Abstract
Identifikasjon av somatiske mutasjoner i kreft er et hovedmål for forståelse og overvåking av hendelser knyttet til kreft initiering og progresjon. Høy oppløsning smelting (HRM) kurve analyse representerer en rask, post-PCR high-throughput metode for å skanne somatiske sekvensendringer i målgener. Hensikten med denne studien var å vurdere sensitivitet og spesifisitet av HRM analyse for svulst mutasjon screening i en rekke tumorprøver, som omfattet 216 frosne pediatriske små runde blå-celle svulster samt 180 parafininnstøpte svulster fra bryst, livmor og eggstokkreft (60 av hver). HRM analyse ble utført i eksoner av følgende kandidat gener som er kjent for å huse etablerte ofte observert mutasjoner:
PIK3CA
,
ErbB2
,
KRAS
,
TP53
EGFR
,
BRAF
,
GATA3
, og
FGFR3
. Toveis sekvensanalyse ble anvendt for å bestemme nøyaktigheten til HRM analysen. For de 39 mutasjoner observert i frosne prøver, sensitivitet og spesifisitet av HRM analyse var 97% og 87%, henholdsvis. Det var 67 mutasjoner /varianter i parafininnstøpte prøver, og sensitivitet og spesifisitet for HRM analyse var 88% og 80%, respektivt. Parafininnstøpte prøvene krever høyere mengde renset DNA for høy ytelse. Oppsummert er HRM analyse en lovende moderat-throughput screening test for mutasjoner blant kjente søker genomiske regioner. Selv om den generelle nøyaktigheten ser ut til å være bedre i frosne eksemplarer, ble somatiske forandringer påvist i DNA ekstrahert fra parafininnstøpte prøvene
Citation. Gonzalez-Bosquet J, Calcei J, Wei JS, Garcia-Closas M, Sherman ME, Hewitt S, et al. (2011) Påvisning av somatiske mutasjoner av High-Resolution DNA Melting (HRM) Analyse i flere kreftformer. PLoS ONE 6 (1): e14522. doi: 10,1371 /journal.pone.0014522
Redaktør: Philip Awadalla, University of Montreal, Canada
mottatt: 02.03.2010; Godkjent: 08.12.2010; Publisert: 17. januar, 2011
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
finansiering:.. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Nylig ble den første kreft genomer til å være fullstendig sekvensert har avdekket en unanticiapted bredden og kompleksiteten av somatiske endringer [1], [2], [3]. Oppdagelsen av somatiske sekvensendringer, har akselerert etterforskningen av IR underliggende mekanismer i kreftutvikling. Somatiske endringer innblandet i kreftutvikling og vekst fordel kalles
driver
mutasjoner. Men flertallet av somatiske endringer i kreft genomer er en konsekvens av genomci ustabilitet og ser ut til å være
passasjer
eller tilskuer mutasjoner som er lite sannsynlig å bli involvert i onkogenese [4], [5]. Storskala sekvense studier har vist at utbredelsen og underskrift av somatiske mutasjoner i kreft hos mennesker er svært variabel [5], [6], [7], [8]. Basert på disse studiene, kan vi anslå at flertallet av somatiske mutasjoner i kreft celler sannsynligvis vil være passasjer mutasjoner, mens et mindretall er beregnet til driver mutasjoner [5], [7]. Hele landskapet i utbredelsen av mutasjoner samt deres funksjonelle konsekvenser vil ikke bli verdsatt til tusener av kreft genomer har blitt sekvensert.
Sekvense kreft genomer er en formidabel oppgave som krever dyre teknologier og beregningsorientert støtte til å montere store deler av genomet. På grunn av den intense interessen for å identifisere viktige somatiske forandringer, har etterforskningen fokusert på teknikker for screening eller analysere regioner av interesse. De fleste studier har konsentrert seg om koding regioner og tilstøtende intronic eller antatte regulatoriske regioner [9]. En av disse teknikker er den med høy oppløsning og som smelter (HRM) kurve analyse, en polymerase kjedereaksjon (PCR) basert high-throughput-analyse for detektering av DNA-sekvensvariasjon ved å måle forandringer i smelte av en DNA-dupleks, som har vært brukt med hell med DNA ekstrahert fra både frosset og parafin-innleiret vev [10], [11], [12].
HRM spesifikke PCR-produktene genereres for å avhøre konformasjonelle forskjeller, også kjent som dissosiasjonskurve analyse, ved hjelp av konvensjonelle sanntid PCR-plattformer. Det anvendes i kombinasjon med en dobbeltkjedet DNA-bindende fargestoff for å karakterisere primer-relaterte uspesifikk amplifikasjon (eller primer-dimer) for påvisning av et bestemt mål. Single-baseforandringer i PCR produktene blir oppdaget av endrede HRM egenskaper overvåkes gjennom utgivelsen av fluorescerende dobbel tråd DNA-bindende fargestoff [13], [14]. Utviklingen av nøyaktige og rimelige instrumenter som tilbyr HRM evner, og nye fluorescerende fargestoffer, gjør denne metoden attraktivt for målrettet mutasjon skanning og også kjønnsceller genotyping. HRM analyse benyttes for å pre-scan kandidatgener mistenkelige av mutasjoner, og reduserer i betydelig grad mengden av DNA-sekvensering å bli utført [15], [16], [17], [18], [19], [20].
Hensikten med denne studien var å vurdere sensitivitet og spesifisitet for en billig HRM analyse plattform for mutasjon skanning av single-basen variasjon i en rekke tumorprøver: frosne pediatriske små runde blå-celle svulster og parafin-embedded svulster fra bryst, livmorslimhinnen og eggstokkreft. Toveis sekvensanalyse ble utført for å bestemme nøyaktigheten av denne DNA HRM teknologien.
Metoder
Etikk erklæringen
Institutional Review Board for den polske Breast, Ovarian, og livmorkreft Study ble godkjent av National Cancer Institute (NCI), i Bethesda, Maryland, M. Sklodowska Institute of Oncology og Cancer Center i Warszawa, og Institute of Occupational Medicine (IOM) i Lodz, både i Polen [21] . Skriftlig informert samtykke til deltakelse på studiene ble oppnådd ved de deltakende institusjoner fra alle deltakere involvert
Alle frosne prøvene fra pediatriske små runde blå-celle svulster og innhentet fra Cooperative menneskelig vev Network (http:. //Chtn. nci.nih.gov/), ble anonymisert, og vår protokoll ble anmeldt av Office of mennesker forskning ved National Institutes of Health, Bethesda, MD, og anses fritatt.
DNA-prøver
frosne vevsprøver.
Snap frossen tumorprøver ble hentet fra Cooperative menneskelig vev Network (https://chtn.nci.nih.gov/). Neuroblastom cellelinjer og kulturforholdene deres er beskrevet andre steder [22]. Genomisk DNA ble ekstrahert fra frosne primær tumorprøver (neuroblastom, n = 140, rhabdomyosarkom, n = 63) og neuroblastom-cellelinjer (n = 13) ved bruk av en protokoll som er publisert [23]. DNA-konsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE), og deretter justert til den samme konsentrasjon, 10 ng /mL, for de 12 analyser. Matchet kontrollgruppe genomisk DNA var tilgjengelig fra perifert blod for 43 kreftformer.
parafininnstøpte vevsprøver.
Den polske bryst, ovarian, og livmorkreft Studien er en del av et samarbeidsstudie mellom USA National Cancer Institute (NCI), M. Sklodowska Institute of Oncology og Cancer Center i Warszawa, og Institute of Occupational Medicine (IOM) i Lodz [21] utviklet for å studere risikofaktorer for brystkreft, livmor og eggstokkreft [24], [25], [26]. Parafin blokker av svulstvev fra deltakerne i denne studien som ble operert ble samlet. Totalt har vi inkludert vev fra 60 deltakere med brystkreft, 60 med livmorkreft og 60 med eggstokkreft.
Enkelt 0,6 mm vev kjerner er rettet mot områder med svulst som hadde blitt identifisert og merket av en patolog (MES ) ble oppnådd fra hver tumor blokk for DNA-ekstraksjon, ved hjelp av en vev microarray kjerneborings nål for hver prøve. Mikrodisseksjon ble utført i en liten andel av prøvene, noe som gjør det vanskelig å vurdere nøyaktig prosentandelen av tumormateriale. Nukleinsyre ekstraksjon ble utført med Agencourt® FormaPure ™ kit (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. For å unngå interferens med den PCR vi fjernet fra RNA renset total nukleinsyre i løpet av utvinningsmetoden. Etter ekstraksjon og rensing DNA konsentrasjon og renhet ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). Totalt genomisk DNA ble ekstrahert med denne metoden ga en gjennomsnitt på 2,07 ug (område 0,03 til 7,69 mikrogram). Renheten av DNA for hver ekstraksjon metode ble bestemt ved å måle intensiteten av absorbansen til DNA-oppløsningen ved bølgelengder 260 nm (A260) og 280 nm (A280).
Valg av eksoner for screening
settet av eksoner valgt for denne mutasjonen skanning analysen ble trukket fra kreftgener ofte mutert (
PIK3CA
,
ErbB2
,
KRAS
,
TP53
EGFR
,
BRAF
,
GATA3
, og
FGFR3
) i publiserte rapporter, med særlig vekt på bryst, eggstokk og endometrium kreft [ ,,,0],5], [9], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Også HRM analyse for disse bestemte genomiske regioner hadde allerede blitt optimalisert.
Primer og pre-HRM PCR
Primers av eksonene, så vel som størrelsen av amplikonene, anvendes for pre -HRM PCR er oppført i tabell 1. i gjennomsnitt, 40 bp av den proksimale – ble 5′- eller intronic region som flankerer målet ekson og 41 bp av 3′-flankerende region intronic målet exon dekket av amplikonet. Det eneste unntaket var ekson 6 av
GATA3
, som måler 1462 bp, hvorav 284 bp tilsvarer koding nukleotider. I dette spesielle tilfellet, gjorde amplicon ikke strekker seg over 3 «side av intron (tabell 1 for detaljer)
Oppmerksomhet på detaljer i pre-HRM PCR-forhold er avgjørende for optimalisering. 1) utformingen av PCR primere for å holde GC innhold i henhold til eller så nær som 60% som mulig, produktstørrelse rundt 200 bp og unngå kjente varianter innenfor primer regionen; 2) valg av optimale annealing temperaturer med gradient PCR; 3) og utforming av PCR-eksperimenter på en konsekvent måte:. Samme assay, med samme satsvis og samme maskin løpe
PCR-baserte analyser for de forskjellige gener ble utført i 96-brønners format med 10 ul volumer og inkluderte 10 ng genomisk DNA for frosne prøver, og 1 ul oppløsning inneholdende genomisk DNA for parafininnstøpte vevsprøver, med en gjennomsnittlig konsentrasjon på 25,8 ng /ul (SD = 21,7), og som strekker seg fra 2 til over 55 ng /ul ( første kvartil 8,4 ng /ul og tredje kvartil 36,3 ng /mL). Master Mix som inkluderte alle deoksynukleosidtrifosfater, Taq polymerase, og LCGreen® PLUS (Idaho Technology, Salt Lake City, Utah) ble brukt til pre-HRM PCR. PCR ble utført ved anvendelse av en MJ Forskning PTC 225 Thermal Cycler (MJ Research, Inc. GMI, Ramsey, MN) med en innledende denaturering ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med to trinn temperaturomløp på 95 ° C i 30 sekunder, og 66 til 70 ° C i 30 sekunder (
PIK3CA
,
ErbB2
,
KRAS
66 ° C;
TP53
,
EGFR
,
BRAF
ved 68 ° C;
GATA3
,
FGFR3
ved 70 ° C). Etter PCR ble prøvene varmet opp til 93 ° C i 30 sekunder og deretter avkjølt til 25 ° C før HRM.
Prøvehåndtering
Frozen. HRM analyser ble utført i duplikat på alle prøvene som ga enten frank (n = 59) eller minimale variasjoner (n = 99) i den normaliserte HRM kurve, og også i 20% velges tilfeldig negative prøver (n = 45). En andre runde med HRM ble utført for å vurdere reproduserbarhet av fremgangsmåten, ved anvendelse av kjente negative kontroller og positive kontroller. Frank variasjoner ble definert som de HRM kurver tolkes av programvaren til å være skeptisk til å huse en nukleotid endring eller en mutasjon /variant, og var representert i rødt i grafikken (Figur S1). Minimal variant av en prøve ble ansett som når programvaren detektert mindre avvik i HRM kurve i forhold til den gjennomsnittlige villtype kurve uten å kalle det en mutasjon (3% av alle samtaler) (figur S1). Disse prøver ble representert enten i grå eller grønt, avhengig av deres grad av separasjon med gjennomsnitt vill-type kurve. Alle prøver med frank eller minimal variasjon av kurven gikk en gjentatt HRM analyse, og ble også sekvensert.
Parafin-embedded. Vi analyserte 60 brystkreftprøver, 60 endometriekreft prøver og 60 eggstokkreft prøver. Kvaliteten av det ekstraherte DNA ble målt ved tilstedeværelsen av pre-HRM PCR-produkt i HRM analyse og ved nærværet av et enkelt bånd på en 1,5% agarosegel [33]. I dette settet, alle prøvene ble toveis sekvensert.
HRM Kurve Analyse
Prøver ble amplifisert i 96-brønners plater, og HRM kurver overtakelse ble utført på en prototyp versjon av HRM instrumentet , LightScanner ™, bruker LCGreen® Plus + Dye (Idaho Technology, Salt Lake City, Utah). Avhengig av analysen kombinasjonen på platen, ble HRM området satt til å betjene hver analyse enkelt profil med minst 4 ° C før den første smelteovergang på plate, med en helning på 0,3 ° C /s, og minst 3 grader etter siste fragmentet er helt smeltet.
Siden HRM ble utført i denne studien som screening teknologi, ble kurvene analysert ved hjelp av tilpassede LightScanner ™ programvare (Idaho Technology, Salt Lake City, Utah). Normalisering og bakgrunn subtraksjon ble først utført ved å montere en eksponensiell til bakgrunnen som omgir HRM overganger av interesse. De normaliserte HRM kurvene var temperatur-kledde, for å eliminere små temperaturfeil mellom brønner eller løper. Differanse plott av disse normaliserte og temperatur-kledde kurver ble oppnådd ved å ta differansen fluorescens av hver kurve fra den gjennomsnittlige villtype-kurve for enhver temperaturpunkter [13], [14]. HRM kurver med en tomt tolket av programvaren til å være forskjellig fra den gjennomsnittlige villtype kurve ble ansett for å være skeptisk til å huse en nukleotid endring eller en mutasjon /variant (figur S1). Disse analytiske metoder har blitt brukt tidligere til mutasjon skanning [34], [35].
Toveis Sequence Analysis
Toveis sekvensanalyse ble utført med primere som ble utformet ved å utvide hver oligonukleotid brukt i pre-HRM PCR med et universalsekvenseringsprimeren: M13 forover (TGTAAAACGACGGCCAGT) eller M13 revers (CAGGAAACAGCTATGACC). PCR-betingelser for sekvensanalyse ble utført i 96-brønners format med 10 ul volumer og inkludert 1 mL av amplifisert DNA fra pre-HRM PCR-reaksjon. Genomisk DNA ble benyttet kun når sekvensen reaksjonen feilet med forsterket DNA. PCR-produktene ble sekvensert ved anvendelse av en modifisert ABI Prism® BigDye Terminator-protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA). Unincorporated fargestoffer terminatorer og salter ble fjernet benytte en Sephadex G-50 (Sigma, St. Louis, MO) spin kolonner i en MultiScreen®-HV 96-brønn filterplate (Millipore, Billerica, MA). Reaksjonene ble kjørt på en ABI 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvens spor ble analysert og sammenlignet med to programvarepakker (SeqScape ™ v2.5 og Variant Reporter ™ v1.0, både fra Applied Biosystems, Foster City, CA) og gjennomgått av to uavhengige lesere [9]. Når programvaren var ute av stand til å tilpasse og montere den fremre og den omvendte sekvenser prøven ble ansett for å ha sviktet sekvensering Fremgangsmåte for hensikten med denne studien. For de parafininnstøpte analyser som ikke utføres så vel som deres frosne kolleger (spesielt eksoner fra gener
TP53 Hotell og
GATA3
), PCR forhold samt deres primere ble endret for å forbedre sekvense . Dette inkluderte generere primere som utvidet over flere av de genomiske regioner eller gli 20-30 bp opp eller ned strømmen. Men vi bemerket at de nye, konkrete analyser unnlatt å optimalisere mens teste ulike regioner vil endre formålet med studien. I sammendraget, sekvensering feilrate var 2,5% for frosne prøver og 20,0% for parafin-embedded.
nucleotide endringer oppdages ved sekvensering ble klassifisert som nye endringer eller kjente SNPs (eller enkeltnukleotidpolymorfi) hvis funnet i dbSNP, Bygg 130, fra NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), ved hjelp av Genewindow (genewindow.nci.nih.gov) [36].
Statistical Analysis
sammenhengen mellom mengden av DNA hentet fra parafin-embedded vev (nivå: ≤10 ng /mL, 11-20 ng /mL, 21-30 ng /ul og 30 ng /mL) og en vellykket pre-HRM PCR assay, målt enten ved nærværet av et enkelt fragment på agarosegel eller i nærvær av en DNA-produkt på HRM-analyse ble utført ved logistikkregresjonsanalyse. Avtale mellom 2 variabler (eller pålitelighet) ble bestemt ved en Kappa-test. Kappa-verdier mindre enn 0,40 indikerer lav sammenheng mellom 0,40 og 0,75 indikerer medium forening, og verdier større enn 0,75 indikerer høy assosiasjon mellom to tiltak. Screening egenskapene HRM og konsistensen av analysen var tiltaket ved hjelp av klassiske beregninger, for eksempel sensitivitet, spesifisitet, falske negative og positive priser, vurderer sekvense analyse som standard måling for både frosne og parafininnstøpte hentet prøver.
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Microsoft® Excel (Redmond, Washington) og R statistikkpakke (www.r-project.org/).
Resultater
Frosne prøver
mutasjon screening ble utført på 12 amplikonene for hver av 216 frosne prøvene under den innledende HRM analyse (2.592 forskjellige bestemmelser). Vi har observert 59 HRM positive prøver, 2510 HRM negative, og bare 23 av disse målingene var evaluerbare (mindre enn 1%). For de gjentatte HRM eksperimenter, 47 var positive, 156 negative, og bare 1 av 204 ble ikke evalueres. Totalt 2772 av 2796 (2592 i første HRM runde, og 204 i den andre HRM runde), eller 99,1%, eksperimenter ble evaluert for screening av mutasjoner /varianter av HRM analyse.
I den innledende runden analyse~~POS=TRUNC, 4-analyser hadde ingen mutasjon detektert:
ErbB2
exon 25, den fjerne regionen
TP53
exon 5,
GATA3
exon 5, og den proksimale delen av
GATA3
exon 6. For resten testet eksoner, mellom 1 til 9 antatte nukleotidsubstitusjoner ble oppdaget; særlig ekson 13 av
FGFR3
hadde den høyeste antall, 30. Resultatene av mutasjon screening av HRM teknologi i begge forsøk, første og gjentatt, samt validering med sekvensering av frosne prøvene er vist i tabell 2.
HRM eksperimenter ble gjentatt på alle prøvene med bevis for en antatt mutasjon på HRM kurve, og også i en undergruppe av negative prøver. Avtalen mellom den første og gjenta skjermen av HRM eksperimenter var 91%, med en kappa testverdi på 0,77, eller høyt samsvar mellom begge. Generelt HRM kurver presenteres lignende former i begge uavhengige analyser (figur S2). Flertallet av uoverensstemmelser bopel i prøver kalt unormal i startbildet og normal eller uten mutasjon, i gjenta HRM eksperiment (n = 12), som ble bekreftet ved sekvensering normal. Bare en gjentatt HRM analyse kunne ikke påvise en substitusjon nukleotid i en prøve i forhold til den første skjermen. Senere sekvensering av denne prøven oppdaget et bytte referanse GG alleler, i posisjon 7518234 av kromosom 17 (ekson 7 av genet
TP53
), av AA.
sensitivitet og spesifisitet for mutasjon /variant screening var henholdsvis 97% og 87% i forhold til toveis sekvensering, med en falsk negativ hastighet på 3%. Den totale nøyaktigheten av testen var 89% (tabell 3). Når den andre, gjentatte HRM analysen ble sammenlignet med sekvenseringsresultater, økt spesifisitet til 94%, samt nøyaktighet, 94% (kappatall på 0,82); men den feilaktig negative klassifiseringen også økes til 5%. Detaljer angående sekvenseringsresultater for mutasjoner er beskrevet i tabell 4. En falsk negativ ble påvist ved sammenligning av HRM eksperimenter med sekvensering, unnlater å detektere en endring nukleotid, fra AA til AG, både de første og gjenta skjermer. Denne varianten viste seg å være en kjent SNP i ekson 13 av
FGFR3
, rs7688609 (tabell 4). Spesielt, omfattende offentlige databaser (dbSNP og Ensembl) indikerte G som forfedrenes, referanse allel i DNA-sekvensen for dette locus, men flertallet av sekvensert prøver i vår studie, 63 av 67 (eller 94%), var homozygot for AA , og bare 6% var heterozygote for G (GA). Gitt dette misforhold på allelfrekvenser med tilgjengelige offentlige data, har vi besluttet å sekvensere alle 3 bestander av HapMap samt SNP500 befolkningen for denne amplicon (n = 366) [37], [38]. Total, allel A frekvens var 94%, og allel G frekvens var 6%. Yoruba befolkningen presenteres den høyeste G frekvens med 17%. På samme tid, sekvensert vi denne regionen for 43 tilgjengelige bakterielinje-DNA fra pasienter som lider av disse pediatriske tumorer; alle av dem var homozygote for AA. Etter sekvense alle parafininnstøpte prøvene, fant vi tilsvar allelfrekvensene.
parafininnstøpte prøvene
A260 /A280-forhold, et mål på renheten av parafin -embedded ekstrahert DNA, hadde et gjennomsnitt på 1,92 (SD = 0,45) for alle prøvene brystkreft, et gjennomsnitt på 1,82 (SD = 0,12) for endometriekreft prøver, og et gjennomsnitt på 2,0 (SD = 0,27) for eggstokkreft prøver. Det var en direkte sammenheng mellom konsentrasjonen av DNA (i ng /ul) ekstrahert fra parafininnstøpte prøver, den mengde DNA som anvendes for pre-HRM PCR, og tilstedeværelsen av et enkelt bånd i agarosegelen (p 0,001 ). Det var også en sammenheng mellom ekstraherte DNA-konsentrasjon og tilstedeværelse av en tilstrekkelig HRM kurve for analyse (p 0,001). HRM var vellykket 96% av tiden når mengden av parafin-embedded hentet DNA brukes til denne teknikken var mer enn 30 ng sammenlignet med 92% når antallet var ≤30 ng (tabell 5).
Total, 93% (2008 av 2153) av målingene av parafininnstøpte prøver med HRM analyse ble evaluert. Denne teknikken var mer vellykket når frosne DNA-prøver ble analysert enn når DNA ekstrahert fra parafininnstøpte prøvene ble anvendt, 99,1% sammenlignet med 93,3% (p 0,001).
Resultatene av mutasjonen screening ved HRM teknologi og dens validering med toveis-sekvensanalyse for parafininnstøpte prøvene er vist i tabell 6. Dessuten er en representasjon av disse resultatene er skildret i figur S3. Den samlede sensitivitet og spesifisitet for prøvene mistenkelige for mutasjon i HRM analyse var 88% og 80% henholdsvis i forhold til sekvensering, med en falsk negativ hastighet på 12% (tabell 7). Imidlertid kan en forholdsvis liten prosentandel av DNA ekstrahert fra parafininnstøpte prøvene var vanskelig å sekvens. Som vi har nevnt, ble sekvensen reaksjonen foretas ved hjelp av amplifisert DNA fra pre-HRM PCR. Ved sekvensering av en spesiell assay sviktet, ble genomisk DNA anvendt og sekvensering gjentatt. Med denne strategien kan bekreftende sekvens i frosne prøvene utføres over 97% av tiden. Dette var ikke tilfellet med DNA ekstrahert fra parafin-innleiret vev, hvor sekvensering ble oppnådd 80% av tiden ved å bruke den samme strategien. Spesielt suksessrate på DNA-sekvensering av parafin-embedded tissue var mindre enn 50% for eksoner fra gener
TP53 plakater (distal regionen ekson 5 og ekson 7) og
GATA3 product: ( proksimale delen av exon 6), som påvirker sammenligning mellom sekvensanalyse og HRM kurver. Sekvensering av disse amplikonene mislyktes i 341 av 397 reaksjoner, som utgjorde 86% av alle feilet sekvensering. Når disse mislykkede forsøk ble ekskludert fra sammenligningen mellom HRM kurver og sekvensering, økt sensitivitet til 92%, med en nøyaktighet på 80%. Parafininnstøpte sekvense detaljer er beskrevet i tabell S1. Alle nye nukleotider endringer funnet på studie prøvene ble sendt til dbSNP (build 131) og vises i tabell S2.
Diskusjoner
HRM analyse bruker LightScanner ™ representerer en moderat-throughput screening test for mutasjoner blant kandidat genomiske regioner. Sammenligningen med toveis sekvense analyse gir sterke bevis for sin nøyaktighet til tross for den lave forekomsten mutasjon /variant rente, spesielt siden utvalgte eksoner næret ingen mutasjoner. Våre resultater er konsistente med tidligere rapporter [28], [39]. Den observerte forekomsten var 39 for 2569 (eller 1,5%) mutasjon /variant for alle analyserte eksoner innenfor 216 frosne pediatriske små runde blå-celle svulster, og 67 for 1586 (eller 4,2%) mutasjon /variant for alle analysert eksoner i 180 gynekologiske faste tumorer (tabell 4 og S1, henholdsvis).
sensitivitet og spesifisitet av HRM analyse var høyere i frosne prøvene sammenlignet med parafininnstøpte prøver, med en observert sensitivitet på 97% til DNA ekstrahert fra frosne prøvene, mens det er 88% av DNA ekstrahert fra parafin-innleiret vev. Lavere ytelse av enkelte analyser når sammenligne DNA fra parafininnstøpte prøvene versus frosne prøvene er også blitt beskrevet i tidligere studier for
KRAS Hotell og
EGFR product: [12]. Disse forskjellene skyldes, i det minste i en viss grad, å sekvensere endringer i DNA knyttet til kryssbinding mellom proteiner og DNA, og inverst korrelert med antallet celler i prøvene [40], [41], [42]. Dessuten kan tilstedeværelsen av flere mutasjoner og delesjoner punkt forandre effektiviteten av analysen, muligens grunnen til lav ytelse i
TP53
assays [16], [43]. Flertallet av HRM studier utført hittil er kommet til at, med enkelte begrensninger, er dette en relativt enkel, rask og billig teknikk for å påvise genomisk variasjon i parafininnstøpte vevsprøver [43]; med overensstemmende rapporter om noen av de gener som vist på vår studie [11], [16], [40], [44]. Sine begrensninger er relatert til et lavere effektivitet på områder med delesjoner (eller insersjoner), ved deteksjon av homozygot variasjoner (i forhold til heterozigous), på spesifikke analyser, og mangelen på enighet om den optimale lengden av PCR-produkt eller en smelte-domener pr fragment [ ,,,0],12], [13], [16].
for å eliminere de små forskjeller i de reagens-komponentene mellom de endelige elueringsbuffere fra flere utvinningsplattformer og for å minimalisere variasjonen innen prøvene vår tilnærming var å utføre DNA- ekstraksjon ved hjelp av en felles utvinning plattform, betingelser og protokoll. Med optimal prøvehåndtering og standardisert DNA-ekstraksjon, er det mulig å screene parafininnstøpte prøver med høyere sensitivitet [40], [41]. Til tross for den økte fragmentering av DNA ekstrahert fra parafin-innleiret vev, er det mulig å screene en pålitelig kortere amplifiseringsprodukter opp til 250 bp i lengde. I tillegg er graden av DNA-fragmentering korrelerer med vevstype [12], [45], [46]. Suksess på begge, HRM kurve og sekvense analyser, er over 97% når 10 ng DNA brukes av frosne prøver. Men disse resultatene kunne ikke oppnås med den samme mengde av parafin-innleiret ekstraherte DNA (vellykket HRM analyse i 84%). Ved å øke mengden av renset DNA lagt til pre-HRM PCR ≤30 ng ytelsen forbedret, delvis overvinne utfordringen med sub-optimal dobbelttrådet DNA. Optimalisering av pre-HRM PCR kan også redusere redusert følsomhet, spesielt når du bruker spesielt fargestoff kjemi [46].
DNA ekstrahert fra parafininnstøpte vev var også vanskeligere å sekvensere enn DNA fra frosset vev [47], [48]. Men målet med denne studien var ikke å etablere en optimalisert protokoll for sekvensering av DNA ekstrahert fra parafin-embedded vev, men å vurdere screening egenskapene til HRM analyse. Når optimale forsøksbetingelser for HRM og sekvense analyser på de frosne prøvene ble bestemt, søkte vi dem til parafin-embedded sett, for å oppnå en rettferdig sammenligning mellom begge sett av prøver. Protokoll modifikasjoner av sekvenseringsforsøk ble beskjedent forbedre ytelsen, slik som bruk av hele genomet forsterkning [49], [50], men dette kan innføre tap av heterozygositet. Fremgangsmåte for å optimalisere sekvensering kan også inkludere alternative primere eller denaturering forhold.
Basert på disse vurderingene, våre anbefalinger for å opprettholde og kanskje øke screening egenskapene til HRM analyse for parafininnstøpte hentet prøver med en LightScanner ™ ville omfatter følgende:.
Inkludering av ≥30 ng total genomisk DNA kan øke HRM analyse suksessraten opp til 96%
Pre-HRM PCR optimalisering bør inkludere forsiktig primer utvalg for å redusere GC innhold, tilstrekkelig amplicon størrelse, og optimal glødetemperatur.
amplikonene som feilet sekvensering over 50% av tiden også gjorde det dårlig i løpet av HRM analyse. Så det kan være verdt å teste de valgte amplikonene ved å sekvensere noen prøver i begynnelsen av forsøket.
Den falske positive frekvensen av HRM analyse i parafin innebygde prøvene var ca 20%, noe som innebærer at ytterligere sekvensering er nødvendig for å forbedre nøyaktigheten i den undergruppe av prøvene med en antatt mutasjon [12]. HRM analyse på frosne prøvene kun vurdert 59 av dem unormal, for 39 med ekte mutasjon /varianter. Således ville det være nødvendig å sekvensere færre prøver for hver mutasjon. Derfor er ikke bare resultatene bedre i frosne prøver med hensyn til parafininnstøpte prøvene, men også kostnadseffektivitet.
I konklusjonen, er HRM analyse med LightScanner ™ en lovende screeningverktøy for mutasjon /variant somatisk DNA ekstrahert fra enten frosset eller parafin-embedded prøver, selv om samlede nøyaktigheten er bedre i frosne eksemplarer, sannsynligvis relatert til DNA kvalitet. Denne metoden er i stand til å påvise mutasjoner samt kjente SNPs, selv i genomiske regioner med lav mutasjon prevalens i størrelsesorden 5% eller kanskje lavere.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Representasjon av HRM kurve av
BRAF
ekson 15 fra genomisk DNA ekstrahert fra frosne prøver. Rød pil: HRM kurver med en tomt tolket av programvaren til å være skeptisk til å huse en nukleotid endring eller en mutasjon /variant. HRM ble gjentatt for alle disse prøver, og alle av dem ble sekvensert. Grønne piler: HRM kurver med minimale variasjoner med hensyn til den gjennomsnittlige villtype-kurve. Alle disse prøvene ble også sekvensert og HRM ble gjentatt. Svart pil: Alle norm HRM kurver anses å ha en villtypesekvensen.
