Abstract
kromosom 8q24 er ofte forsterket i mange typer kreft, særlig lungekreft. Polymorfismer i denne regionen er forbundet med risiko for ulike kreftformer. For å undersøke sammenhengen mellom tre enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) (rs1447295, rs16901979 og rs6983267) på 8q24 og risikoen for lungekreft, gjennomførte vi en forening studie i to Han-kinesere populasjoner: en befolkning var fra Zhejiang-provinsen (576 hvis pasienter og 576 kontroll fag), mens den andre var fra Fujian-provinsen (576 hvis pasienter og 576 kontrollpersoner). Vi fant at rs6983267 var signifikant assosiert med økt risiko for lungekreft i begge populasjonene. Sammenlignet med TT genotype ble GG genotype assosiert med en betydelig 1,555 ganger økt risiko for lungekreft [95% konfidensintervall (KI) 1,218 til 1,986,
P
= 4,0 × 10
-4 ]. Denne effekten var mer uttalt hos ikke-røykere [odds ratio (OR) = 2,366, 95% KI 1,605 til 3,488,
P
= 1,4 × 10
-5]. Analyser stratifisert ved histologi viste at rs6983267 GG genotype ble mest assosiert med pasienter med andre histologiske typer (OR = 3,012, 95% KI 1,675 til 5,417,
P
= 2,3 × 10
-4). AA genotype av rs1447295 var assosiert med økt risiko for adenokarsinom sammenlignet med CC genotypen (OR = 2,260, 95% KI 1,174 til 4,353,
P
= 0,015). Videre ble GG genotype av rs6983267 assosiert med dårligere overlevelse i Zhejiang befolkningen (hazard ratio (HR) = 1,646, 95% KI 1,099 til 2,464,
P
= 0,016). Det ble ikke observert for rs16901979. Disse resultatene tyder på at genetiske variasjoner på 8q24 kan spille viktige roller i utvikling og progresjon av lungekreft
Citation. Zhang X, Chen Q, han C, Mao W, Zhang L, Xu X, et al. (2012) Polymorfisme på 8q24 er forbundet med risikoen for lungekreft og overlevelse i Han-kinesere. PLoS ONE syv (7): e41930. doi: 10,1371 /journal.pone.0041930
Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Storbritannia
mottatt: Mai 10, 2012; Godkjent: 29 juni 2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Taizhou Science and Technology Agency (111ky07-7). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft dødsfall i både menn og kvinner over hele verden. I Kina sto for 536,407 nye tilfeller av kreft og 475,768 dødsfall er registrert i 2005 lungekreft [1]. De siste tiårene har forekomsten og dødeligheten av lungekreft markant økt på grunn av aldringen av befolkningen og kontinuerlig økning i tobakksforbruket i Kina [1], [2], [3], [4]. Selv om sigarettrøyking er en vesentlig årsak til lungekreft og bidrar til mer enn 80% av tilfellene [5], bare en liten brøkdel av røykere utvikle lungekreft. Dette funn tyder på at genetiske faktorer påvirker også risikoen for lungekreft. Selv om forsøk har vært gjort for å identifisere genetiske faktorer for lungekreft, til dagens kunnskap vurdere risikoen for lungekreft er fortsatt begrenset.
Nylig har noen genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) fant at varianter på kromosom 8q24 er beslektet til risikoen for flere kreftformer, inkludert bryst, prostata, blære, kolorektal, og eggstokk-kreft, mellom flere lære populasjoner [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12 ], [13], [14], [15], [16], [17]. I tillegg er varianter på 8q24 har blitt funnet å være assosiert med mottakelighet for øvre gastrointestinal kreft [18], [19], [20], osteosarkom [21], skjoldbruskkjertelkreft [22], [23], [24], og kreft i hjernen [25]. Dette område strekker seg over omtrent 600 kb, og er ansett som en gen-fattig område, med relativt få predikerte gener, inkludert DQ486513, CB104826, og DQ515897, samt pseudogen POU5F1P1. Proto-oncogene v-myc oncogen homolog myelocytomatosis viral (avian) (MYC) har blitt bestemt å være kreftrelatert gen nærmest regionen assosiert med kreft i GWAS. Transkripsjonsforsterkere i denne regionen har vist seg å fysisk samhandle med MYC promoter [26], [27] og potensielt bli berørt av kreft-assosiert varianter [28].
Tre tilstøtende genomiske blokker (regionene 1-3 ) på 8q24 har vært forbundet med prostatakreft risiko [29]. De mest betydningsfulle enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) er rs1447295 i region 1, rs16901979 i region 2, og rs6983267 i region 3 [29]. Disse SNPs og ekstra 8q24 varianter som er validert av påfølgende assosiasjonsstudier. Videre har disse SNPs blitt funnet å være assosiert med andre typer kreft [8], [9], [18], [19], [20], [21], [30]. Siden 8q24 kromosomale regionen er ofte forsterkes i lungekreft vev [31], [32], [33], [34], genetiske varianter på 8q24 kan være forbundet med lungekreft følsomhet. Videre kan SNP’er på 8q24 påvirke uttrykket nivåer av kreft-relaterte gener [26], [27], [35], som antas å spille roller i lungekreft carcinogenesis. I denne studien, valgte vi en SNP fra hver region for å vurdere potensialet sammenslutning av disse SNPs med lungekreft i Han-kinesere.
Resultater
Befolknings egenskaper
Egenskapene av lungekreftpasienter og kontrollpersoner som deltok i denne studien er oppsummert i Tabell 1. Flere menn enn kvinner var blant de saks pasienter og kontrollpersoner, men kjønnsforskjellene mellom disse gruppene var ikke signifikant (
P
0,05). Histologisk type lungekreft mellom to pasientgruppene var ikke signifikant forskjellig (
P
0,05), men signifikante forskjeller i scenen og karakteren ble oppdaget (alle
P
0,05).
Association analyse av rs1447295, rs16901979, og rs6983267 på 8q24
genotypen fordelinger av SNPs rs1447295, rs16901979 og rs6983267 var i Hardy-Weinberg likevekt (HWE) i begge tilfeller, og kontroller. I testsettet, hyppigheten av de rs6983267 GG genotype var markert høyere hos lungekreftpasienter (24,9%) enn hos kontrollpersonene (20,5%) (Tabell 2). GG genotype ble assosiert med et beskjedent økt risiko [odds ratio (OR) = 1,532, 95% konfidensintervall (KI) 1,090 til 2,153,
P
= 0,014]. Tilsvarende i valideringssettet ble rs6983267 GG genotype assosiert med en 1,591 ganger økning i risikoen for lungekreft (
P
= 0,010). Selv om det ikke er statistisk signifikant, den rs6983267 GT genotype også økt risiko for lungekreft (
P
= 0,062). Men det var ingen signifikante forskjeller mellom de to gjenværende SNPs (rs1447295 og rs16901979) og lungekreft i begge populasjoner. Den endelige samlet analyse viste at rs6983267 GG genotype (OR = 1,555, 95% KI = 1,218 til 1,986,
P
= 4,0 × 10
-4) og GT genotype (OR = 1,311, 95% KI = 1,066 til 1,613,
P
= 0,01) var assosiert med signifikant økt risiko for lungekreft. Etter at GG og GT genotyper ble kombinert, forble forskjellen statistisk signifikant (OR = 1,386, 95% KI = 1,141 til 1,684,
P
= 0,001). Videre forble signifikant foreningene selv etter Bonferroni korreksjon (dvs.
P
0,05 /3 = 0,0167).
Analysene stratifisert ved histologi ved hjelp sammenslåtte kasus-kontrollsett viste at rs1447295 AA genotype samt rs6983267 GG og GT genotyper ble assosiert med en svak, men signifikant økning i risiko for adenokarsinom justert for alder, kjønn og røykestatus (OR = 2,260, 95% KI 1,174 til 4,353,
P
= 0,015; OR = 1,330, 95% KI 1,003 til 1,763,
P
= 0,048; OR = 1,327, 95% KI 1,049 til 1,679,
P
= 0,018, henholdsvis) (tabell 3). Den rs6983267 GG genotype ble assosiert med plateepitelkarsinom risiko (OR = 1,775, 95%
CI
1,201 til 2,625,
P
= 0,004). I tillegg personer med rs6983267 GG eller GT genotype ble på betydelig økt risiko for andre typer lungekreft (OR = 3,012, 95% KI 1,675 til 5,417,
P
= 2,3 × 10
-4 ELLER = 1,986, 95% KI 1,157 til 3,408,
P
= 0,013, henholdsvis), inkludert adenosquamous karsinom og udifferensiert karsinom. Men ingen sammenheng ble observert for rs16901979.
Vi undersøkte sammenhengen mellom de tre SNPs og lungekreft stratifisert etter røykeatferd i alle personer (tabell 4) videre. Den rs6983267 GG genotype var signifikant assosiert med høyere risiko for lungekreft hos ikke-røykere, men ingen sammenheng ble observert i tidligere og nåværende-røykere. Dessuten var det en liten, men signifikant forskjell i hyppigheten av rs6983267 GT genotype mellom saker og kontroller i dagens-røykere (OR = 1,446, 95% KI 1,032 til 2,027,
P
= 0,032). Det var imidlertid ingen signifikant interaksjon mellom røyking status og genotype i lungekreft mottakelighet. Siden antallet av tidligere-røykere i denne studien var liten, og frekvensen av den rs1447295 AA-genotype var lav, kombinert vi AA og AC genotypgruppene inn i en. Logistic analyse viste at AA og AC kombinert hadde en lavere risiko for lungekreft enn CC genotype (OR = 0,478, 95% KI 0,254 til 0,898,
P
= 0,022). Ingen annen signifikant sammenheng ble observert mellom rs16901979 og risikoen for lungekreft, stratifisert etter røykestatus.
Association of rs1447295, rs16901979, og rs6983267 med overlevelse
Alle pasienter med lungekreft ble inkludert i overlevelsesanalyse. For rs6983267, ble en forening med lungekreft overlevelse observert i Zhejiang befolkningen. Personer med GG genotype hadde en median overlevelsestid (MST) på 17,6 måneder, de med GT genotype hadde en MST på 18,6 måneder, og de med TT genotype hadde en MST på 24,4 måneder (log-rank test,
P
= 0,036) (figur 1A). I Cox modell, fant vi at hasardratio (HR) var signifikant høyere for personer med GG genotype sammenlignet med de med TT genotype etter justert for alder, kjønn, røykestatus, tumor stadium, histologi og histologisk Karakter ( HR = 1,646, 95% KI 1,099 til 2,464,
P
= 0,016) (tabell 5). Overlevelsen var dårlig, spesielt for pasienter med stadium III eller IV tumor (HR = 1,993, 95% KI 1,128 til 3,521,
P
= 0,018) (figur 1B). Ingen annen SNP ble funnet å være assosiert med overlevelse. Ingen sammenheng med overlevelse i Fujian befolkningen ble observert
A:. Alle lungekreftpasienter. B:. Pasienter med stadium III-IV svulster
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi om SNPs på kromosom 8q24 relatert til mottakelighet for bryst, prostata, blære , kolorektal, skjoldbruskkjertelen, og eggstokk-kreft [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16 ], er [23] også forbundet med risiko for lungekreft i Han-kinesere populasjoner. Vi fant at GG genotype av rs6983267 var signifikant assosiert med økt risiko for lungekreft og redusert overlevelse i Han-kinesere.
8q24 aberrasjon er en hyppig hendelse i lungekreft [31], [32], [33] , [34]. MYC, lokalisert på 8q24.1, er en veletablert onkogen involvert i cellevekst, spredning, differensiering og apoptose. Deregulert overekspresjon av MYC er ansvarlig for et bredt spekter av kreft hos mennesker. Den rs6983267 ligger 335 kb oppstrøms fra MYC-genet. Nyere studier har vist at rs6983267 kart til transkripsjonsfaktor 7-lignende 2 (TCF7L2) motiv og former langtrekkende interaksjoner med MYC [27], [36]. Sammenlignet med T-allelen av rs6983267, har G-allelet blitt rapportert å ha sterkere TCF7L2 binding in vitro og in vivo, og for å forbedre Wnt aktivitet [36], [37]. Videre har mange studier vist at GG genotypen til rs6983267 er forbundet med en betydelig høyere risiko for flere krefttyper [9], [30], [38]. Park et al. [20] rapporterte ingen sammenheng mellom rs6983267 (OR = 1,02,
P
= 0,80) og lungekreft, men fant at GG genotype økte risikoen for lungekreft hos kvinner-røykere (OR = 1,45,
P
= 0,024). Wokolorczyk et al. [38] undersøkte 738 lungekreftpasienter og 1910 kontrollpersoner og fant at rs6983267 GG genotype ikke var signifikant assosiert med risiko for lungekreft sammenlignet med TT genotypen (OR = 0,98,
P
= 0,9). Imidlertid har denne foreningen ikke blitt vurdert på kinesisk. I denne studien undersøkte vi tre SNPs (rs1447295, rs16901979 og rs6983267) og fant at bare rs6983267 var signifikant assosiert med økt risiko for lungekreft i Han-kinesere. Disse funnene var forskjellig fra tidligere studier der var det ingen signifikante sammenhenger mellom rs6983267 og lungekreft [20], [38]. Siden effekten av en lav pene mottakelighet genet på sykdomsrisiko kan modifiseres av andre gener så vel som av miljømessige faktorer, kan etniske forskjeller i genetiske bakgrunn og ulike risikofaktorer forklare, til en viss grad, de avvikende resultater. Videre rs6983267 ble mest signifikant assosiert med andre histologiske typer lungekreft, etterfulgt av plateepitelkarsinom, og svakt, men signifikant assosiert med adenokarsinom. Disse resultatene indikerte at forskjellige mekanismer kan eksistere i molekyl patogenesen av de forskjellige histologiske typer av lungekreft.
Eksponering for tobakk karsinogener indusere alvorlig DNA-skade og således fremme tumordannelse. I denne studien fant vi at den økte risikoen for lungekreft med rs6983267 GG genotype var mer uttalt blant ikke-røykere, mens ingen signifikante korrelasjoner ble funnet i Strøm- og tidligere-røykere. En mulig forklaring på dette er at aldri-røykere kan være mer sannsynlig å ha blitt utsatt for ukjente risikofaktorer knyttet til lungekreft, for eksempel miljøgifter. Det kan eksistere forskjellige karsinogenisitetsstudier mekanismer mellom aldri og Strøm- /former- røykere. Vårt resultat er forskjellig fra forrige undersøkelse, der rs6983267 GG var en risikofaktor i stadig røyker [20]. Ulike studiepopulasjoner og analytiske tilnærminger kunne redegjøre for de motstridende resultater. I tillegg fant vi en signifikant sammenheng av A-allelet av rs1447295 med en lav risiko for lungekreft i tidligere-røykere. Imidlertid fant Park et al at dette allelet var assosiert med en høyere risiko for leverkreft hos kvinner-røykere [20]. Siden antallet tidligere-røykere i denne populasjonen var svært lite for en case-control forening studie, våre funn på A-allelet av rs1447295 er mest sannsynlig falsk positiv på grunn av flere sammenligninger. Det bør utvises forsiktighet med å tolke dette resultatet, selv om det er statistisk signifikant. Videre studier med et større antall fag er nødvendig for å bekrefte disse funnene.
MYC forsterkning har vist seg å være korrelert med dårlig prognose av pasienter med lungecancer [31], [32], [34]. Da risikoen allel rs6983267 G har vist seg å ha en sterkere affinitet til TCF7L2 og kan indusere forbedret MYC uttrykk [27], [36], rs6983267 kan være forbundet med overlevelse hos pasienter med lungekreft. I denne studien fant vi at rs6983267 GG genotype var forbundet med markert dårligere overlevelse i Zhejiang befolkningen. Denne effekten var mer uttalt i pasienter med stadium III eller IV tumor. Dette resultatet er i samsvar med de funksjonelle konsekvenser av denne polymorfisme. I kontrast, ble ingen sammenheng finnes mellom rs6983267 og overlevelse i Fujian befolkningen. En del av denne forskjellen kan forklares ved de ulike prosenter av sykdom scenen og histologisk grad, samt de ulike behandlingsmetoder som brukes. Cicek et al. undersøkte 393 pasienter med tykktarmskreft og fant ingen sammenheng mellom rs6983267 og overlevelse [39]. Men Dai et al. undersøkte 170 pasienter med kolorektal kreft og funnet ut at T-allelet var assosiert med dårligere overlevelse [40]. Disse resultater antyder at en mer kompleks eller tumorspesifikke forhold kan forekomme. Som vår studie var begrenset til Han-kinesere med lungekreft, kan resultatene ikke kunne generaliseres til andre etnisiteter. I tillegg er prøvestørrelsen for overlevelsesanalyse var forholdsvis liten, for derved å spørre forsiktig tolkning av resultatene. Videre forskning i en større befolkningsgruppe er nødvendig for å avklare dette forholdet.
I sammendraget, resultatene av vår studie antyder at SNPs på 8q24 er forbundet med mottakelighet for lungekreft i Han-kinesere. I tillegg ble rs6983267 GG genotype assosiert med dårlig overlevelse i Zhejiang populasjonen. Så vidt vi vet, er dette den første studien som undersøkte potensielle assosiasjoner mellom SNPs på 8q24 og lungekreft i en populasjon fra Øst-Kina. Andre store studier er garantert å forbedre vår forståelse av bidrag fra genetiske faktorer til lungekreft.
Materialer og metoder
Fag
I denne studien utførte vi en forening studie i to uavhengige sett med fag. Testen sett inkludert 548 lungekreftpasienter og 556 kontrollpersoner. Saken pasienter hadde diagnosen lungekreft bekreftet på histologi og ble rekruttert fra Taizhou Central Hospital, Zhejiang, mellom 2003 og 2010. De kreftfrie kontrollpersoner var sykehus besøkende som kom til helseundersøkelse klinikken for en årlig sjekk opp mellom 2007 og 2010. validering sett besto av 453 lungekreftpasienter og 507 kontrollpersoner fra Fujian-provinsen. Saken pasientene var påfølgende pasienter med histologisk bekreftet lungekreft meldt fra Fuzhou Lunge Hospital mellom 2008 og 2010. kontroll fag var kreftfrie individer valgt fra en pool av friske frivillige som besøkte sykehuset i løpet av 2008-2010. Epidemiologiske data ble samlet inn av opplært intervjuere som ikke var klar over gruppeoppgaver ved hjelp av en bestemt standardisert spørreskjema for å få detaljert informasjon om deltakerne demografiske faktorer, personlige vaner, medisinsk historie, familiehistorie med kreft, samt historie av yrkesmessig og miljømessig eksponering . Forsøkspersonene ble klassifisert i tre grupper basert på deres røykestatus. Aldri-røykerne var de som indikerte at de hadde røykt mindre enn 100 sigaretter i løpet av livet, og var ikke aktuelle-røykere. Røykere ble klassifisert i tidligere røykere og nåværende røykere. Tidligere-røykerne var de som rapporterte å røyke minst 100 sigaretter i løpet av livet, og var ikke aktuelle-røykere, mens omløps-røykerne var de som rapporterte at de var fortsatt røyke på tidspunktet for deres lunge kreftdiagnose. Personer som er kjent for å ha en familiehistorie med kreft, ble en historie til kreft enn lungekreft, eller spredning kreft fra andre eller ukjent opprinnelse ekskludert. De kontrollpersoner var frekvens tilpasset sakens pasienter basert på kjønn og alder (± 5 år). Alle case pasienter og kontrollpersoner var urelaterte etniske Han-kinesere. Denne studien ble godkjent av etikkomiteer av Taizhou Central Hospital og Fuzhou Lunge sykehus og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere før vi går i studien.
Våre endepunkt var total overlevelse fra første histologisk diagnose. Pasienter som var i live eller tapt for oppfølging ble sensurert på datoen for siste kontakt. De som døde av andre årsaker ble sensurert på datoen for sin død. Videre pasienter man ikke å følge opp i det første året ble ekskludert fra analysen.
Genotyping
Blodprøver ble samlet inn fra alle deltagerne. Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av Universal genomisk DNA Extraction Kit versjon 3.0 (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens protokoll, og DNA-prøver ble lagret ved -20 ° C.
Vi valgte den sterkeste single-foreningen SNPs fra hver kromosomale region: rs1447295 fra region 1, region 2 rs16901979 fra, og rs6983267 fra region 3. genotyping ble utført ved polymerase-kjedereaksjon-ligeringsdeteksjonsaksjon (PCR-LDR) -metoden. Primere ble designet av programvare fra Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). De tre primerpar er som følgende: 1) rs1447295: 5′-GCCTACGCCTACTCCTGGTCT-3 «(fremover) og 5′-CTCCCAGATTTTCCCATACCC-3′ (bakover); 2) rs16901979: 5»-AGTGTGGGGTCTTTGTTGTGG-3 «(fremover) og 5’CAGCAGTCTCCCTGTCTTTGG-3» (bakover); 3) rs6983267: 5’ATGAAGGCGTCGTCCAAATGA -3 «(fremover) og 5’TTGGCTGGCACTGTCTGTATA -3» (bakover). Amplifiseringsreaksjoner ble utført i et endelig reaksjonsvolum på 15 pl inneholdende 0,3 mmol /L av hver deoxynucleosid trifosfat, 10 mmol /liter Tris-HCl, 50 mmol /L KCI, 2 mmol /l MgCl2, 20% Q-løsning (Qiagen, Hilden, Tyskland), 0,16 umol /L av hver primer, 10 ng genomisk DNA, og en U Taq (Takara, Dalian, Kina). Syklusparametrene var: 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 10 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 64 ° C i 30 s med en 0,5 ° C minke glødetemperaturen per syklus og 72 ° C i 30 s, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 59 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, og en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 5 minutter. Etter amplifikasjon ble PCR produktene inkubert med to U reker alkalisk phosophatase (Fermentas, Vilnius, Litauen) og 4 U eksonuklease I (Fermentas, Vilnius, Litauen) ved 37 ° C i 1 time, og deretter denaturert ved 95 ° C i 10 min .
LDR primere var: 1) rs1447295: 5′-GTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAA-3 «(A spesifikk primer), 5′-TTTGTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAC-3′ (C-spesifikk primer) og 5»-GTGCTATGGAAAAAAAGCAACAGGA-FAM-3- «(vanlig FAM merket 3′-ende primeren); 2) rs16901979: 5»-TTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATA-3 «(A spesifikk primer), 5′-TTTTTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATC-3′ (C-spesifikk primer) og 5»-TCTGGCAAATGGTATTTTTGAGATATTT-FAM-3 «(vanlig FAM merket 3′-ende primeren); 3) rs6983267: 5»-TTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGG-3 «(G spesifikk primer), 5′-TTTTTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGT-3′ (T spesifikk primer) og 5»-CACTGAGAAAAGTACAAAGAATTTTTTTTTTT-FAM-3 «(vanlig FAM merket 3»-ende primeren). En blanding inneholdende 7,5 pmol av hver felles FAM-merket LDR-primer ble fosforylert i 15 pl kinase-reaksjonsblanding inneholdende 1 x T4 ligasebuffer og 10 U av T4 kinase (Takara, Dalian, Kina). Blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av 10 minutter ved 65 ° C og lagring ved 4 ° C. LDRs ble utført i et sluttvolum på 20 ul, inkludert 9 pl av renset PCR-produkt, 1 x Taq DNA-ligase-buffer, 250 fmol av hver LDR primer, 8-ligase U Taq DNA (New England Biolabs, Beverly, Mass, USA). LDR parametrene var som følger: 30 sykluser på 30 sek ved 94 ° C og 4 min ved 55 ° C. LDR produktene ble analysert på ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA).
Nitti seks tilfeldig valgte prøver ble vurdert på nytt ved hjelp av DNA-sekvensering for å bekrefte nøyaktigheten av den PCR-ligeringspåvisningsreaksjon genotyping metoden, resultatene av disse studiene var i overensstemmelse med genotypene identifisert ved direkte sekvensering. I tillegg ble 96 tilfeldig utvalgte prøver genotypet i to eksemplarer og ga de samme resultatene (100% reproduserbarhet).
Statistisk analyse
hjelp av kvantitative variabler ble sammenliknet med Student
t
test. Fishers eksakte Chi-kvadrat test ble brukt for å sammenligne kategoriske variabler mellom case-pasienter og kontrollpersoner. HWE ble beregnet av Chi-kvadrat test for godhet passer i både pasient og kontrollgrupper. Korreksjon for multippel testing ble utført ved hjelp av Bonferroni metoden. For å evaluere forholdet mellom 3 SNP’er, og risikoen for lungekreft, ble ORS og deres 95% konfigurasjons estimeres ved multivariate logistikkregresjonsanalyse, justert etter alder, kjønn, og røyking status, for å evaluere forholdet mellom hver av de tre SNP og risikoen for lungekreft. Survival analyse ble utført ved hjelp av Kaplan-Meier metoden med log-rank test. Cox-modeller ble også brukt til å justere for alder, kjønn, røykestatus, tumor stadium, histologi, og histologisk grad.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle testene var tosidig, og alle statistiske analyser ble utført med SPSS 17.0 programvarepakke (SPSS Inc, Chicago, USA).
