Abstract
Lungekreft er den vanligste formen for kreft. Overlevelse for pasienter med metastatisk lungekreft er ~ 5%, derav alternative terapeutiske strategier for å behandle denne sykdommen er kritisk nødvendig. Nyere studier tyder på at fett biosyntetiske veier, spesielt syntesen av fettsyrer og desaturation, er lovende molekylære mål for kreftbehandling. Vi har tidligere rapportert at inhibering av stearoylCoA desaturase-1 (SCD1), det enzym som produserer monoumettede fettsyrer (MUFA), svekker lungekreft celleformering, overlevelse og invasivitet og dramatisk redusert tumordannelse hos mus. I denne rapporten, viser vi at inhibering av SCD-aktivitet i humane lungekreftceller med det lille molekylet SCD-inhibitor CVT-11127 redusert lipidsyntese og nedsatt proliferasjon ved å blokkere progresjonen av cellesyklusen via G
1 /S-grensen og etter utløsende programmert celledød. Disse forandringer som følge av SCD blokkade ble fullstendig reversert av enten oljesyre (18: 1n-9), palmitoleinsyre (16: 1n-7), eller cis-vaccenic syre (18: 1n-7) viser at cis-MUFA er viktige molekyler for kreftcelle-proliferasjon. I tillegg, co-behandling av celler med CVT-11127 og CP-640186, er en spesifikk acetylCoA karboksylase (ACC) inhibitor, ikke potenserer den veksthemmende virkning av disse forbindelser, noe som tyder på at inhibering av ACC eller SCD1 påvirker et tilsvarende mål kritisk for celle spredning, sannsynligvis MUFA, den felles fettsyre produkt i reaksjonsveien. Denne hypotesen ble ytterligere forsterket av den observasjon at eksogene oljesyre reverserer anti-vekst effekt av SCD og ACC-hemmere. Til slutt gjenopprettet eksogen oleinsyre den globalt reduserte nivåer av celle lipider i cellene som gjennomgår en blokade av SCD-aktivitet, noe som indikerer at aktiv lipid syntese er nødvendig for den fettsyre-mediert restaurering av proliferasjon i SCD1-inhiberte celler. Til sammen disse observasjonene tyder på at SCD1 styrer cellesyklusprogresjon og apoptose, og følgelig den generelle hyppigheten av spredning av kreftceller gjennom MUFA-mediert aktivering av lipid syntese
Citation. Hess D, Chisholm JW, Igal RA (2010) Hemming av StearoylCoA desaturase Aktivitets Blocks cellecyklusprogresjonen og induserer programmert celledød i lungekreft celler. PLoS ONE 5 (6): e11394. doi: 10,1371 /journal.pone.0011394
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 11 april 2010; Godkjent: 02.06.2010; Publisert: 30 juni 2010
Copyright: © 2010 Hess et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler fra School of Environmental og biologi og Johanna og Charles Busch Foundation, Rutgers University, og en Hatch stipend fra US Department of Agriculture. Gilead Sciences Inc. gitt CVT-11127 i støtte av studiene og JWC bidratt vitenskapelig til tolkning av data og skriving av manuskriptet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. JWC er en ansatt og aksjonær i Gilead Sciences Inc. (Palo Alto) og en oppfinner på en SCD relatert patent og flere SCD patentsøknader.
Innledning
ikke-småcellet lungekreft er den ledende dødsårsaken av kreft i den industrialiserte verden. Den 5-års overlevelse er ~15% for pasienter med lungekreft, og synker til ~ 5% hos personer med metastatisk kreft [1], er derfor nye terapeutiske tilnærminger basert på nye molekylære mål trengs. I de senere år har undersøkelser vist at den konstitutiv aktivering av lipidbiosyntese, særlig syntesen av mettede (SFA) og monoumettede fettsyrer (MUFA), er en kritisk hendelse i karsinogenese [2], [3], som tyder på at lipogenic trasé kan være verdifulle mål for kreft intervensjon. SCD er en familie av Δ9-fettsyre desaturase isoformer som konverterer SFA inn MUFA [4]. To isoformer er til stede hos mennesker; SCD1, som er uttrykt i de fleste voksent vev, og SCD5, som er sterkt uttrykt i embryo vev og voksen hjerne [5], [6]. Det har vist seg at malign transformasjon i lungekreftceller er positivt korrelert med SCD1 aktivitet og uttrykk [7]. Videre når flere kreftcellelinjer ble screenet med et siRNA-bibliotek mot 3,700 gener for å identifisere egnede mål for å indusere cytotoksisitet og celledød, SCD1 var en av de viktigste mål identifisert [8]. I lunge kreftceller, oppheving av SCD1 genuttrykk fører til svekket de novo lipid syntese, en redusert sats på celleproliferasjon, tap av forankringsuavhengig vekst og høyere forekomst av ceramid uavhengig apoptose [9]. Disse funnene sterkt implisere SCD1 i reguleringen av spredning, invasivitet og overlevelse av kreftceller.
SCD1 spiller også en sentral rolle i tumordannelse og vekst. Hos mus, bakgrunnsnivået av SCD1 uttrykk korrelerer med predisposisjon for leveren kreftutvikling; gnagere med høyere nivåer av SCD1 er mer utsatt for induksjon av kreft [10]. Videre, ved hjelp atymiske «nakne» mus, viste vi for første gang at lungekreftceller med reduserte nivåer av SCD1 oppviser en sterkt nedsatt kapasitet for tumordannelse og progresjon av tumorvekst, noe som tyder på at SCD1 er en kritisk faktor i tumorgenese [11] .
Vi har tidligere rapportert [9], [11], [12] som SCD1, ved å konvertere SFA til MUFA, regulerer kreftcelle lipogenese ved: i) å opprettholde ACC i sin aktivere tilstand skjønt omdannelsen av mettede acylCoAs som er allosteriske hemmere av ACC i MUFA; ii) fremme defosforylering og inaktivering av AMPK, hovedkreftcellen drivstoff sensor som er rettet mot ACC for fosforylering /inaktivering; og iii) å indusere aktivering av Akt veien, som aktiverer ekspresjon av nøkkelenzymer lipogenic [3]. Selv om disse resultatene tydelig støtte SCD1 som en sentral regulator av lipogenese i kreftceller, har de ikke fullt ut forklare hvordan SCD1 og lipogenese samhandle i å regulere kreftcelle mitogenesis og transformasjon.
Målet med denne studien var å undersøke rollen til SCD1 ved modulering av cellesyklusprogresjon. Ved hjelp av en ny lite molekyl hemmer av SCD-aktivitet, bestemt vi at akutt farmakologisk inhibering av SCD1 i lungeceller blokkerer passasjen av sykkel celler fra G
1 til S-fase og induserer inngangen celler i programmert celledød. Videre, i celler inkubert med et lite molekyl inhibitor av ACC, et hastighetsbegrensende enzym lipogenic som moduleres av SCD1 aktivitetsnivå, tilsvarende endringer i celleformering ble observert. I samsvar med syntesen av fettsyrer er den vanligste målet vei, var det ingen synergistisk cytostatisk effekt når cellene ble inkubert med både ACC og SCD inhibitor.
Materialer og metoder
Materialer
AG01518 normale humane hudfibroblaster ble oppnådd fra Coriell (Camden, NJ). H460-human lunge adenokarsinom-celler var fra ATCC (Manassas, VA). Cellekulturmedier og andre kultur reagenser var fra Invitrogen Livet Technologies (Carlsbad, California). [6-
3H] tymidin var fra amerikanske Radiomerket Chemicals, Inc. (St. Louis, MO). Ultrafiltrert føtalt bovint serum (FBS), fettsyrefritt bovint serumalbumin (BSA), muse-anti-β-actin monoklonalt antistoff, anti-muse-IgG-konjugat, fosfatase og protease-inhibitor cocktail ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO ). Cyclin D1 og CDK6 antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Cellekultur forsyninger, silikagel 60 kromatografi plater og analytisk klasse løsemidler var fra Fisher Scientific, (Morris Plains, New Jersey). CP-640186 ble velvillig donert av Donnie Owens, Pfizer.
Cell kultur
Celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (10 mikrogram /ml), 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% MEM vitaminløsning (vekstmedium), ved 37 ° C, 5% CO
2, og 100% fuktighet.
celleproliferasjonsanalyse
Cell formeringshastigheten ble bestemt i normale humane fibroblaster og H460-cancerceller hos krystallfiolett analyse [12]. I korthet ble cellene fiksert med metanol, farget med 0,1% krystallfiolett i destillert vann og skylles tre ganger med vann. Fargestoffet i de fargede celler ble oppløst i 10% metanol, 5% eddiksyre-oppløsning og kvantifiseres ved hjelp av spektrofotometri ved 580 nm. Verdien av en tom brønn ble subtrahert i hvert enkelt tilfelle. Resultatene ble uttrykt som prosentvis endring i celleproliferasjon med hensyn til OD verdier av bærer-behandlet kontrollgruppe (100%). I disse cellene ble SCD1 aktivitet opphevet ved inkubering med det lille molekylet SCD-inhibitor CVT-11127 [13]. I de konsentrasjoner som anvendes i forsøkene, CVT-11127 inhiberte SCD1 aktivitet mer enn 95% [12]. Celler ble også behandlet med 20 uM CP-640186, er en potent inhibitor av ACC-aktivitet [14]. Celler ble inkubert med inhibitorene i 48 timer eller mer for å gi rom for minst en populasjon dobling. For noen eksperimenter ble eksogene fettsyrer kompleksert med BSA (forhold 02:01) tilsatt til inkubasjonen media.
Bestemmelse av cellesyklusfordelingen
For å bestemme fordelingen av cellepopulasjoner in ulike faser av cellesyklusen, ble H460-celler behandlet med enten en pM CVT-11127, 20 uM CP-640186, eller DMSO kjøretøy i 48 timer. Grupper av celler ble inkubert i parallell med 100 uM fettsyrer kompleksert med BSA. Ved slutten av inkubasjoner ble celler samlet opp og behandlet med 50 ul RNase I (1 mg /ml) og farget med 5 ul propidiumjodid (1 mg /ml). Prosentandelen av celler i cellesyklus faser ble analysert ved fluorocytometry
Bestemmelse av apoptose ved DNA-fragmentering assay
bestemmelse av DNA-fragmentering hastigheten ble utført som beskrevet av Scaglia Igal [11]. I korthet ble DNA i preconfluent-celler ble merket med 0,4 pCi [
3H] tymidin i løpet av ordinær vekstmedium i 24 timer. Mediet ble deretter fjernet, ble cellemonolagene vasket to ganger med PBS ved 37 ° C og cellene ble tillatt å vokse i 24 timer i nærvær av 1 uM CVT-11127 eller bærer. Grupper av celler ble supplert med oljesyre. Etter behandling ble chase-medium inneholdfrittliggende apoptotiske celler samlet og [
3H] radioaktivitet ble bestemt i en scintillasjonsteller. Cellemonolagene ble lysert i PBS med 1% Triton-X100 og 0,2 mM EDTA og sedimentert ved sentrifugering. Radioaktivitet ble kvantifisert i supernatanten inneholdende fragmentert [
3H] DNA, og i den pellet som inneholdt intakt cellulært DNA. Pelleten ble vasket og resuspendert i 1% Triton-X100 og 0,2 mM EDTA. Prosentandelen av fragmentert [
3H] DNA ble beregnet i henhold til følgende regnestykke:. (Jage medium DPM + supernatant DPM) /total DPM
Cell lipid ekstraksjon og analyse
Cell lipider ble ekstrahert følge prosedyren beskrevet i Bligh 0,05 eller mindre kontra kjøretøy-behandlede celler; **, P. 0,05 eller mindre vs CVT-behandlede celler, av Student t test
Nivåene av pattedyr cykliner og cyclin-avhengige kinaser (CDK) spesielt svinge under cellesyklusprogresjon. Cykliner D og CDK er viktige determinanter i passasjen av cellesyklus gjennom G
en fase, forbi restriksjonen punktet og inn i S-fasen. Etter å ha observert at den farmakologiske ablasjon av SCD1 fremmet en endring i progresjonen G
1 → S, vi bestemmes nivåene av cyklin D1 og CDK6 sammenlignet med bærer-behandlede kontroller. Vi har observert at etter behandling av celler i 48 timer med SCD1 inhibitor, kreftceller viste en markert nedgang i innholdet av både cyclin D1 og CDK6 (Fig. 1B). Inkubasjon av SCD1-utarmet celler med oleinsyre normalisert nivåene av begge proteiner som bekrefter at MUFA er viktige molekyler i regulering av cellesyklusen.
Siden kapasiteten til kreftcellene for å unngå programmert celledød også bidrar til frekvensen av cancer celleproliferasjon, kan effekten av oljesyre på restaurering av celleproliferasjon i nærvær av en inhibitor SCD1 være grunn, delvis, til undertrykkelse av apoptose. Derfor bestemmes vi frekvensen av DNA-fragmentering, en typisk markør av apoptose i celler behandlet med CVT-11127 eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær av 100 pM oljesyre. Som vist på fig. 1C, fragmentering av DNA ble økt med 2,2-fold i SCD1-ablateres-celler sammenlignet med kontroller, noe som indikerer at SCD1 er en nøkkel overlevelsesfaktor i kreftceller. Vi observerte også at eksogen oljesyre reduserte nivået av fragmentert DNA i SCD1-manglende celler å styre verdier, noe som antyder at denne fettsyre eller en fettsyreprodukt av SCD1 er essensiell for å hindre apoptose i kreftceller.
Cis -MUFA redning celleproliferasjon svekket av SCD1 hemming
Vi har tidligere vist at de anti-proliferative effekter av CVT-11127 (1 mm) kan bli reversert av oljesyre [12]. Imidlertid har effekten av andre SCD produkt fettsyrer ikke undersøkt. I H460-lungekreftceller, fant vi at palmitoleinsyre (16: 1 n-7) og cis-vaccenic syrer (18: 1N-7), som oljesyre fullstendig reversert den anti-proliferative effekt av CVT-11127 (Fig. 2A) . Imidlertid, når H460-celler ble inkubert med eller uten 1 uM CVT eller DMSO i 48 timer i nærvær av enten 100 uM myristinsyre (14: 0), palmitinsyre (16: 0), heptadecansyre (17: 0), eller stearinsyre (18 .: 0) (figur 2B), observerte vi at alle SFA, med unntak av heptadecansyre, en ikke-naturlig fettsyre, utvidet de anti-proliferative effekt av SCD-inhibitor, mens SFA ikke hadde noen anti-proliferativ virkning i celler behandlet med bærer. I tillegg kan den anti-proliferative effekt av både SCD1 inhibering og stearinsyre overvinnes ved ko-inkubasjon med oljesyre. Tatt sammen Disse observasjoner viser klart at både endogene og eksogene SFA er cytotoksiske i fravær av enten SCD for å fremstille MUFA eller eksogent tilsatt MUFA.
A, H460-lungekreftceller ble behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT ) eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær av 100 uM cis-MUFA palmitoleinsyre (Pol), oljesyre (Ole) eller cis-vaccenic syre; og celle proliferasjon ble bestemt ved krystallfiolett farging. Proliferasjon ble på lignende måte undersøkt i H460-celler som ble behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT) eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær av 100 pM SFA myristinsyre (Myr), palmitinsyre (Pal), heptadecansyre (Hep), eller stearin ( Ste) syrer (B), eller 250 pM Pal, pluss eller minus 250 um Ole eller elaidinsyre (Ela) (C). Grupper av DMSO og CVT-behandlede celler ble inkubert med 2 ug /ml tunicamycin i nærvær eller fravær av 100 uM oleinsyre i 48 timer og cellevekst, ble bestemt (D). *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; **, P. 0,05 eller mindre vs fettsyre-behandlet kontroll av Student t test
Som vist i fig. 2C, når CVT-behandlede celler eller deres kontrollene ble inkubert med 250 pM palmitinsyre celleproliferasjon ble redusert til og med lengre enn i celler med en blokade i SCD1 og inkubert med 100 pM palmitinsyre. Men den cytotoksiske effekten av meget høy palmitinsyre ble fullstendig forhindret med oljesyre, men bare delvis med 250 uM av trans-MUFA elaidinsyre, hvilket antyder at bare cis-MUFA er funksjonelt egnet for å motvirke den cytotoksiske effekt av høye nivåer av SFA.
for å avgjøre om MUFA gir bred beskyttelse mot cytotoksisitet, bestemt vi muligheten av oljesyre for å overvinne den anti-vekst effekt av tunicamycin, et stoff som fremmer celle stress og apoptose ved å hemme protein glykosylering. Tunicamycin redusert celleproliferasjon med 80% i både CVT og vehikkelbehandlede kreftceller, mens tilsetningen av oljesyre var ute av stand til å gjenopprette spredning av SCD1-inhiberte celler (Fig. 2D). Denne observasjonen understreker at den beskyttende virkning av SCD1 mot SFA-mediert cytotoksisitet i kreftceller resultater fra dens spesifikke aktivitet i fettsyren biosyntetiske vei og ikke generell cytobeskyttende aktivitet.
Blokkade av SCD1 aktivitet med CVT-11127 svekker spredning av H460 kreftceller, men ikke normale humane fibroblaster
i tidligere studier vi rapporterte at spredning av normale menneskelige hud fibroblaster ikke ble svekket av SCD hemming [12]. Imidlertid er det mulig at disse celler er resistente overfor effektene av SCD-inhibering og trenger å bli inkubert i en lengre periode med inhibitoren eller med en høyere konsentrasjon av inhibitor. For å se på virkningen av inkubasjonstid og konsentrasjon av inhibitor, ble normale humane fibroblaster inkubert i 96 h, tid nok til å sikre i det minste en populasjon dobling, med 1 og 2 uM CVT-11127 i et medium inneholdende 10% FBS. Som vist i fig. 3A, inkubering med SCD-inhibitoren ikke effekt på proliferasjonen av disse cellene. Imidlertid lignende betingelser fullstendig blokkert (98%) av veksten av H460-celler (fig. 3B). Både normale og kreftceller ble behandlet med den SCD-inhibitor i serum-manglende media og effekten av SCD inhibitor av cellevekst var uavhengig av tilstedeværelsen av serum (data ikke vist). Det faktum at fibroblaster var helt svarer til den cytostatiske effekt av SCD-inhibitoren antyder at ikke-cancerceller har en mindre behov for endogent fremstilt MUFA enn kreftceller.
Celleveksten ble bestemt i AG01518 normale humane fibroblaster (A ) i nærvær av 1 og 2 uM CVT-11127 i 10% FBS DMEM eller vehikkel i 96 timer. H460-celler (B) ble behandlet med 1 pM CVT-11127 eller bærer i 96 timer. Celleproliferasjon sats ble vurdert ved krystallfiolett farging. *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; ved Students t-test.
Aktiv de novo lipid syntese er nødvendig for fettsyre-mediert reversering av den anti-proliferative effekt av SCD1 inhibering
Vi har rapportert at inhibering av SCD1 reduserer lipogenese, i det minste delvis ved å inaktivere det hastighetsbegrensende lipogenic enzym ACC-α og det reduserte lipogenese kan bidra til den lave spredning av SCD1-ablateres celler [12]. For å undersøke forholdet mellom SCD1, ACC og lipogenese i kreftcelleformering, behandlet vi H460-celler med CP-640186, er en spesifikk hemmer av ACC, ved en konsentrasjon på 20 uM som hemmer mer enn 95% av enzymaktiviteten [14]. Som vist på fig. 4A, inkubering av cellene med ACC-inhibitoren i 48 timer førte til en nedgang i celleantall ~ 30% i forhold til bærer-behandlede kontroller. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterte studier [16], [17]. Den cytostatiske virkning av ACC blokade var reversibel ved både 100 uM palmitinsyre og 100 uM oleinsyre (fig. 4A) som tyder på at ACC aktivitet regulerer celleproliferering ved tilførsel av fettsyrer for lipidbiosyntese. Den veksthemmende virkning av ACC inhibering ble forårsaket av en blokk i cellesyklusutvikling, siden det var en signifikant reduksjon i populasjonen av celler i S og G
2 /M faser og en samtidig økning i celler i G
0 /G
1 i forhold til kontrollene (fig. 4B). Eksogent oljesyre hadde en markert virkning på å gjenopprette cellesyklusen profilen til ACC-utarmet celler, ligner effekten på SCD1 inhiberte celler armerings konseptet at det endelige metabolske formålet med felles aktivering av ACC, FAS og SCD1 observert i kreftceller er produksjonen av MUFA.
H460 lungekreftceller ble behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT), 10 uM CP-640186 eller begge, i nærvær eller fravær av 100 pM palmitinsyre (Pal) eller oljesyre ( ole) (A), og celle-proliferasjon ble undersøkt etter 48 timer. Fordeling av celler i cellesyklusfaser ble bestemt ved fluorocytometry i celler inkubert med CP-640186 pluss eller minus 100 uM oljesyre og (B). Kreftcelle proliferasjon ble også bestemt etter behandling med 1 mM CVT-11127 (CVT), 20 uM CP-640186, eller begge, i nærvær eller fravær av 100 pM palmitinsyre (Pal) eller oljesyre (Ole) (C), og i cellene ble behandlet i 48 timer med 1 pM CVT-11127, 25-Hydroxycholesterol eller begge deler, pluss eller minus 100 uM oljesyre (D). I alle forsøkene mottok kontrollceller ekvivalente mengder av DMSO kjøretøy. *, P 0,05 eller mindre i forhold til DMSO; **, P 0,05 eller mindre sammenlignet med CVT-behandlet kontroll av Student t test
Interessant, co-behandling med CVT-11127 og CP-640186 forsterket ikke veksthemmende virkning av. hver av disse forbindelser, noe som tyder på at inhibering av enten ACC eller SCD1 påvirker en felles produkt av veien. Siden SCD1 er senere i fettsyre-biosyntese-veien MUFA er fettsyre kritiske for celleproliferasjon. Faktisk, i celler inkubert med både ACC og SCD1 inhibitorer, oljesyre var i stand til fullt ut å gjenopprette den lave celleformeringshastigheten av H460-celler for å kontrollere verdier. Disse dataene understøtter den konklusjon at MUFA er de funksjonelle sluttproduktet (r) av fettsyren biosyntesen som er nødvendig for kreftcellevekst.
lipidbiosyntese i pattedyrceller blir styrt av den transkripsjonelle faktorer SREBP-1a og SREBP 1C, som er sentrale regulatorer av fettsyre og fosfolipid syntese i pattedyrceller [18], [19]. Induksjon av lipogenese i humane ikke-transformerte celler og kreftceller krever SREBP-1-aktivering [20] – [22], bestemmes derfor vi effekten av nedregulering av lipogenese ved SREBP-en inaktivering på celle-proliferasjon. H460-celler ble inkubert med den SCD1 inhibitor i 48 timer i nærvær eller fravær av 25-Hydroxycholesterol, en potent inhibitor av SREBP-1-aktivering og spaltning av SCAP [19]. Inkubering med 25-Hydroxycholesterol alene påvirket ikke kreftcellevekst, men ko-behandling av celler med hydroxysterol og CVT-11127 fremmet en dypere veksthemmende virkning enn med de SCD1 inhibitor alene, en effekt trolig på grunn av en forsterkning av den anti -lipogenic aktivitet av begge inhibitorer (fig. 4D). I samsvar med våre tidligere observasjoner, var nok til å overvinne cytostatisk effekt av både SCD1 hemming og kombinert SCD1 hemming og nedregulering av lipid syntese, noe bekrefter viktigheten av både lipid syntese og fettsyre desaturation ved SCD1 i å gi underlag 100 mikrometer oljesyre for kreftcellevekst.
til slutt ytterligere bevis på at aktiv lipid formasjonen er et nøkkeltrinn i regulering av celleproliferasjon ved SCD1 ble oppnådd ved å undersøke det relative innhold av større lipider i cellene som gjennomgår inhibering av SCD1 og behandlet med eksogene fettsyrer. Som vist i fig. 5A, blokade av SCD1 med CVT-11127 ført til en betydelig reduksjon av hoved nøytrale lipider, CE og TAG mens totale fosfolipider ble noe redusert. Inkubasjon av SCD1-utarmet celler med 100 mikrometer oljesyre dramatisk økte nivåene av TAG med 4,4 ganger i løpet av kontrollverdier (Fig. 5B). Tilsetning av oljesyre fullt ut gjenopprettes redusert innhold av CE i SCD1-manglende celler (fig. 5C), mens det returnerte fosfolipid-nivåer (fig. 5D) for å styre verdier. Til sammen disse observasjonene forsterke forestillingen om at SCD1 bestemmer frekvensen av cellesyklusprogresjon og programmert celledød, og til slutt, spredning av kreftceller ved å opprettholde aktiv lipid syntese og cis-MUFA produksjon.
H460 lungekreftceller ble behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT) i 48 timer i nærvær eller fravær av 100 pM oljesyre (Ole). Totale celle lipider ble ekstrahert, separert ved hjelp av TLC og farget med jod damper (A). Relative nivåer av, triacylglyceroler (B), cholesterolesters (C), og fosfolipider (D), ble bestemt ved densitometrisk scanning. *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; **, P. 0,05 eller mindre vs CVT-behandlet kontroll av Student t test
Diskusjoner
I tidligere studier, rapporterte vi at genetiske og farmakologiske ablasjon av SCD1 alvorlig svekker muligheten av kreftceller til å spre [12]. I dette arbeidet, gir vi et nytt bevis på at SCD1 styrer frekvensen av kreft celle mitogenesis ved å modulere cellecyklusprogresjonen. Vår observasjon at kreftceller behandlet med en farmakologisk inhibitor av SCD1 blir arrestert i G
en fase, og at denne effekten er gjenopprettet av oleinsyre antyder at MUFA syntese er nødvendig i de tidlige fasene av cellesyklusen. Videre hemming av ACC, og FAS, to viktige enzymer i syntesen av fettsyrer, fremkalte en lignende blokade i progresjonen av cellesyklusen via G
1 /S-grensen [16], [23], [24] . Disse observasjoner tyder på at en felles aktivering av SFA-syntese og påfølgende omdannelse av SFA inn i MUFA er nødvendig for å tilveiebringe fosfolipidet biosyntetiske maskiner med MUFA substrater for ny syntese membranen før eller under den syntetiske fasen av cellesyklusen. Faktisk elegante studier av Jackowski [25], [26] avslørte at oppbyggingen av nye fosfolipider for delende celler er et resultat av forhøyet syntese og omsetning som oppstår under G
1 og tidlig S-fase.
Våre data antyder også at SCD1 kan kontrollere cellesyklusprogresjon ved å endre nivået av cyklin D1 og CDK6, to proteiner hvis ekspresjon og interaksjons er kritiske for passasje av sykkel cellene gjennom G
1 /S overgang [27]. SCD1 aktivitet kan indirekte regulere innholdet i disse cellesyklusproteiner ved modulering av GSK3P, en nedstrøms mål for Akt bane som øker nedbrytningen av cyclin D1 [28]. Vi har tidligere rapportert at inhibering av ekspresjon SCD1 inaktiverer Akt og øker defosforylering og aktivering av GSK3p. Endringer i den biokjemiske sammensetningen og dermed biofysiske egenskapene til cellulære membrandomener kan aktivere signaloverførings og transkripsjons trasé som modulerer mitogenesis [3]. Kontroll av SFA og MUFA balanse ved SCD1 synes å være en kritisk modulator av vekstsignaler i humane celler [11], [12], men mekanismene gjennom hvilke dette enzymet koordinerer endringer i membran lipidsammensetning, membran-avledede signaler og deres nedstrømseffekter er fortsatt ikke fullstendig forstått.
Selv om kreftcellene formere gjennom vedvarende celledeling, antall prolifererende celler påvirkes også av graden av celledød. Foruten å favorisere en større hastighet på celle mitogenesis, gir vi bevis for at SCD1 er en viktig overlevelsesfaktor for kreftceller ved å hjelpe cellen unngå programmert celledød gjennom produksjon av cis-MUFA. SCD1 aktivitet kan forebygge kreft-celle apoptose ved minst to mekanismer: beskyttelse av SFA-formidlet toksisitet eller lipoapoptosis [11], [29], og stimuleringen av cis-MUFA biosyntesen for celleproliferasjon. Høy konstituerende fettsyrer er vanligvis funnet i kreftceller [3], derav en tonically aktiv SCD1 kan forhindre de potensielt skadelige effektene av endogent SFA opphopning. Siden elaidinsyre, en trans-MUFA, bare svakt forhindres den cytotoksiske effekt av både SCD1-mangel og SFA, mens cis-MUFA fullstendig restaurert proliferasjon, synes det ikke å være noen fettsyre arter spesifisitet for den beskyttende virkning. Dette muligens skjer ved å forskyve MUFA SFA fra nøkkel cytotoksiske metabolske reaksjoner.
Aktiv lipogenese, særlig membranlipid-syntese, er et kritisk behov for kontinuerlig proliferasjon av cancerceller, og en mekanisme for å unngå inntreden i programmet av apoptose [ ,,,0],30]. Vi har tidligere etablert at SCD1 styrer den totale frekvensen av lipidsyntese i lungekreftceller [9], [11], [12]. Resultater fra dette arbeidet forsterke konseptet at SCD1 kan få tak celleproliferasjon ved å påvirke fettsyre biosyntetiske hastighet [12]. Vi har observert en signifikant reduksjon i proliferasjon av H460-celler i nærvær av et ACC-inhibitor og anti-proliferativ effekt som kan henføres til defekte fettsyre syntese kan bli reddet av både oleinsyre (MUFA) og palmitinsyre (SFA). Disse funnene er enig med tidligere rapporter som viser at cellevekst arrest i ACC utarmet celler kan bli reversert av eksogene palmitinsyre [16], [17].
