Abstract
Plateepitelkarsinom av livmorhalsen, svært utbredt i den tredje verden, er ofte metastatisk og behandlingsresistente med ingen standard behandling protokollen. Vårt laboratorium pioner innenfor pasient avledet orthotopic xenograft (PDOX) naken mus modell med teknikken for kirurgisk orthotopic implantasjon (SOI). I motsetning til subkutane transplantasjon pasient-avledet xenograft (PDX) modeller, PDOX modeller metastasere. Viktigst, korrelerer den metastasemønsteret til pasienten. I den foreliggende rapport beskriver vi utviklingen av en PDOX modell av HER-2-positiv kreft i livmorhalsen. Metastase etter SOI i nakne mus inkludert peritoneal formidling, levermetastaser, lungemetastase så vel som lymfeknutemetastase reflekterer den metastatiske mønster i donor pasienten. Metastase ble påvist i fire av seks nakne mus med primære svulster. Primære tumorer og metastaser i nakne mus hadde histologiske strukturer tilsvarende til den opprinnelige tumor og ble farget med et anti-HER-2-antistoff i samme mønster som pasientens kreft. Den metastatisk mønster, histologi og HER-2 svulst uttrykk for at pasienten ble dermed bevart i PDOX modell. I kontrast, subkutan transplantasjon av pasientens livmorsvulster resulterte i primær vekst, men ikke metastase
Citation. Hiroshima Y, Zhang Y, Zhang N, Maawy A, Mii S, Yamamoto M, et al. (2015) Etablering av en pasient-Avledet ortotopiske Xenotransplantat (PDOX) Modell av HER-2-positive livmorhalskreft uttrykke Clinical metastatisk mønster. PLoS ONE 10 (2): e0117417. doi: 10,1371 /journal.pone.0117417
Academic Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 21 august 2014; Godkjent: 22 desember 2014; Publisert: 17 februar 2015
Copyright: © 2015 Hiroshima et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Cancer Institute stipend tall CA CA132971 og CA142669 og JSP KAKENHI tilskuddsordninger nummer 26830081 til YH, 26462070 til IE og 24592009 til KT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Yong Zhang og Nan Zhang er ansatt i Anticancer Inc. Yukihiko Hiroshima, Mako Yamamoto, Shinji Miwa, Shuya Yano, Takashi Murakami og Robert M. Hoffman er ubetalte filialer av kreftbekjempende Inc. Sumiyuki Mii, Fuminari Uehara, Masashi Momiyama og Takashi Chishima var tidligere agenter av kreftbekjempende Inc. anticancer Inc. markedsfører dyremodeller av kreft. Det er ingen andre konkurrerende interesser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Co-forfatter, Robert M.Hoffman, er en PLoS ONE Redaksjons Styremedlem Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er verdensbasis den nest vanligste kreftformen hos kvinner med flertallet av plateepitelkarsinom (SCC) [1] som resulterer i 454,000 tilfeller og 200.000 dødsfall per år i 2010. Hyppige metastaser er bekken lymfeknuter, para-aorta lymfeknuter, lunge, ekstra lymfeknuter i bekkenet, lever og bein [2]. Omtrent 11 000 nye tilfeller og 3870 dødsfall forekommer for livmorhalskreft i USA [3]. Stage og nodal metastasering er relatert til total overlevelse [4]. Kjemoterapi narkotika brukes for livmorhalskreft er: paclitaxel, carboplatin, cisplatinaindusert, bleomycin, mitomycin-C, vinkristin og irinotecan [5]. Retinoider og interferon i kombinasjon med cytotoksisk kjemoterapi, har vist seg å være effektive [6]. Men det er ingen standard behandling av metastatisk kreft i livmorhalsen. Derfor kan en pasient-lignende musemodell for livmorhalskreft være svært nyttig.
Vårt laboratorium pioner i pasient avledet orthotopic xenograft (PDOX) naken mus modell med teknikken for kirurgisk orthotopic implantasjon (SOI) [7- 21]. I motsetning til subkutan transplantasjon pasient-avledet xenograft (PDX) modeller, PDOX modeller metastasere. Viktigst, korrelerer den metastasemønsteret til pasienten.
histologisk intakte humane tykktarm-kreftprøvene avledet kirurgisk fra pasienter som ble implantert med SOI til tykktarmen eller cecum av nakne mus. Omfattende vekst på tykktarmen i 13 av 20 tilfeller av implantert pasient colontumorer ble observert med påfølgende regional, lymfe-node, og levermetastaser, samt generell mage karsinomatose [7].
SOI av histologisk intakt bukspyttkjertelen -cancer eksemplarer til nude-mus bukspyttkjertelen, resulterte i en metastatisk mønster som ligner den kliniske mønster inkludert lokale tumorvekst, som strekker seg til magen og tolvfingertarmen, metastaser til leveren og regionale lymfeknuter, og fjernmetastaser til binyrene, membran og mediastinale lymfeknutene. En 100% take hastighet ble demonstrert for 5 tilfeller, av totalt 17 mus transplantert, 15 støttet tumorvekst. Immunhistokjemisk analyse av de transplanterte humane pankreastumorer viste et lignende mønster av uttrykk tumor-assosiert glykoprotein 72 og carcinoembryonic antigen i de transplanterte svulster og den opprinnelige kirurgisk biopsi [8].
Histologisk-intakte pasientprøver av eggstokkreft var utviklet av SOI under kapsel av naken mus eggstokk. Tumorene vokste lokalt med en etterfølgende pasient-lignende metastatisk mønster, herunder parietal peritoneum, tykktarm, omentum, og ascites [10].
Histologisk-intakt pasientens brysttumorvevet ble transplantert til melkefettpute av naken mus av SOI hvor tumorvevet ble i stor utstrekning og spredning til lungen [11].
En pasient-lignende metastatisk modell av human lungekreft konstruert ble utviklet med SOI via toraktomi i immunodefekte mus [9]. Tumorene ble transplantert inn i den venstre lungen i alle disse forsøksdyr. Den venstre lungen ble anvendt for tumorimplantasjon for 2 grunner: (1) tap av lungefunksjonen er mindre i den venstre lunge enn i høyre lunge under operasjonen. De venstre-lunge-opererte dyr overleve inngrepet bedre. (2) Den venstre lunge hos mus har en flik, slik at tumorer til lett å utvikle etter implantering [9]. Når en dårlig differensiert stor celle squamous celle pasient tumor 2268 ble implantert i venstre lunge ved SOI direkte fra kirurgi, fem av fem mus produsert lokalt dyrket svulster, i en gjennomsnittlig tid på 61 dager. Motsatte-lunge-metastaser inntraff, samt lymfeknute-metastaser. De primære tumorer og metastaser i musene opprettholdt sin storcelle-squamous celle-morfologi. Når subkutant implantert svulster vokste bare lokalt i to av fire dyr og ingen metastaser ble observert [9].
I en klinisk samsvarende studie av 20 tilfeller av magekreft som vokste i nakne mus, fem hadde kliniske levermetastaser og alle 5 tilfeller resultert i levermetastaser i nakne mus. Av de 20 tilfeller, 6 hadde klinisk peritoneal involvering av deres tumor, og av disse, 5 resulterte i peritoneal metastaser i nakne mus. Det var statistisk signifikante sammenhenger for både levermetastaser og peritoneal engasjement mellom pasienter og mus [12].
I denne rapporten beskriver vi utviklingen av en PDOX modell av HER-2-positive livmorhalskreft med metastatisk mønster som ligner på pasienten donor.
Materialer og metoder
Dyr
Kvinne atymiske (
nu /nu
) NCR hårløse mus (Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc. , San Diego, CA), 4-6 uker gamle, ble anvendt i denne studien. Mus ble oppbevart i en barriere anlegg under HEPA filtrering. Mus ble matet med Autoclaved laboratorium gnagerdiett. Alle mus kirurgiske prosedyrer og avbildning ble utført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injeksjon av en 0,02 ml løsning av 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazin maleat. Alle dyrestudier ble gjennomført med en anticancer Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) -protocol spesielt godkjent for denne studien og i samsvar med de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance Antall A3873-1.
Prøvetaking
pasienten gitt skriftlig informert samtykke og kreft prøven ble anskaffet under godkjenning av Institutional Review Board of University of California San Diego.
ortotopisk og subkutan implantasjon av avledede pasient xenograft modell av livmorhalskreft
tumorvev ble oppnådd fra HER-2-positiv kreft i livmorhalsen pasient ved kirurgi og skåret i fragmenter (3-mm
3) og transplantert subkutant i nakne mus både subkutant og orthotopically.
for orthotopic transplantasjon, ble en liten midtlinjen snitt (6- til 10-mm) gjort på nedre del av magen på musen gjennom huden og bukhinnen. Livmoren ble eksponert gjennom dette innsnitt, og en enkelt svulst-fragment (3-mm
3) ble suturert til livmorhalsen i livmoren ved hjelp av 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon, Ethicon Inc., NJ, USA). Ved fullføring, ble livmoren tilbake til magen, og snittet ble stengt i ett lag bruker 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon) [7, 13].
Tissue histologi
svulst vev ble fjernet med omgivende normalt vev ved reseksjon. Vevene ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin før seksjonering og farging. Vevssnitt (3 um) ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en etanol-serien. Hematoxylin og eosin (H Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) ved 4 ° C over natten. Bindingen av primære antistoffer ble påvist ved anvendelse av anti-kanin sekundære antistoffer og avidin /biotin /pepperrot-peroksydase-kompleks (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) i 30 minutter ved romtemperatur. De merkede antigener ble visualisert med DAB kit (DAKO Cytomation). Til slutt ble seksjonene motfarget med hematoksylin og undersøkt ved anvendelse av en BH-2 mikroskop (Olympus Corp., Tokyo, Japan) som er utstyrt med en INFINITY1 2,0 mega CMOS kamera (Lumenera Corporation, Ottawa, Canada). Alle bildene ble anskaffet ved hjelp INFINITY ANALYSE programvare (Lumenera Corporation) uten etter oppkjøpet prosessering.
Statistisk analyse
PASWStatistics 18,0 (SPSS, Inc) ble brukt for statistiske analyser. Korrelasjoner ble undersøkt ved hjelp av Fishers eksakte test. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for alle sammenligninger.
Diskusjon
The PDOX, men
Resultater og ikke PDX, modell av livmorhalskreft ligner pasientens metastatisk mønster
Etter subkutan transplantasjon i nakne mus til pasienten livmorhalstumor, forekom tumorvekst i 7 av 10 mus, men ingen metastase forekom i alle mus (tabell 1). Primære svulster vokste i seks av åtte hårløse mus etter orthotopic implantasjon og metastase vokste i fire mus (tabell 1). Metastase i naken mus inkludert peritoneal formidling, levermetastaser, lungemetastase, samt para-aorta lymfeknutemetastase) (Fig. 1) (tabell 2). Pasienten hadde metastaser i para-aorta lymfeknuter, peritoneum, lever og messentary. Derfor PDOX modellen etterlignet pasientenes svulster metastatisk mønster og subkutan PDX modellen hadde ingen metastaser. Veksttakten av primærtumor var rask, dobling i 10-15 dager i løpet av 36-dagers vekstperioden (Fig. 2). Eksempler på størrelser og former av de forskjellige metastaser på forskjellige organer var som følger: En rund levermetastaser (8,5 mm x 8,3 mm) (Fig. 1E); to lungemetastaser (1,3 mm x 1,0 mm [ovale]; 1,1 mm x 1,1 mm [runde]) (Fig. 1F); og to para aorta lymfeknutemetastaser (4,0 mm x 2,3 mm [ovale]; 4,6 mm x 2,1 mm [oval]) (fig 1 H.). I fremtidige eksperimenter, vil vi overvåke veksten av metastaser fra livmorhalskreft ved intra så vel som ikke-invasiv bildediagnostikk [15-17].
(A) Hele kroppen avbildning av naken mus orthotopically transplantert pasientens livmorhalskreft prøven tre måneds tidligere. Buken ble oppblåst med tumoren. (B) Bilder fra laparotomi. Den store primærtumor ble smeltet sammen med peritonealt-spres svulster (gule piler). Engorged nodule i leveren er en levermetastaser (blå piler). Peritoneal formidling ble påvist i subfreniske plass (hvite piler). (C) Bilde Thoracotomi. To hvite knuter ble detektert i den nedre flik av høyre lunge (svarte piler). (D) skåret eksemplarer av primærtumor. Den primære svulsten ble smeltet sammen med peritonealt-spres svulster. (E) spaltet levermetastaser prøver. Øvre høyre innfelt viser snittflaten av svulst. (F) spaltet lungemetastase prøver. To hvite knuter ble påvist i nedre flik av høyre lunge (svarte piler). (G og H) Bilder av en naken mus utvikler para-aortic lymfeknutemetastase. Den primære svulst omsluttet blæren (gule piler). Etter fjerning av den primære tumor, kan para-aorta lymfeknutemetastaser bli detektert (sorte piler). SP: milt, STM: mage, SMI: tynntarm, Eso: spiserør, KD: nyre. Skala barer, 10 mm
Svulsten diameter ble målt med calipers og volum beregnes ved hjelp av følgende formel:.. 4 /3π ● (d /2)
2 ● D /2
Histologi av den opprinnelige svulsten er bevart i musen
ark-lignende vekst uten kjertel formasjon og stromal vev med fibroblastisk spredning, som trengte inn i reirene til karsinom ble observert i H E farget deler av den opprinnelige tumor (fig. 3A). Oval til spindel-formet kreftceller med høy kjernefysiske /cytoplasma ratio ble funnet i høye forstørrelse bilder (fig. 3B). I De immun seksjoner med anti-HER-2-antistoff, ble membranen og cytoplasma av kreftceller sterkt farget, men ingen farging ble funnet i det stromale vev (Fig. 3C og 3D). Alle mus-vokst livmorhalskreftpasient svulst inkludert metastatiske svulster hadde histologiske strukturer som ligner på den opprinnelige svulsten og ble farget av anti-human HER-2 antistoff (Fig. 3E-3H), noe som tyder på at modellen rekapitulerer de biologiske atferd av den opprinnelige svulst.
En PDOX modell av HER-2-positive metastatisk kreft i livmorhalsen, som viser metastatisk oppførsel hele musen kroppen, inkludert lever, lymfe-noder, lunge, bukhinne, har ikke tidligere blitt rapportert. Mer viktig, metastasen mønster av PDOX tumor etterlignet den av pasienten. Vi videre viste at mus-vokst svulster rekapitulere tegnet av den opprinnelige pasienten svulsten ved å undersøke uttrykket status av HER-2. I denne studien, viser vi at primærsvulster og metastaser dyrket i mus ble farget av anti-HER-2 antistoff og rekapitulert histologiske strukturer i den opprinnelige svulsten (fig. 2). Forekomsten av HER-2 positivitet i livmorhalskreft ble rapportert fra 1% til 21% [22], og overekspresjon av HER-2 har vært forbundet med mer avanserte stadier og en dårligere prognose [23, 24].
(A) H E-fargede delen av den opprinnelige pasientens tumor. (B) høy forstørrelse bilde av (A). (C) immunostained delen av den opprinnelige pasientens tumor ved anvendelse av anti-HER-2-antistoff. (D) Høy forstørrelse bilde av (C). (E-H) H E-farget og immunostained deler av mus-vokst svulster. De øvre paneler er H & Co. E-fargede seksjoner og nedre paneler er immunostained seksjoner ved hjelp av et anti-HER-2-antistoff. Høyre øvre innfellinger er høy forstørrelse bilder (skala barer: 25 mikrometer) og innfellinger mellom over- og underpanelet er bilder av svulster (skala barer: 10 mm). Alle mus dyrket tumorer, inkludert subkutane tumorer (E), primær tumor ortotopisk (F), peritoneal-disseminert metastasering (G) og levermetastaser (H) hadde histologiske strukturer tilsvarende til den opprinnelige pasientens tumor og ble farget med et anti- HER-2-antistoff. Skala barer: 200 mikrometer (A, C, E-H) og 25 mikrometer (B og D)
PDOX modell av livmorhalskreft som er beskrevet i denne rapporten kan ha flere bruksområder. For eksempel vi har nylig brukt en PDOX naken musemodell for bukspyttkjertelkreft og tykktarmskreft å utvikle teknikker for fluorescens styrt kirurgi [25-27]. En kreft i bukspyttkjertelen PDOX naken musemodell ble brukt for å evaluere effekten av svulst målretting
Salmonella typhimurium product: (
S
.
typhimurium
) A1-R belastning vi utvikler .
S
.
typhimurium
A1-R betydelig redusert tumorvekst sammenlignet med ubehandlet kontroll [28].
S
.
typhimurium
A1-R, i kombinasjon med anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) behandling med bevacizumab (BEV), var aktiv i bukspyttkjertelkreft PDOX [29].
Vi har også tidligere demonstrert zoledronsyre (A) er aktiv på bukspyttkjertelkreft i en PDOX modell på primære og metastatisk vekst [30].
Dermed pasient hermet PDOX modell av livmorhalskreft som er beskrevet i denne rapporten presenterer mange muligheter for oppdagelsen av nye effektive behandlingsformer for denne tiden behandlingsresistent sykdom. Etter oppdagelsen av mer effektive behandlingsformer, kan PDOX modell av livmorhalskreft være mer nyttig for individuell pasientbehandling. Denne rapporten understreker også de kritiske fordelene ved PDOX modellen over subkutan PDX modell [31-34].
Takk
Denne artikkelen er dedikert til minne om AR Moossa, MD
