Abstract
Bakgrunn
Måle messenger RNA (mRNA) nivåer ved hjelp av revers transkripsjon kvantitativ polymerase chain reaction (RT -qPCR) er vanlig praksis i mange laboratorier. En bestemt sett av mRNA som intern kontroll referanse gener er regnet som den foretrukne strategi for å normalisere RT-qPCR data. Riktig valg av referansegener er et kritisk problem, spesielt i kreftceller som er utsatt for ulike
in vitro
manipulasjoner. Disse manipulasjoner kan føre til dramatiske endringer i genuttrykk nivåer, selv med antatt referanse gener. I denne studien har vi evaluert uttrykket nivåer av 11 brukte referanse gener som interne kontroller for normalisering av 19 forsøk som inkluderer nevroblastom, T-ALL, melanom, brystkreft, ikke-småcellet lungekreft (NSCL), akutt myelogen leukemi (AML ), prostatakreft, tykktarmskreft og livmorhalskreft cellelinjer utsatt for ulike forstyrrelser.
Resultater
geNorm algoritmen i programvarepakken qbase + ble brukt til å rangere kandidat referanse gener i henhold til deres uttrykk stabilitet. Vi har observert at stabiliteten av de fleste av de kandidatreferanse genene varierer i perturbasjonsteknikker eksperimenter. Uttrykt Alu gjentar viser relativt stabilt uttrykk uavhengig av eksperimentell tilstand. Disse Alu gjentakelser er rangert blant de beste referanseanalyser i alle perturbasjonsteknikker eksperimenter og vise akseptable gjennomsnittlig uttrykk stabilitetsverdier (M 0,5).
Konklusjoner
Vi foreslår bruk av Alu gjentar som en referanse analysen når du utfører kreftcelle perturbasjonsteknikker eksperimenter
Citation. Rihani A, Van Maerken T, Pattyn F, Van Peer G, Beckers A, De Brouwer S, et al. (2013) Effektiv Alu Gjenta Basert RT-qPCR Normalisering i Cancer Cell forstyrrelse eksperimenter. PLoS ONE åtte (8): e71776. doi: 10,1371 /journal.pone.0071776
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 05.02.2013; Godkjent: 03.07.2013; Publisert: 14. august 2013
Copyright: © 2013 Rihani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ali Rihani støttes av en doktorgrad fellesskap fra Ghent universitet forskningsfond (BOF, 01D02210). Joni Van der Meulen og Evelien Mets støttes av en doktorgrad fellesskap fra Research Foundation – Flandern (FWO; 1116412N og 3G020209, henholdsvis). Anneleen Beckers er støttet av en doktorgrad fellesskap fra Institutt for fremme av innovasjon av vitenskap og teknologi i Flandern (IWT, 101506). Tom Van Maerken, Pieter MESTDAGH og Pieter Rondou støttes av postdoktorstipend fra FWO. SDB er støttet av et postdoktorstipend fra Ghent University (GOA UGent; 01G01910). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Revers transkripsjon kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) har vist seg å være en pålitelig metode for å kvantifisere genuttrykk. Riktig normalisering er et kritisk problem for nøyaktig tolkning av RT-qPCR resultater. Dette kan oppnås ved hjelp av flere strategier som sikrer tilsvarende antall celler, tilsvarende mengder innspill RNA, som gjelder intern kontroll referanse gener som ribosomale RNA (rRNAs) eller messenger RNA (mRNA), eller sammenslåing av flere strategier i en protokoll [1], . [2]
bruk av mRNA som interne kontroll referanse gener for å normal RT-qPCR data blir brukt mye [2] – [6]. Imidlertid bør denne strategien utføres med forsiktighet, da dens nøyaktighet er direkte avhengig av ekspresjon stabiliteten av de valgte referanse gener. Ifølge Minimum Informasjon til offentliggjøring av kvantitativ real-time PCR Eksperimenter (MIQE retningslinjer) [7], er det ikke lenger akseptert å vurdere at visse referanse gener er stabile av konvensjonen. Vår gruppe har tidligere rapportert en strategi for nøyaktig normalisering av RT-qPCR data basert på geometrisk gjennomsnittsberegning av flere stabilt uttrykt interne kontrollgener [4]. I denne studien viser vi at valget av pålitelige internkontrollen er spesielt viktig i eksperimenter som involverer perturbasjon av kreftceller. Behandling av kreftceller med terapeutiske midler eller RNAi-medier siRNA eller shRNA molekyler induserer dramatiske endringer i uttrykket nivåer av mange gener, inkludert brukte referanse gener. Dette fenomenet skyldes (ikke-spesifikk) off-target-effekter som er oppstått ved levering av slike molekyler [8], eller indirekte regulering etter behandling. Derfor vurderte vi uttrykk for brukte referanse gener og uttrykte Alu gjentar som interne kontroller for normalisering i eksperimenter som omfatter forstyrrede kreftcellelinjer. Alu-repetisjoner blir funnet i den utranslaterte regioner av flere tusen kjente protein-kodende gener, og de har blitt rapportert å være nyttig som en enkelt normaliseringsfaktor for RT-qPCR reaksjoner [9].
Resultatene
Cancer Cell perturbasjon Eksperimenter
Behandling med nutlin-3.
nutlin-3 er et lite molekyl som spesifikt kan hemme p53-MDM2 interaksjon, hvilket resulterer i aktivering og stabilisering av p53 [ ,,,0],1], [2], [10]. Behandling med nutlin-3 induserer apoptose (figur 1A), cellesyklus arrest, differensiering, eller begynnende alderdom i neuroblastom celler med vill-type
TP53 product: [2] -. [6], [11]
(A), nutlin-3 behandlede NGP celler, 16 um (til høyre) og kjøretøykontroll (til venstre). (B), Atrå behandlet NGP celler med langstrakte neurites (til høyre) og kjøretøykontroll (til venstre). (C), celleviabilitet analyse av IMR-32 og SK-N-SH-celler etter behandling med økende konsentrasjoner av withaferin-A i 24 timer. Feil barer, SD (n = 3). (D), celle-levedyktighet assay etter behandling av CLB-GA og SK-N-SH-celler med økende konsentrasjoner av TAE-684 i 24 timer. Feil barer, SD (n = 3). (E), RT-qPCR ekspresjonsdata av PTK9 i SH-EP, SK-N-SH, SH-SY5Y og SK-N-BE (2c) etter transfeksjon med Mir-1 etterligne eller egge miRNA etterligne fungerer som en negativ kontroll (NC). Feilfelt, SEM (n = 2). (F), RT-qPCR uttrykk data fra T-UCR uc. 73 (til venstre) og T-UCR uc.460 (høyre) 24 timer etter transfeksjon av SH-EP celler med siRNA mot T-UCR uc. 73 og siRNA mot T-UCR uc. 460 hhv. Feil barer, SEM (n = 2).
Behandling med Atrå.
All
trans
retinsyre (ATRA) er en liten lipofilt molekyl [7 ], [12] som hemmer proliferasjonen og induserer differensiering av neuroblastom-celler [4], [13] – [15]. Vi behandlet CLB-GA og NGP celler med 0 eller 5 mikrometer Atrå for ett og fem dager, og observerte at Atrå induserer utvekst av neurites (Figur 1b).
Behandling med withaferin-A.
Withaferin-A er et steroid lakton renset fra medisinsk plante
Withania somnifera
. Denne forbindelse induserer apoptose i neuroblastom-celler og er et anti-angiogent middel [8], [16]. Vi behandlet SK-N-SH og IMR-32-celler med neuroblastom withaferin-A og observert redusert cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte (figur 1C). Vi behandlet deretter SK-N-SH og IMR-32 celler med 0 eller 1 mikrometer withaferin-A for en dag for å vurdere stabiliteten i referanse gener.
Behandling av neuroblastom cellelinjer med TAE-684.
TAE-684 er et lite molekyl hemmer av aktivert anaplastisk lymfom kinase (ALK) [9], [17] og reduserer cellelevedyktighet
ALK
muterte neuroblastom-celler [18]. Etter behandling av SK-N-SH og CLB-GA celler med TAE-684, observerte vi redusert celle levedyktighet i en dose og tidsavhengig måte (figur 1D). Vi behandlet så disse to cellelinjene med 0, 0,1, 0,3 og 1 pM TAE-684 for 3, 6, 12, 24 og 48 timer for å evaluere stabiliteten til referanse gener.
Behandling av en NSCLC cellelinje med TAE-684.
H3122 er et NSCLC cellelinje med en
EML4-ALK
fusjonsgenet som ble behandlet med TAE-684 på samme måte som beskrevet ovenfor.
Forbigående transfections av neuroblastom cellelinjer med Mir-1 etterligne.
MiR-1 mål 3′-UTR av
PTK9
mRNA fører til
PTK9
degradering [19]. MiR-1 blir ofte brukt som en positiv kontroll i eksperimenter med miRNA ligne transfeksjoner for å evaluere målgen mRNA nedregulering av qPCR. Vi utførte forbigående transfections av SK-N-BE (2c), SK-N-SH, SH-EP, og SH-SY5Y neuroblastom celler med Mir-1 etterligne, negativ kontroll (en kryptert miRNA etterligne), eller mock transfeksjon for 24 timer (figur 1E).
Forbigående transfections av SH-EP celler med sirnas mot transkribert ultraconserved regioner.
Vi transfektert SH-EP celler med siRNA mot begge tilnærmingene av T-UCR uc.460 og et siRNA mot den negative tråd av T-UCR uc.73.The knockdown effektivitet er vist i figur 1F. Flere detaljer om eksperimentell design er funnet i File S1.
Transient transfeksjon av leukemi cellelinjer med Mir-223 etterligne.
MiR-223 ble funnet å være sterkt uttrykt i T-celle akutt lymfatisk leukemi (T-ALL) [20]. Men tre T-ALL cellelinjer, HPB-ALL, ALL-SIL og TALL-1 presentert med en lav MIR-223 nivå. Vi forventet at overekspresjon av onkogent MIR-223 i disse cellelinjene vil øke den proliferative kapasiteten av cellene og bevise den onkogene potensialet i dette miRNA (data ikke vist).
Optimalisering av konsentrasjonen av
PHF6
målretting for siRNA i T-ALL cellelinjer.
Vi transfektert
PHF6
villtype T-ALL cellelinje JUKART og evaluert knockdown effektivitet på mRNA nivå (figur 2). Neste, vi transient transfektert HSB-2 og PF-382 T-ALL cellelinjer (både PHF6 villtype) med PHF6 målretting siRNA. Betydelig PHF6 slå ned ble bekreftet ved qPCR (vist i figur 2). Flere detaljer om eksperimentell design er funnet i File S1
JUKART cellelinje etter transfeksjon av
PHF6
for målretting for siRNA eller egge siRNA (negativ kontroll: NC).. Feilfelt, SEM (n = 2).
Transient transfeksjon av en melanom-cellelinje med siRNA mot cyklofilin-B.
WM9 er et melanoma-cellelinje som ble transient transfektert med 20 nM og 50 nM siRNA mot cyklofilin-B (PPIB), eller et egge negativ kontroll siRNA.
Behandling av brystkreft, AML, prostatakreft, tykktarmskreft og neuroblastom cellelinjer med JQ1.
JQ1 er et lite molekyl forbindelse som inhiberer en bromodomain protein kalt BRD4. Målrettende av dette onkogen fører til veksthemming av kreftcellelinjer. En kjent mekanisme er gjennom nedregulering av MYCN. Vi behandlet to brystcancercellelinjer (MCF-7 og SKBR3), en AML-cellelinjen (K562), en prostatacancer cellelinje (PC-3), en kolorektal kreft cellelinje (SW-620) og en neuroblastom cellelinje ( SJNB-12) med en mikrometer JQ1 for 24 og 48 timer.
MCF-7 og HeLa transkriptom PCR Arrays
Vi brukte kommersielt tilgjengelige klare til bruk cDNA plater fra MCF7- (brystkreft cellelinje) og HeLa (cervikal cancer cellelinje). Hver cDNA-prøven er syntetisert fra RNA ekstrahert fra en cellelinje som hadde vært utsatt for en av 90 forskjellige kjemiske inhibitorer. Disse kjemiske inhibitorer rettet mot et bredt spekter av forskjellige reaksjonsveier som fører til forskjellige forstyrrelser av en to mest brukte kreftcellelinjer. De kjemiske hemmere og genene de målet er oppført i tabell S1.
Alu Gjentar er de mest stabilt uttrykket Reference Sequence
mRNA nivåer av 11 kandidatreferanse analyser ble målt i alle ovenfor beskrevne eksperimenter og den gjennomsnittlige uttrykket stabilitet ble beregnet ved anvendelse av geNorm algoritmen. GeNorm rangerer referanse gener med tanke på stabilitet verdi (henvist til som M-verdi), og beregner det optimale antall gener som skal anvendes for å normalisere i et gitt eksperiment ved hjelp av V-verdi (figur S1). M-verdier kan brukes for å rangere genene fra den minste til den mest stabile on [4].
I 13 av de 19 perturbasjonsteknikker eksperimenter utført, Alu gjentar (Alu-Sq) ble rangert blant de tre mest stabile referanse analyser (figur 3). Denne observasjonen bedt oss om å ytterligere analysere den potensielle verdien av Alu gjentar som stabile referanse kandidater.
X-aksen viser rangeringen av referanse gener, og Y-aksen viser geNorm M-verdier. (A), nutlin-3 behandlede neuroblastom-celler. (B), ATRA behandlede neuroblastom-celler. (C), withaferin et behandlet neuroblastom-celler. (D), TAE-684 behandlede neuroblastom-celler. (E), neuroblastom-celler transfektert med sirnas mot T-UCRs. (F), neuroblastom celler transfektert med Mir-1 etterligne. (G), T-ALL cellelinjer (HPB-ALL, ALL-SIL, og TALL-1) transfektert med Mir-223 etterligne eller negativ kontroll MIR ligne. (H), T-ALL cellelinje JUKART transfektert med
PHF6
for målretting for siRNA eller negativ kontroll siRNA. (I), T-ALL cellelinjer (HSB-2 og PF-382) transfektert med
PHF6
for målretting for siRNA eller negativ kontroll siRNA. (J), NSCL cellelinje (H3122) behandlet med crizotinib. (K), melanom-cellelinje (WM-9) transfektert med siRNA mot Cyklofilin-B. (L), AML cellelinje (K562) som ble behandlet med JQ1. (M), brystkreft cellelinje (MCF-7) ble behandlet med JQ1. (N), brystkreft cellelinje (SKBR-3) ble behandlet med JQ1. (O), prostatakreft-cellelinje (PC-3) ble behandlet med JQ1. (P), kolorektal cellelinje (SW-620) som ble behandlet med JQ1. (Q), neuroblastom-cellelinje (SJNB-12) ble behandlet med JQ1. (R), MCF-7 ble behandlet med 90 forskjellige kjemiske inhibitorer. (S), livmorhalskreft cellelinje (HeLa) behandlet med 90 ulike kjemiske hemmere.
En rang aggregering metode basert på stemmegivning teori (Borda tellingen) ble brukt til å kombinere 19 rangert lister over referanse kandidater [21]. Denne fremgangsmåte forsøker å finne en ordnet liste over referanse assays så nær som mulig til alle individuelle ordnede lister ved å beregne et vektet Spearmans footrule avstand, og ved hjelp av et tverrentropi Monte Carlo-algoritme eller genetisk algoritme [21]. Analysen av de 19 komplette genet lister, som genereres av de 19 forskjellige eksperimenter resulterte i Alu gjentar rangert ved den første posisjon (figur 4). Dette bekreftet at Alu gjentar representerer den mest stabil referanse analyse på tvers av alle datasett.
Rank aggregering resultat bruker korset entropi algoritmen med Spearmans fot-regelen vektet avstand som viser en konsensus rekkefølgen referanse gener fra den mest stabile til den minst stabile.
Diskusjoner
RT-qPCR er den mest brukte metoden for å kvantifisere genekspresjon og nøyaktig normalisering er nødvendig for å tolke RT-qPCR data på riktig måte. Normalisering ved hjelp av endogene kontrollgener er en mye brukt metode for å korrigere for den tekniske variasjoner som forekommer i løpet av RT-qPCR reaksjoner. Inntil nylig har en eneste ikke-validert referanse genet rutinemessig blitt brukt som en intern kontroll. Vi har tidligere rapportert at denne strategien kan føre til feil med en feilmelding opp til tre ganger i 25% av tilfellene [4]. Bruke flere referanse gener som interne kontroller for å normal RT-qPCR data samt bruke de riktige referanse gener for bestemte eksperimentelle formål er allerede sterkt til orde i litteraturen [2], [22]. Validere stabil uttrykk for referanse gener er et viktig tema i hver eneste eksperimentelle prosedyren siden celle manipulasjoner slik som behandling med terapeutiske forbindelser kan dramatisk påvirke deres uttrykk.
I denne studien, legger vi vekt på det faktum at riktig valg av referansegener er viktig for tolkningen av RT-qPCR data og viser at Alu-repetisjoner representerer den mest stabile referanse assay i et bredt spekter av eksperimentelle betingelser i åtte forskjellige krefttyper.
Vi valgte 11 referanse gener som er allment brukes i litteraturen og som tilhører ulike funksjonelle klasser for å unngå co-regulering. Vi valgte struktur relaterte gener (
ACTB
,
RPL13A
), metabolisme relaterte gener (
HPRT
,
GAPDH
), og transkripsjonsrelaterte gener (
TBP
). Resten av genene er ikke kategorisert spesifikt i en funksjonell klasse. Vi inkluderte også uttrykt Alu gjentar, som er rikelig ispedd hele genomet. En vanlig brukt normaliseringsfaktor for RT-qPCR eksperimenter i litteraturen er 18S rRNA. RRNA utgjør mer enn 90% av total-RNA, og dette faktum førte til at mange forskere til å bruke 18S rRNA som en kontroll for normalisering av genuttrykk av data. Imidlertid har det vist seg at like deler av rRNA ikke nødvendigvis sikre like fraksjoner av mRNA [23]. Denne bekymringen er enda større betydning i kreftcelle perturbasjonsteknikker eksperimenter som disse forstyrrelser kan føre til differensiell ekspresjon av RNA-polymerase I og /eller II, eller differensial degradering av de to RNA-populasjoner [24], og følgelig kan resultere i ytterligere ubalanser i rRNA /mRNA-forhold. I tillegg er den høye mengden av rRNA i forhold til mRNA gjør det vanskelig å trekke fra bakgrunns fluorescens i dataanalyse av RT-qPCR data [4]. På grunn av disse grunnene, ved hjelp av 18S rRNA som en kontroll i RT-qPCR forsøk kan føre til falsk tolkning av genuttrykk av data. Vi har derfor ikke vurdert 18S rRNA i vår studie.
RT-qPCR ble utført for de 11 referanseforsøk i 21 kreftcellelinjer avledet fra 9 forskjellige kreft foretak som bruker SYBR grønn teknologi. Cellelinjene ble utsatt for harde behandlingsbetingelsene, generering av 19 forskjellige datasett med en total av 418 prøver. Cellene ble behandlet med ulike kjemiske hemmere inkludert pro-apoptotiske forbindelser, og differensiering-induserende midler, eller transfektert med miRNA etterligner eller siRNAs. Bruke geNorm [4] implementert i qbase + [1], vi beregnet stabilitet verdi eller M-verdi. M-verdien er den gjennomsnittlige parvise variasjon (standardavvik) av log-transformeres forholdstall på uttrykk nivåer av sammenkoblede kandidat referanse gener. Denne verdi ikke bare mulig for oss å rangere referansegener i form av deres stabilitet, men også for å sammenligne stabiliteten av disse referanse gener på tvers av forskjellige forsøksbetingelser. M-verdier og rangeringen av referanse genene i alle datasett er vist i tabell 1. M-verdier som er lavere enn 0,5, er klassifisert som gode verdier [1]. Spredning av M-verdiene for hver gen blant alle forsøkene er vist som et boksplott i figur S2.
Etter beregning av M-verdiene og rangering referanse genene, la vi merke til at Alu gjentar rangeres blant de mest stabile referanse gener i de aller fleste datasettene og generelt har lave M-verdier. Vi deretter brukt en rangering aggregering strategi [3] for å bestemme den optimale rangeringen av referanse gener på tvers av alle 19 datasett. Denne analysen bekreftet at Alu-repetisjoner representerer den mest stabile referanse analysen med akseptable M-verdier. Alle våre genuttrykk Målingene ble gjort ved hjelp av SYBR grønt. Ulike teknologier er tilgjengelig for øyeblikket, og flere studier har utført sammenligninger mellom de ulike plattformene som benyttes [25]. Resultatene har vist at SYBR grønt er i meget god samsvar med de brukte TAQMAN genuttrykk analyser. I denne studien har vi brukt cellelinjer som gir et godt utbytte av RNA og perfekt kvalitet (testet ved hjelp av Experion system fra Bio-Rad). Vi mener at bruk av så høy kvalitet RNA materiale og slike rikelig referanse gener vil generere reproduserbare resultater uavhengig av plattformen som brukes. Våre resultater understreker sterkt viktigheten av riktig valg av referanse gener for ulike forsøksoppsett. I tillegg viste vi at Alu gjentar kan tjene som en stabil referanse i de fleste av de eksperimentelle betingelser.
Konklusjoner
Påliteligheten av RT-qPCR data er basert på nøyaktig normalisering av den genererte data ved hjelp av interne referanse gener. Stabiliteten og egnetheten av mulige endogene kontrollgener er en nødvendighet for nøyaktig normalisering og for riktig tolkning av genuttrykk av data. I denne studien, rapporterer vi at blant 11 som vanligvis brukes referansegener, Alu gjentar er de mest stabile referansesekvens i cellelinjer fra 9 forskjellige krefttyper som ble utsatt for forskjellige perturbasjonsteknikker eksperimenter. Vi anbefaler derfor å inkludere Alu gjentar som et første kandidat for normalisering av RT-qPCR data.
Materialer og Metoder
Valg av referanse Genes
Valg av intern kontroll gener undersøkt i denne studien (tabell 1) er basert på en tidligere studie publisert av vår gruppe [2], [4] – [6]. Disse gener blir ofte brukt som referanse gener i litteraturen og tilhører forskjellige veier for å unngå samtidig regulering av disse genene ved forskjellige behandlingsforhold. Vi utvidet dette valget for å inkludere uttrykt Alu gjentar.
Cellelinjer og dyrking av celler
Cellene som brukes er etablert cellelinjer fra 9 tumortyper, neuroblastom, T-ALL, melanom, brystkreft , akutt myeloid leukemi, prostatakreft, tykktarmskreft, ikke-småcellet lungekreft, og livmorhalskreft. Detaljer om dyrking av cellelinjer, og deres kilde er nevnt i File S2.
Drug Treatment og celleviabilitet Assessment
Celler ble behandlet med 16 mikrometer nutlin-3 (Cayman Chemical, USA) eller bærerkontroll (etanol) for 1 og 5 dager, 16 uM ATRA (Sigma-Aldrich, Belgia) eller bærerkontroll (DMSO), 1 uM withaferin-A eller bærerkontroll (etanol), 0,1 pM, 0,3 pM eller 1 uM TAE -684 (Novartis, Sveits) eller kjøretøy kontroll (DMSO), 1fiM JQ1 (Cayman Chemical, USA) eller kjøretøy kontroll (DMSO) for de nevnte tidspunkter. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av CellTiter-Glo (Promega, Belgia) en luminscent ATP-baserte analysen.
Transfeksjon med sirnas og miRNA Ligner
SK-N-BE (2c), SK-N SH, SH-EP, og SH-SY5Y celler ble transfektert med en MIR-en etterligne hjelp Dharmafect-2 (Dharmacon, Storbritannia) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt, ble 500.000 celler sådd ut i 6-brønns plater i antibiotikafritt medium og forsynes med 10% føtalt kalveserum. 24 timer senere ble cellene transfektert ved anvendelse av en sluttkonsentrasjon på 100 nM av MIR-1 etterligner og 0,2% av Dharmafect-2. Cellene ble deretter høstet etter 48 timer.
SH-EP-celler ble transfektert med sirnas mot T-UCRs (uc.73 og uc.460) ved hjelp Dharmafect-2 i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt, 100.000 celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og transfektert ved hjelp av en sluttkonsentrasjon på 50 nM sirnas og 0,2% Dharmafect-2. Cellene ble høstet etter 15, 24, 48 og 72 timer
T-ALL cellelinjer ble electroporated på 250 V og 1000 uF (eksponentiell puls) (Genepulser II;. Bio-Rad, Hercules, CA , USA) med 400 nM, 100 nM, 25 nM og 10 nM av
PHF6-
målretting siRNA (ON-TARGETplus SMARTpool; Dharmacon, Lafayette, CO, USA) for Jurkatceller og med 400 nM
PHF6-
målretting siRNA for HSB-2 og PF-382. ALL-SIL, T-ALL-en, og HPB-ALL ble electroporated med 600 nM av Mir-223 etterligne. Som en kontroll ble elektroporert vi cellene med tilsvarende konsentrasjoner av et omkastet siRNA (ON-TARGETplus ikke-målsøkende Pool, Dharmacon, Lafayette, CO, USA) eller uten siRNA. Vi høstet HSB- 2, PF-382, ALL-SIL, T-ALL-en, og HPB-ALL celler 1, 24, 48, 72, og 96 timer etter electroporation og Jurkat celler etter 48 timer.
WM-9 celler ble transfektert med 20 nM og 50 nM av siRNA bassenget mot PPIB eller egge siRNA (ON-TARGETplus Non-måls pool, Dharmacon, Lafayette, CO, USA).
listen over de kjemiske hemmere brukes av Qiagen å behandle MCF-7 og HeLa celler og deres liste over målgener er oppført i tabell S1.
RT-qPCR
Utvinning av total RNA, DNase-behandling, cDNA syntese, og SYBR grønn I RT-qPCR fra forstyrrede celler ble utført som beskrevet tidligere [4], [7]. De er klare til bruk cDNA plater av MCF-7 og HeLa ble bestilt fra Qiagen, Nederland. De følgende primer-sekvensene er tilgjengelige i databasen RTPrimerDB (https://www.rtprimerdb.org) [4], [26]: ACTB (RTPrimerDB ID # 1), B2M (# 2), GAPDH (# 3), HMBS (# 4), HPRT1 (# 5), RPL13A (# 6), SDHA (# 7), UBC (# 8), YWHAZ (# 9). Sekvensen av Alu-Sq gjentar primere er CATGGTGAAACCCCGTCTCTA for foroverprimeren og GCCTCAGCCTCCCGAGTAG for den reverse primer. Primersekvensene av TBP primere var som beskrevet [8], [27]. RNA kvalitetsindeks. (RQI 8) ble vurdert for 20 prøver på tilfeldig valgte bruker Experion (programvareversjon 3.2, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgia)
statistiske målesystemer og dataanalyse
GeNorm tilgjengelig i qbase + (Biogazelle, https://www.qbaseplus.com) ble brukt til å beregne M-verdier og kvantifisere genuttrykk data. GeNorm er en algoritme som beregner en genekspresjon stabilitet mål (M-verdi) for de valgte referanse gener. Dette gjøres ved å beregne den parvise variasjon (standardavvik på logaritmisk transformerte ekspresjon forhold) av hver referanse-genet med alle andre referanse gener. Den laveste M-verdien angir genet med det høyeste uttrykk stabilitet. Trinnvis utelukkelse av genet med høyest M-verdien kan rangeringen av gener i form av uttrykk stabilitet. Analysen av alle enkelt rangert genet listene ble gjort ved hjelp av rang aggregering R pakke kalt «RankAggreg» [21]. RankAggreg ble anvendt for å bestemme den mest stabile referansegenet i alle eksperimenter. Rankaggreg er en R-pakke for rang aggregering analyse. Vi brukte denne pakke for å analysere de enkelte rangert genet lister. Disse genet listene ble rangert i forhold til sine M-verdier og rang aggregering analyse mulig for oss å finne nærmeste mulig listen til alle individuelle listene som genereres av de enkelte eksperimenter. Mer spesifikt har vi brukt Cross-Entropy (CE) Monte Carlo algoritme implementert i denne pakken som starter ved å generere tilfeldige lister og deretter konvergerer mot de beste optimal liste gjennom en iterasjon prosedyre som bruker en avstand funksjon. Vektet Spearmans footrule avstand brukes til dette formålet, og i vårt tilfelle brukte vekten er M-verdien generert av GeNorm algoritmen for hvert gen i de enkelte listene.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
GeNorm V-verdiene for de enkelte eksperimenter
. GeNorm V-verdi anvendes for å bestemme det optimale antall referansegener. GeNorm beregner den parvise variasjon mellom 2 sekvensielle normaliseringsfaktorer (NFS). Normaliseringsfaktoren er den geometriske middelverdi av ekspresjon av de valgte referanse gener. Normaliseringsfaktoren NF
n + 1 er det geometriske gjennomsnittet av NF
n pluss en ekstra referanse genet. V
2/3 er variasjonen mellom NF
2 og NF
3, og så videre. Vandesompele
et al. Product: [4] foreslått 0,15 som en cutoff under der er det ikke nødvendig å ta med en ekstra referanse genet. (A), nutlin-3 behandlede neuroblastom-celler. (B), ATRA behandlede neuroblastom-celler. (C), withaferin et behandlet neuroblastom-celler. (D), TAE-684 behandlede neuroblastom-celler. (E), neuroblastom-celler transfektert med sirnas mot T-UCRs. (F), neuroblastom-celler transfektert med premiR-1. (G), T-ALL cellelinjer (HPB-ALL, ALL-SIL, og TALL-1) transfektert med premiR-223 eller negativ kontroll premiR. (H), T-ALL cellelinje JUKART transfektert med
PHF6
for målretting for siRNA eller negativ kontroll siRNA. (I), T-ALL cellelinjer (HSB-2 og PF-382) transfektert med
PHF6
for målretting for siRNA eller negativ kontroll siRNA. (J), NSCL cellelinje (H3122) celler behandlet med crizotinib. (K), melanom-cellelinje (WM-9) transfektert med siRNA mot cyklofilin-B. (L), AML cellelinje (K562) som ble behandlet med JQ1. (M), brystkreft cellelinje (MCF-7) ble behandlet med JQ1. (N), brystkreft cellelinje (SKRB-3) ble behandlet med JQ1. (O), prostatakreft-cellelinje (PC-3) ble behandlet med JQ1. (P), kolorektal cellelinje (SW-620) som ble behandlet med JQ1. (Q), neuroblastom-cellelinje (SJNB-12) ble behandlet med JQ1. (R), MCF-7-celler behandlet med 90 forskjellige kjemiske inhibitorer. (S), livmorhalskreft cellelinje (HeLa) behandlet med 90 ulike kjemiske hemmere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071776.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Spredning av M-verdier
. Boksplott som viser spredningen av M-verdiene for hver referanse gener over al datasett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071776.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Kjemiske hemmere. En liste over de 90 kjemiske hemmere og genene de målet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071776.s003 plakater (XLSX)
File S1.
Eksperimentell design og manipulering av cellelinjene.
Forbigående transfeksjoner av SH-EP-celler med sirnas mot transkriberte ultraconserved regioner, og optimalisering av konsentrasjonen av
PHF-6
-targetting sirnas i T-ALL cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071776.s004 plakater (docx)
File S2.
Cellelinjer og dyrking av celler
. Informasjon om kilden og dyrkingsforhold cellelinjene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071776.s005 plakater (docx)
Takk
Vi vil gjerne takke Nurten Yigit, Aline Eggermont, og Katrien Vanderheyden for deres teknisk assistanse.
