Abstract
Bakgrunn
Radiofrekvensablasjon (RFA) er en av de kurative terapi for hepatocellulært karsinom (HCC), imidlertid akselerert progresjon av gjenværende HCC etter ufullstendig RFA er rapportert oftere. Den underliggende molekylære mekanisme av dette fenomen er ikke klarlagt. I denne studien brukte vi en ufullstendig RFA orthotopic HCC naken mus modell for å studere invasiv og metastatisk potensial rest kreft samt korrelerte mekanisme.
Metoder
ufullstendig RFA orthotopic naken mus modeller ble etablert ved hjelp av høy metastatisk potensial HCC cellelinje HCCLM3 og lav metastatisk potensial HCC cellelinje HepG2 hhv. Endringene i mobilnettet morfologi, motilitet, metastaser og epitelial-mesenchymale overgang (EMT), og HCC celle molekylære markører etter
in vitro Hotell og
in vivo
ble observert ufullstendig RFA intervensjon.
Resultater
Lunge og intraperitoneal metastaser ble observert i en
in vivo
studien. Den underliggende pro-invasiv mekanisme av ufullstendig RFA syntes å være forbundet med å fremme EMT, inkludert nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og vimentin. Disse resultatene var i samsvar med
in vitro
reaksjon av HCC celler til å varme intervensjon. Videre studier vist at β-catenin var en avgjørende faktor i dette kurset og blokkering β-catenin redusert metastase og EMT fenotype endringer i varmebehandlede HCCLM3 celler
in vitro
.
Konklusjon
Ufullstendig RFA forbedret invasiv og metastatisk potensial rest kreft, følger med EMT-lignende fenotype endringer ved å aktivere β-catenin signalisering i HCCLM3 celler
Citation. Zhang N, Wang L, Chai ZT, Zhu ZM, Zhu XD, Ma DN, et al. (2014) Ufullstendig Radiobølgeablasjon Forbedrer Invasivitet og metastasering av Residual Kreft leverkreft Cell HCCLM3 via Aktivering β-catenin signale. PLoS ONE 9 (12): e115949. doi: 10,1371 /journal.pone.0115949
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 14 juni 2014; Godkjent: 27 november 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (stipend nummer: 81372314).; Shanghai Natural Science Fund for Youth Scholars (12ZR1442300); National Key Project for smittsomme sykdommer (2012ZX10002012-004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen i verden og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1]. Selv kirurgisk reseksjon er standard behandling modalitet for HCC, er bruken vanligvis begrenset fordi flertallet av pasientene, selv med liten HCC, har knyttet alvorlig nedsatt leverfunksjon [2], [3]. Levertransplantasjon tilveiebringer en alternativ behandling for liten unresectable HCC har imidlertid den mangel av levertransplantater begrenser anvendbarheten av denne tilnærmingen [4]. På grunn av disse omstendigheter, har flere ikke-kirurgiske teknikker har blitt introdusert for HCC behandling, slik som radiofrekvens ablasjon (RFA), perkutan injeksjon etanol (PEI) og mikrobølge koagulering terapi (MCT) [5], [6]. Blant disse teknikkene, er RFA i dag den mest brukte behandlingsalternativ på grunn av sin enkelhet, sikkerhet, minimal invasivitet, repeterbarhet og kortere sykehusopphold [4]. RFA regnes som det beste alternativet for unresectable HCC hos pasienter med ikke mer enn tre lever knuter, maksimalt 3 cm diameter tumor, og med bevart leverfunksjon (Child-Pugh A og B) [7], [8]. Men en av de store utfordringene med RFA er rest svulstvev og lokalt tilbakefall etter lokalbehandling, ble det rapportert at de etter RFA tilbakevendende priser varierer 49-74% [9] – [11]. Videre er den lokale tilbakevendende tumor etter RFA viste en mer invasive vekst, mer vaskulær invasjon og mindre differensiering sammenlignet med tumorer i pasienter uten RFA [12].
Wnt /β-catenin reaksjonsvei er en viktig signalveien i HCC [13], [14]. Det har blitt rapportert at en tredjedel av HCC er forbundet med avvikende ekspresjon av β-catenin [15]. β-catenin (CTNNB1), er en sentral molekyl i Wnt signalveien, og er et multifunksjonelt protein som er involvert i celle-celle-adhesjon, signaltransduksjon, cellulær differensiering og proliferasjon regulering. Vårt team hadde bevist at hypoksi kan indusere β-catenin overekspresjon og /eller intracellulær akkumulering i fire HCC cellelinjer gjennom nedregulering av endogene degradering maskiner, og hypoksi kan også forbedret invasivitet
in vitro Hotell og metastase
in vivo
for Hep3B og MHCC97 celler [16]. Mutasjoner i Wnt /β-catenin pathway medlemmer også føre til avvikende aktivering av målgener, inkludert de som koder for aktivatorer av epitel-mesenchymale overgang (EMT) [17]. EMT spiller en sentral rolle i de kritiske faser av fosterutviklingen og bidrar til fysiologiske prosesser, for eksempel vev reparasjon, regenerering og patologiske tilstander, inkludert kreftutvikling og fibrose. I tillegg er det også deltar i intrahepatisk formidling og fjernmetastaser under HCC progresjon [18] – [21]. β-catenin spiller en avgjørende rolle i utbruddet og progresjon av EMT. Flere studier har vist at forholdet mellom β-catenin signalering og EMT [22]. Oh et al. rapportert at β-catenin aktivering forårsaket induksjon av sneglen og ZEB1 uttrykk, mesenchymale celle markør uttrykk og undertrykkelse av E-cadherin uttrykk i enkelte epitelceller i patogenesen av adenomyosis [23]. Zhao et al. forutsatt bevis på at Wnt /β-catenin signalveien er direkte involvert i EMT indusert av HIF-1α, og blokkerer Wnt /β-catenin signalveien forårsaket reversering av EMT og metastatisk fenotyper endringer [24]. Imidlertid er rollen til β-catenin i rest kreft etter ufullstendig RFA fortsatt uklart. I denne studien ble det observert at ufullstendig RFA forbedret invasive og metastatiske potensiale av rest kreft, og undersøkt forandringer i β-catenin ekspresjon i ufullstendig RFA tumorvev
in vivo
og i varmebehandlede HCC celler
in vitro
. Videre vurderes vi dens betydning i metastatisk fenotype endringer indusert av varme intervensjon.
Materialer og metoder
Cell Kultur og dyr
HCCLM3 celler med høy metastatisk potensial og HCCLM3-G cellene som var HCCLM3 celler transfektert med grønn fluorescens protein, HepG2-celler med lavt metastatisk potensiale og HepG2-G-celler, som ble HepG2 celler transfektert med grønn fluorescens-protein, ble anvendt i
in vitro
og
in vivo
eksperimenter, henholdsvis (etablert i leveren Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina) [25]. Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 100 U /ml penicillin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Mann BALB /c nu /nu mus, veier 18-20 g ved 4-6 ukers alder, ble hentet fra SLAC Laboratory Animal Co, Ltd, Shanghai, Kina. Alle mus ble opprettholdt under spesifikke patogen frie betingelser. Alle dyr protokoller ble godkjent av etisk komité for Animal Experiments av Animal Care komité Fudan University. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelsene til forsøksdyr (S1 sjekkliste).
Utstyr og Etablering av Incomplete RFA ortotopiske Nude Mouse Model
Hoved utstyr som brukes besto av RITA medisinske system modell 1500X RF generator (RITA Medical Systems, Fremont, CA, USA), uttrekkbar flere krok RFA nål (S1 A fig.) (RITA stjerne Burst XL, Angio-Dynamics, Latham, NY, USA), og Rita jording pads (Angio-Dynamics) .
Den menneskelige HCC ortotopiske naken musemodeller med HCCLM3-G celler og HepG2-G celler ble etablert som tidligere beskrevet [26]. De nakne mus ble tilfeldig delt inn i ufullstendig RFA gruppen (n = 12) og kontrollgruppen (n = 12). To uker etter ortotopisk implantering, ble ufullstendig RFA utført som følger: etter anestesi ved Pelltobarbitalum Natricum med administrert ved intraperitoneal injeksjon (50 mg /kg), ble dyret plassert på en ledende metallplate med lemmene fast og RITA jording Lappene ble overholdt til baksiden av denne metallplate for å sikre god elektrisk ledningsevne. Deretter ble magen hulrommet i mus åpnet og utsatt ortotopisk tumor i venstre leverlapp (S1B, C fig.). Senteret rett en av RITA nål ble satt inn i xenograft og fysiologisk saltvann ble dryppet på stikkstedet for å holde god ledningsevne. Med tanke på vekt og volum av nakne mus, ble RFA utført med en lavere energi-protokoll, med en kraft ut av 5W og varighet av ca. 30 sekunder for å holde eksistensen av gjenværende kreft. Etter RFA, ble magen hulrommet i mus lukket ved hjelp av 5-0 ikke-absorberbare suturer. Musene i kontrollgruppen var humbug-opererte på ved å sette inn en RFA nål inn i svulsten uten å utføre ablasjon.
Parametere Vurderes
Tre uker etter RFA prosedyren, seks mus i hver gruppe ble ofret for å vurdere tumorvekst og metastasering. Den lengste (a) og korteste (b) tumor diameteren ble målt, og tumorvolumet ble beregnet som følger: Tumorvolum (mm
3) = a (mm) x b (mm) x b (mm) /2 [ ,,,0],27]. Lungene ble skåret ut og bildene for grønt fluorescerende protein (GFP) -positive metastatiske foci ble oppnådd (stereomikroskop, Leica, Wetzlar, Tyskland). De lungevev ble seksjonert i serie og H anti-kanin FITC og /eller tetrametylrhodamin isotiocyanat-konjugert sekundære antistoffer (Invitrogen). De fluoriserende bildene ble tatt ved hjelp av en konfokal mikroskop (Olympus).
Transient Transfeksjon av siRNAs
For ytterligere å undersøke den funksjonelle rollen β-catenin i varme-indusert ondartet oppførselen HCCLM3 celler, forbigående transfeksjon ble utført i HCCLM3 celler med små interfererende RNA (siRNA) rettet mot CTNNB1 mRNA (siCTTNB1, Gene Parma, Shanghai, Kina) eller håne transfeksjon (Gene Parma). -Celler ble transfektert med enten en kontroll eller et siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i OPRI-MEM medium (Gibco) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensen av β-catenin siRNA var: 5’GGGUUCAGAUGAUAUAAAUTT3 «
Sanntids Kvantitativ Reverse Transcription-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
RT-PCR prosedyrer som brukes ble beskrevet andre steder. [30]. Primersekvensene som brukes til å bestemme uttrykket av målgener er som følger: Snail, 5′-TGCAGGACTCTAATCCAAGTTTACC-3 «(fremover), og Snail, 5′-GTGGGATGGCTGCCAGC-3′ (bakover); Slug, 5»-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3 «(fremover), og Slug, 5′-CTGAGCCACTGTGGTCCTTG-3′ (bakover); Twist, 5»-TGTCCGCGTCCCACTAGC-3 «(fremover), og Twist, 5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGGA-3» (bakover).
Western Blot analysen
Western Blot prosedyrer som brukes er beskrevet andre steder [31]. Primære antistoffer brukt blant annet:. Anti-E-cadherin, anti-N-cadherin, anti-vimentin, anti-β-catenin, anti-Cyclin-D1 (Abcam) og anti-β-aktin (BOOSTER, Wuhan, Kina)
Immunohistochemistry
svulstvev ble fikset, forankret og skiver i 5 mikrometer tykke seksjoner. Immunhistokjemi farging av E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-catenin ble utført som beskrevet tidligere [30]. Farging Resultatene ble evaluert under et lysmikroskop ved en forstørrelse på × 200.
Statistical Analysis
statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av Student
t
test når data ble normalfordelt eller de parametriske analyser av Mann-Whitney U-test når data ble ikke normalfordelt. Beregningene ble gjort ved hjelp av SPSS 20.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Resultatene ble ansett som statistisk signifikant på
p
verdi. 0,05
Resultater
Heat intervensjon fremmet spredning, invasjon og migrasjon av HCC celle
in vitro
En
in vitro
proliferasjonsanalyse viste at de varmebehandlede HCC celler hadde signifikant større spredning enn det i kontroll (fig. 1A), spesielt ved 45 ° C i HCCLM3 celle og 47 ° C i HepG2-celle. I det cellemigrering assay alle varmebehandlede HCCLM3 celler oppviste betydelig høyere migrasjon potensial enn i kontrollgruppen. (33,40 ± 2,16, 45,00 ± 3,21, 86,20 ± 3,39
vs.
19,00 ± 2,00), de HepG2 celler behandlet med 44 ° C og 47 ° C viste høyere migrasjonspotensialet enn i kontroll (18,00 ± 1,52, 33.80 ± 2.63
vs.
11,60 ± 1,07) (fig. 1B). I celle invasjon analysen, er HCCLM3 cellene behandlet med 42 ° C og 45 ° C viste den forbedrede invasiv evne (18,40 ± 0,87, 29,00 ± 1,82
vs.
5,60 ± 1,03), er HepG2-celler ble behandlet med 44 ° C og 47 ° C, oppviste betydelig høyere invasive egenskaper (12,20 ± 1,56, 19,40 ± 1,50
vs.
2,80 ± 0,67) (fig. 1B).
(A) HCCLM3 og HepG2-cellene ble dyrket med eller uten varme intervensjon. 24 h, 48 h og 72 h cellelevedyktighet HCC celler ble målt under anvendelse av CCK8 assay. Heat intervensjon betydelig forfremmet HCCLM3 og HepG2 celler spredning. (B) Den transwell analysen viste at varmebehandlede HCCLM3 og HepG2 celler viste forbedret migrasjon og invasjon evne sammenlignet med kontrollene.
Heat intervensjon overfører mesenchymale egenskaper til HCC celler
in vitro
de varme-behandlede HCC celler kan også få en EMT-lignende fenotype, morfologisk de HCCLM3 celler og HepG2-celler ved 48 timer etter varme intervensjon på 45 ° C og 47 ° C, respektivt, viste uregelmessig fibroblast-lignende form i stedet for en typisk epitelial brostein utseende (fig. 2A). I mellomtiden, western blot (Fig. 2B) og immunofluorescens-farging (fig. 2C) viste en reduksjon i ekspresjonen av epitel cellemarkør E-cadherin i disse varmebehandlede celler, sammenlignet med kontrollcellene. På samme tid, ble forsterket uttrykking av mesenchymale cellemarkører N-cadherin og vimentin også påvist. I tillegg ble mRNA uttrykk for EMT transkripsjonsfaktorer (sneglen, Slug og Twist) oppdaget av RT-PCR. Amplifikasjon av snegle mRNA i varmebehandlede HCCLM3 celler og Slug mRNA i varmebehandlede HepG2-celler ble statistisk høyere enn for kontrollen (fig. 2D).
(A) HCCLM3 celler og HepG2-celler ble dyrket etter 45 ° C og 47 ° C varme inngrep, henholdsvis. Morfologiske forandringer i samsvar med EMT (spindelformede celler med tap av polaritet og øker intracellulære separasjon) ble observert i varmebehandlede HCC celler i 48 timer, sammenlignet med dem i kontroll. (B) Western Blot analyse viste ekspresjon av E-cadherin, N-cadherin, vimentin i varmebehandlede HCC celler og i kontrollene. HCCLM3 celler og HepG2-celler ble dyrket i 48 timer etter 45 ° C og 47 ° C varme inngrep, henholdsvis. Immunfluorescens farging (C) viste at forandringer i cellulære EMT markører som respons på varme intervensjon som kjennetegnes ved nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og vimentin, sammenlignet med kontroller. RT-PCR (D) viste at mRNA uttrykk for EMT relatert transkripsjon faktorer Snail, Slug, og Twist i HCC celler.
Ufullstendig RFA hemmet tumorvekst, men fremmet invasivitet og fjernmetastaser
i vivo
Vi har utviklet en trygg og pålitelig metode for å etablere en ufullstendig RFA orthotopic naken mus modell og denne dyremodell kan være det første rapporterte ufullstendig RFA orthotopic naken mus modell i henhold til litteraturen i PubMed. I ufullstendig RFA gruppe, tumorstørrelsen av HCCLM3-G og HepG2-G-modellen var 449.58 ± 143,19 mm
3 og 299.83 ± 131.45 mm
3, respektivt, som var mindre enn de av styreenheten (1788,75 ± 248.53 mm
3 i HCCLM3-G og 942.67 ± 144,16 mm
3 i HepG2-G,
P
. 0,05) (figur 3A). Lunge-metastasering satsen i ufullstendig RFA gruppen av HCCLM3-G (6/6) var høyere enn i kontrollgruppen (2/6) (Fig. 3B). For evaluering av metastatisk potensial av gjenværende kreft i HCCLM3-G etter ufullstendig RFA, ble serielungeparafinsnitt brukt. Lungemetastaser i ufullstendig RFA gruppe ble betydelig økt, sammenlignet med kontrollgruppen (29,67 ± 2,56
vs
2,50 ± 1,58,
P
. 0,001) (Fig. 3C). På den annen side ble lungemetastase ikke påvist i HepG2-G-modell, uavhengig av RFA å motta eller ikke (S2 fig.), Men ufullstendig RFA kunne indusere peritoneal metastase (6/6), og ingen peritoneal metastase ble iakttatt i kontroll gruppe (0/0) (figur 3D).
(A) i ortotopisk modell HCC, tumorstørrelser i ufullstendig RFA gruppen var mindre enn de i kontroll (HCCLM-G.: 449,58 ± 143,19
vs
1788,75 ± 248,53,
P
= 0,002; HepG2-G: 299,83 ± 131,45
vs
942,67 ± 144,16,
P
= 0,008) . (B) Kvantifisering av bioluminesens viste at ufullstendig RFA akselerert lungemetastaser i HCCLM3-G xenografter, sammenlignet med matchede kontroller (piler indikerer lungemetastaser). Tre svulster fra kontroller og tre ufullstendige RFA behandlede tumorer ble sammenlignet med både lysfelt (b) og fluorescens (f). Forekomsten av lungemetastaser (6/6) ble øket i ufullstendig RFA gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (2/6). (C) H E farging bekreftet at ufullstendig RFA indusert mer lungemetastaser i HCCLM3-G xenografter (29,67 ± 2,56
vs
2,50 ± 1,58,
P
. 0,001). (D) Kvantifisering av bioluminesens viste at ufullstendig RFA kan indusere intraperitoneal metastaser i HepG2-G xenografter (6/6), sammenlignet med matchede kontroller (0/6) (piler indikerer intraperitoneale metastaser).
ufullstendig RFA induserte endringer i samsvar med EMT i HCC xenotransplantater
Immunhistokjemi oppviste den typiske membran E-cadherin ekspresjon i celle-celle-kontakter i kontrollgruppe av HCCLM3-G, i motsetning, ufullstendige RFA-behandlede tumorer viste reduksjon av E-cadherin ekspresjon, så vel som opp-regulering av N-cadherin og vimentin. I HepG2-G-modellen, ble den nedregulering av E-cadherin ekspresjon og oppregulering av N-cadherin ekspresjon observeres også i ufullstendig RFA gruppe (Fig. 4A). Induksjon av EMT ved ufullstendig RFA ble demonstrert i xenograft tumorer i begge cellelinjer ved western blot, og ble karakterisert ved tapet av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og vimentin i tumorvev fra ufullstendig RFA gruppe (fig. 4B). Dessuten ble den forbedrede mRNA ekspresjon av EMT transkripsjonsfaktor sneglen og Slug undersøkt ved hjelp av RT-PCR i HCCLM3-G-avledet og HepG2-G-avledede xenotransplantater, henholdsvis (fig. 4C).
(A) Immunhistokjemi viste at E-cadherin ekspresjon ble redusert i ufullstendig RFA gruppe av begge HCC cellemodeller, ekspresjonsnivået av N-cadherin i tumorvev var høyere i ufullstendig RFA gruppe enn i kontrollene, og i HCCLM3-G-modell, økt ekspresjon av vimentin Det ble også påvist i ufullstendig RFA gruppe. (B) Western blot viste endringene av rest tumorer var i overensstemmelse med EMT i ufullstendig RFA gruppe (f.eks nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin, vimentin) av begge HCC cellemodeller. (C) RT-PCR viste ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer snegle, Slug, og vri på mRNA-nivå i tumorvevet. Men bare Snail mRNA i HCCLM3-G modell og Slug mRNA i HepG2-G-modellen var signifikant oppregulert i ufullstendig RFA gruppe, henholdsvis (
P
0,05).
Ufullstendig RFA indusert β-catenin aktive akkompagnert med EMT
in vivo Hotell og
in vitro
av HCCLM3
for å utforske de molekylære mekanismene som er involvert i EMT varmebehandlet HCC celler, forsøkte vi å teste om β-catenin signal ble aktivert. I HCCLM3-G-modell, immunohistokjemi farging viste en betydelig forbedret intracellulær akkumulering av β-catenin i ufullstendig RFA-behandlede tumor, men ikke i HepG2-G-modellen (Fig. 5A). Disse resultatene var i samsvar med den β-catenin protein ekspresjon i ufullstendig RFA gruppen og kontrollgruppen ved western blot (Fig. 5B). Opphopning av cytoplasma og kjernefysisk β-catenin er en indikasjon på aktivert β-catenin-avhengige signalering, så vi videre undersøke om økt β-catenin uttrykk påvirket β-catenin pathway aktivitet. Immunfluorescens farging viste økt ekspresjon av β-catenin både i cytoplasma og cellekjernen av de varmebehandlede HCCLM3-celler, sammenlignet med kontrollceller
in vitro
imidlertid den samme trend i de varmebehandlede HepG2-celler var ikke observert (fig. 5C). I tillegg ble en markert intracellulær translokasjon av β-catenin de varmebehandlede HCCLM3 celler bekreftet ved western blot-analyse (fig. 5D). For å undersøke effekten av varme intervensjon å indusere nukleær translokasjon av β-catenin på genekspresjon, viste vi hensyn til β-catenin signalveien nedstrøms målgenet Cyclin-D1. Western blot viste at ekspresjonen av Cyclin D1 ble også øket med total β-catenin overekspresjon i de varmebehandlede celler HCCLM3
in vitro plakater (fig. 5E).
(A) Immunhistokjemi viste at β-catenin uttrykk ble økt i ufullstendig RFA gruppe HCCLM3-G xenografter (
P
= 0,002); i HepG2-G xenografter, var det ingen signifikant forskjell mellom to grupper i β-catenin uttrykk (
P
= 0,843). (B) Western blot viste forbedret β-catenin uttrykk i tumorvev etter ufullstendig RFA sammenlignet med kontrollene av HCCLM3-G xenografter. (C) Immunofluorescens farging viste sterk cytoplasmisk og nukleær lokalisering av β-catenin i varmebehandlede HCCLM3-celler, og den typiske membran β-catenin ekspresjon i celle-celle-kontakter av HCCLM3 celler i kontrollen. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom gruppene i β-catenin ekspresjon av HepG2-celler. (D) Fordeling av β-catenin i cytoplasma og kjernen av HCCLM3 celler ble oppdaget av western blot
in vitro
. (E) Western blot analyse viste uttrykk for total β-catenin og dens nedstrøms målet genet Cyclin-D1 av begge to HCC celler
in vitro
.
Den forbedrede invasjonen potensial og EMT-lignende endringer av varmebehandlede HCCLM3 celler kan delvis oppveid av stanse β-catenin
in vitro
for ytterligere å belyse om aktivering av β-catenin ble funksjonelt forbundet med økt invasivitet og EMT-lignende endringer i varmebehandlede HCCLM3 celler, brukte vi CTNNB1 siRNA transfeksjon og undersøkt dens virkning på HCCLM3 celler. For å sjekke effekten av transfeksjon ble immunfluorescens farging og western blot brukes. Som vist på fig. 6A, typisk cellemembranen ekspresjon av β-catenin ble redusert etter transfeksjon, og det totale β-catenin protein ble redusert i HCCLM3-siCTNNB1-celler, sammenlignet med kontrollen av HCCLM3-mock-celler (Fig. 6B). Som vist på fig. 6C, under normale forhold, forskjellen i gjennomtrengende celletall mellom HCCLM3-mock-celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler var ikke statistisk signifikante. Imidlertid, etter innføringen av varme intervensjon, antallet HCCLM3-siCTNNB1-celler i både migrering og invasjon matrise matrise var mindre enn de i HCCLM3-mock-celler (Fig. 6C). Videre kan stanse av CTNNB1 påvirker ekspresjonen av EMT transkripsjonsfaktor, RT-PCR avslørte at ekspresjonen av sneglen mRNA fra varmebehandlede HCCLM3-siCTNNB1-celler ble redusert, sammenlignet med motstykke i varmebehandlede HCCLM3-mock-celler (Fig . 6D). Western blot-analyse bekreftet også at undertrykkelse av β-catenin påvirket ekspresjonen av β-catenin-mediert EMT markører i varmebehandlede HCCLM3 celler, og ekspresjon av Cyclin D1 ble også svekket (fig. 6E). Kollektivt, de ovennevnte funn vist at aktivering av β-catenin var funksjonelt relevant for invasjon og metastasering av HCCLM3 celler mediert av varme intervensjon.
(A) immunfluorescens farging indikerte at β-catenin uttrykk ble delvis oppveid av kneble av CTNNB1 i HCCLM3 celler. (B) Protein nivåene av β-catenin, målt ved western blot-analyse etter siCTNNB1 transfeksjon. (C) Representative bilder av migrasjon og invasjon av HCCLM3-mock celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler i transwell analysen. HCCLM3-mock celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler dyrket 48 timer etter 45 ° C varme intervensjon og normal tilstand, henholdsvis RT-PCR (D) viste relativ mRNA uttrykk av transkripsjonsfaktorene Snail, Slug, og Twist. Western blot (E) viste uttrykk for EMT relatert transkripsjonsfaktorer og Cyclin-D1.
Diskusjoner
I dag, et økende antall kliniske studier har identifisert den raske utviklingen av rest kreft etter ufullstendig RFA ved behandling av HCC [32], [33]. Tidligere undersøkelser hadde gitt flere mulige mekanismer som kan forklare disse funnene. Hypertermi kan spille en viktig rolle i den raske veksten av rest HCC etter RFA ved å fremme angiogenese av rest HCC via HIF-1a /VEGFA [34]. En annen studie viste at suboptimal RFA akselerert HCC vekst og spredning av forbigående indusere en EMT-aktig og mer aggressiv cellulær fenotype [35]. I denne studien, introduserte vi RFA inn en orthotopic naken mus HCC modell og demonstrerte betydningen av ufullstendig RFA behandling på tumorvekst og invasivitet. Selv om xenograft tumorvolumer ble redusert etter ufullstendig RFA behandling, de gjenværende tumorene viste mer invasive egenskaper i ufullstendig RFA-behandlede mus, som indikert ved økt lungemetastase eller intraperitoneal. På den annen side,
in vitro
varmebehandlede HCC celler oppviste økt bevegelighet og invasivitet. Disse funnene var i samsvar med resultatene fra tidligere undersøkelser ved hjelp av andre dyr cancermodeller. I en translatorisk murin modell, Kroeze et al. identifisert som ufullstendig termisk ablasjon stimulert spredning av restnyrekreft celler [36]. Ke et al. funnet rester av lever VX2 carcinoma etter ufullstendig RFA kunne lette rask progresjon i en VX2 carcinoma kanin modell, og brenn tumor volum og lungemetastaser av RFA-behandlede kaniner betydelig økt [37].
Monterings bevis hadde identifisert en signifikant korrelasjon mellom EMT og invasivitet i forskjellige typer av tumor [38] – [40]. Heri vi viste at varmen intervensjon stimulert transformasjon av HCC celler fra en typisk epitelial fenotype til en spindel-formet mesenchymale fenotype, ledsaget av nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og vimentin. Ytterligere bevis levert av transplantater i hårløse mus etter ufullstendig RFA var at proteinnivået endringer av disse EMT markører ble også påvist. Videre har vi også undersøkt oppregulert EMT transkripsjonsfaktorer i ufullstendige RFA svulster og i varmebehandlede HCC celler. Disse funnene kombinert med resultatene fra tidligere undersøkelser som er nevnt ovenfor, ytterligere identifisert som «cadherin bryter» av tumorvev kan utløses av ufullstendig RFA som fører til økt metastasepotensialet.
For fullt ut å forstå den molekylære mekanisme for forholdet mellom varme inngrep og endringer av celle fenotype, fokuserte vi vår oppmerksomhet på β-catenin. Som en sentral faktor i Wnt signalreaksjonsveien spiller β-catenin en viktig rolle i progresjon HCC, utvikling, fenotype endringer og karsinogenese. β-catenin mutasjon er en faktor som kan være kritisk for utvikling av HCC. Mutasjoner som involverer Wnt /β-catenin vei synes å være en av de hyppigste genetiske hendelser som bidrar til leveren kreftutvikling og progresjon [41]. Feilregulering av β-catenin kan fremme kreftutvikling; mus heterozygote for LKB1 sletting viste en akselerert progresjon til HCC når parret med adenovirus-induserbar p-catenin mutante mus [42]. I mellomtiden, noen rapporter hadde implisert at β-catenin mutasjon var en ganske vanlig mekanisme for mus hepatocellulære svulster, inkludert adenomer og karsinomer [43]. På den annen side har korrelasjonen mellom β-catenin signalveien og EMT blitt bekreftet i flere studier. Yang et al.
