOXA eller cisplatin resulterte i en signifikant (
P
0,05) økning i levetid sammenlignet med de to kontrollgrupper, med den midlere overlevelsestid å være 74 og 80 dager, henholdsvis.
