Abstract
Soricidin er en 54-aminosyre peptid som finnes i den lamme gift av den nordlige kort-tailed spissmus (
Blarina brevicauda
) og har vist seg å hemme transient receptor potensielle av vallinoid type 6 (TRPV6) kalsiumkanaler. Vi rapporterer at to kortere peptider, SOR-C13 og SOR-C27, avledet fra C-terminalen av soricidin, er høy affinitet antagonister av menneskelige TRPV6 kanaler som er oppregulert i en rekke kreftformer. Heri, rapporterer vi molekylære avbildningsmetoder som viser
in vivo
diagnostiske potensialet i SOR-C13 og SOR-C27 å målrette svulst områder i mus med eggstokkene eller prostatakreft. Våre resultater tyder på at disse nye peptider kan tilveiebringe en vei for å levere diagnostiske og terapeutiske reagenser direkte til TRPV6 rike svulster og, som sådan, har mulige anvendelser for en rekke karsinomer inkludert ovarie, bryst, skjoldbruskkjertel, prostata og tykktarm, samt viss leukemi og lymfom
Citation. Bowen CV, DeBay D, Ewart HS, Gallant P, Gormley S, Ilenchuk TT, et al. (2013)
In Vivo
Detection of Human TRPV6-Rich Svulster med Anti-Cancer peptider avledet fra Soricidin. PLoS ONE 8 (3): e58866. doi: 10,1371 /journal.pone.0058866
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 02.11.2012; Godkjent: 07.02.2013; Publisert: 15 mars 2013
Copyright: © 2013 Bowen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Research Council Industrial Research Assistance program (IRAP) program (https://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/irap/index.html) og Atlantic Canada Opportunities Agency (ACOA) (http: //www.acoa-apeca.gc.ca/eng/Pages/Home.aspx) av regjeringen i Canada. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SG, TTI, TL, CR og JMS er ansatt i Soricimed Biopharma Inc. På tid til å utføre og tolke resultatene, HMS var en ansatt i Flyktninghjelpen. Novaceutics Consulting har ingen tilknytning til Soricimed. JMS har følgende patenter for å erklære: US 7.119.168 for peptider og metoder for behandling av kreft, utstedt 10 oktober 2006; US 7.273.850 for fremgangsmåter for å inhibere kalsiumopptaket ved en kreftcelle for å redusere celleproliferasjon ved administrering av hele eller en del av peptidet og fremgangsmåter for behandling av kreft, hvor kreftcellene viser økt ekspresjon av TRPV6, utstedt 25 september 2007; og US 8.211.857 for krav rettet mot et peptid som består av SOR-C13 eller SOR-C27, for kreftbehandling utstedt 3. juli 2012. JMS erklærer også ventende patenter utstedt i: US 13/526 045 for en videreføring av amerikanske 12/866 397 (US utstedt patent 8.211.857) etter metoder for å inhibere kalsiumopptak av kreftceller til å redusere celleproliferasjon og fremgangsmåter for behandling av kreft; Canada (CA 2718949), Europa (EU 09.721.272,4), Japan (JP 2011-500019), og Hong Kong (11.106.921,8) for PCT søknad til nasjonal fase rettet mot peptid bestående av SOR-C13 og SOR-C27; Canada 2.544.467 for peptid rettet farmasøytiske preparater og medisinske behandlinger; US 12/824935 for TRPV6-bindende peptider som omfatter hele eller deler av SOR-C27 konjugert til et biomolekyl. JMS erklærer PCT-søknader i landet fase i Canada (CA 2766272), Europa (EU 10.791.109,1), Hong Kong (serienummer 12.110.289,5), Japan (JP 2012-516450), Mexico (MX /a /2012/000086) og Brasil (PI1012676 -9). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
I Nord-Amerika, en i 70 kvinner vil utvikle eggstokkreft i deres levetid. Til tross for nylige fremskritt med identifikasjon, forblir ovariecancer fortsatt vanskelig å oppdage, og er vanligvis identifisert bare etter at den har spredning til andre deler av kroppen [1]. Prognose for tidlig påvisning er mellom 70% til 100% overlevelse; derimot, er 70% av tilfellene diagnostisert på avanserte stadier hvor 5-års overlevelse er bare mellom 15% og 25% [2]. Foreløpig foreligger ingen pålitelig ikke-invasiv påvisning test for eggstokkreft.
kalsiumkonsentrasjoner er nøye regulert innenfor cellulære avdelinger gjennom integrerte tiltak av ulike membrankanaler og pumper. I løpet av de siste årene enkelte medlemmer av en familie av kalsium ion tilstrømningen kanaler, kalt TRPV kanaler, har dukket opp som potensielle kreft biomarkører som kan være verdifull for utviklingen av forbedret svulstdeteksjon og /eller målrettet medikamentell behandling. I 1999 ble det rapportert nye kalsiumkanaler i kanin nyretubulene [3] og rotte-fordøyelseskanalen [4] betegnet ECaC1 og Cat1, henholdsvis, som lignet den capsaicin reseptor (vanilloid-reseptor, VR1) [5]. ECaC1, Cat1, og VR1 viste seg å henge sammen med den transiente reseptoren potensial (TRP) kalsiumkanal i
Drosophila
som formidler photoreception [6] – [8]. Hittil i minst 30 TRP kanal homologer er blitt identifisert i pattedyr, som er delt inn i seks hovedunderfamilier: TRPA (ankyrin), TRPC (kanonisk), TRPM (melastatin), TRPML (mucolipin), trpP (polycystin) og TRPV (vanilloid ) [9] – [11]. Den TRPV sub-familien består av seks medlemmer kalt TRPV1 til TRPV6. De første fire kanalene er nært beslektet og har roller i føler ulike innganger, inkludert strekningen, varme, syre, skadelige stimuli (nociception) og smerte [9], [11]. Disse kanalene utstillingen relativt lave selektivitet for kalsium ion (P
Ca /P
Na ~ 1 til ~15). I motsetning til dette, TRPV5 og TRPV6 er meget kalsium-ion-selektive (P
Ca /P
Na~100). Begge disse kanaler er uttrykt i apikale membraner av forskjellige vev innbefattende nyre, tarm, bukspyttkjertel og prostata [12] – [14]. For eksempel er TRPV5 uttrykt i de distale tubuli i nyrene, hvor den fungerer i reabsorpsjon av kalsium-ion fra pre-urin [12]; TRPV6 er dominerende i mage-tarmkanalen, hvor det er involvert i apikale inngang av kalsium [14]
TRPV6 er implisert i tumorutvikling og progresjon [15] -. [18]. Den TRPV6 protein er over-uttrykt i karsinomer av eggstokk og andre kreftformer som brystkreft, tykktarm, prostata og skjoldbrusk [14]. TRPV6 mRNA er forhøyet i ulike tumorcellelinjer inkludert de av tykktarmen, human leukemi og prostata [19] – [23]. I prostatakreft, er TRPV6 mRNA nivåer positivt korrelert til tumorprogresjon og aggressivitet som indikert av Gleason score, patologisk stadium og ekstra prostata metastaser [20], [24]. Faktisk TRPV6-positive prostatakreft har dårlig prognose på grunn av en tilbøyelighet til å invadere omkringliggende vev [25].
Koblingen mellom tumorvekst og over-uttrykk for TRPV6 kan medføre forsterkning av kalsiumavhengig celleproliferasjon og hemming av apoptose. Schwarz et al. [26] viste at lave doser av Econazole, en kapasitiv kalsium tilsig blocker, reduseres både kalsium tilsig signaler og celledeling i HEK-293 celler transfektert med TRPV6. I LNCaP prostatakreft-cellelinje, oppregulering av TRPV6 forsterker proliferasjon og celleoverlevelse mens retardering av apoptose via en mekanisme som synes å innebære aktivering av den nukleære faktor på aktiverte T-celle (NFAT) transkripsjonsfaktor [27]; reduksjon av TRPV6 med siRNA redusert spredning og økt apoptose. I brystkreftceller, reduserer tamoxifen ekspresjon av TRPV6 og kalsiumsignalering, en effekt som kan delvis forklare den anti-kreft-effekter av denne østrogen-antagonist [28]. Videre knockdown av TRPV6 med siRNA forbedret effektiviteten av tamoxifen. Således som antydet i en nylig publikasjon, inhibering av TRPV6 kanal har en ny terapeutisk strategi for behandling av tumorer over-uttrykker TRPV6 kanalen [29].
Soricidin (deponeringsnummer P0C2P6) er en ny paralytisk peptid isolert fra kjertler under spytt kjertler i den nordlige kort-tailed spissmus (
Blarina brevicauda
, en av de mest vanlige pattedyr i Atlantic Canada) og som er rapportert å hemme kalsiumopptak
via
TRPV6 kanaler [ ,,,0],30]. Deretter to peptidsekvenser fra C-terminalen av soricidin (SOR-C13 og SOR-C27, tabell 1) ble vist å binde TRPV6 i eggstokkreft celler med høy affinitet [31]. Heri, beskrev vi TRPV6 bindingsegenskapene til SOR-C13 og SOR-C27 og evnen av disse peptidene å målrette menneskelige ovarietumorer i en xenograft mus modell. Ved konjugering peptider med et fluorescerende fargestoff eller en magnetisk resonans imaging (MRI) kontrastmiddel, vi var i stand til å overvåke bioakkumulering og bio-fordeling av peptidene
in vivo
, til slutt tenkelig svulster uttrykker TRPV6. Disse funnene åpner nye diagnostiske og /eller terapeutiske veier for tidlig oppdagelse og behandling av ovarietumorer og potensielt andre TRPV6 rike tumorer inkludert de av bryst, tykktarm, prostata og skjoldbruskkjertelen, samt visse leukemi og lymfom.
Materialer og metoder
peptidene
De sekvenser av soricidin, SOR-C13 og SOR-C27 peptider er vist i tabell 1. peptidene ble utarbeidet av CanPeptide (Montreal, Canada ) ved fastfasesyntese. SOR-C13 og SOR-C27 viste den forventede molekylmasse ved time-of-flight massespektrometri (M
+ H
+ av 1566,42 og 2958,02) med peptid renhet (ved HPLC) på 96,9% og 96,8% henholdsvis . Peptidet Innholdet av det lyofiliserte hvitt pulver (trifluoracetat-salt) var 83,5% og 65,2%. Påfølgende peptid konsentrasjoner ble beregnet basert på gratis-basen peptid.
Løsning NMR strukturen SOR-C27
Prøvepreparering.
Nuclear magnetisk resonans (NMR) spektroskopiske data var anskaffet for å bestemme de konforme strukturelle trekk ved den SOR-C27 peptid under ulike forhold. En stamløsning (prøve nr 1) av 10 mM SOR-C27 ble fremstilt i 90/10 H
2O /D
2o med 50 mM kaliumfosfatbuffer ved pH 6,6. Fra sample # 1, ble ytterligere tre prøver forberedt: # 2) lager løsning med 200 mM NaCl, # 3) lager løsning med 100 mM dodecylphosphocholine (DPC) og # 4) stamløsning fortynnet til 2 mm med 100 mm natrium (SDS ). Prøve nr 1 ble kjøpt ved temperaturer mellom 274-308 K. peptid var fullstendig oppløselig i alle løsninger, og under alle forhold.
NMR spektroskopi.
For prøvene 1-3
1H NMR datasett ble oppsamlet på et DRX-500 spektrometer (Bruker BioSpin AG, Fällanden, Sveits) drevet ved 500,13 MHz ved anvendelse av en 1 mm OD H [CN] probe. For prøven 4,
1 H (og indirekte
13C og
15N) NMR datasett ble samlet på et AVANCEIII 700 spektrometer som opererer på 700,13 MHz ved hjelp av en 1,71 mm OD HC [N] sonde.
1H kjemiske skift ble referert til 2,2-dimetyl-2-silapentane-5-sulfonat gjennom vannet resonans kalibreres ved hver temperatur.
13C og
15N kjemiske skift ble indirekte referert gjennom
1 H henvisning.
For strukturbestemmelse med prøve 1 og 4, fase-følsomme 2D
1H
1 H NOESY datasett (120, 250 og 400 ms miksing tid) og
1H
1 H TOCSY (MLEV17; 120 ms miksing tid, sample 4 DIPSI-2; 90 ms blande tid) datasett ble tatt opp med en pre -saturation eller en myk puls for vann undertrykkelse. Datasett ble oppsamlet med 1024 x 380 komplekse punkter, apodized med et 70 ° forskjøvet sinus-squared-bell vindu-funksjon i begge dimensjoner, null fylt og lineære forutsagt i indirekte dimensjon for å gi en endelig 2D-spektrum på 2048 x 2048 virkepunkter.
Strukturell beregninger.
NMR spektra ble analysert, og topp-posisjoner og volumer bestemmes ved hjelp av Sparky 3,110 programvare som opererer på en Linux-PC-system. For strukturbestemmelse, ble alle ringsystemer identifisert gjennom kjemisk skift og karakteristiske TOCSY kryss peak mønstre. Sidekjede og tilbake bein resonanser Asn7, Thr9, Phe17 og Val23 lett ble tildelt fra deres unike mønstre TOCSY og hver rest forekommer bare en gang i sekvensen. Med utgangspunkt i disse rester, ble sekvensspesifikke oppgaver av ryggraden og sidekjede resonanser bestemt ved anvendelse av standardmetoder,
ie
å starte fra lett tilordnede rester, tilgrensende rester ble sekvensielt bestemt ved å følge H
α
i
-H
N
i + 1 Hotell og H
N
i
-H
N
i + 1
NOESY tilkoblinger. Når tilstøtende rester ble identifisert, ble lengre avstander NOESY forbindelser tildelt. For struktur beregninger av SOR-C27 i bufret vann, DPC og SDS miceller, avstand begrensninger ble bestemt fra integrering av kryss topper fra de 250 ms (eksempel 4; 200 ms) NOESY spekteret, og klassifisert i fire grupper: sterk, medium , svak og meget svak tilsvarende inter-proton avstand utvalgene av 2,3, 2.0-3.5, 3,3 til 5,0, og 4,8 til 6,0 å, henholdsvis
Alle strukturelle beregninger var basert på tidligere studier ved hjelp av XPLOR. 3.1 programvarepakken. I korte trekk ble en innledende tilfeldig kveil utvidet struktur som brukes til å generere en total av 50 integrerte strukturer. Tett kontakt ble fjernet av energi minimering av 1000 konjugat gradvise trinn før du går videre til de behersket simulert annealing molekyldynamikk (MD) beregninger. Åtte trinn som omfatter en total simulering av 120 ps ble anvendt for MD-simuleringene. Til å begynne med ble systemet satt til 1500 K, og alle styrke konstantene for limt, NOESY og ikke-bundede interaksjoner ble redusert til 10% av sin fulle verdi. Etter det tredje trinnet, hadde kraft konstantene er lineært skalert til sin fulle verdier. I de siste fem trinn ble temperaturen sunket jevnt til 300 K. Beregnede strukturer ble deretter energi minimert med 2000 konjugat gradvise trinn.
Diffusion bestilt spektroskopi (DOSY) er i stand til nøyaktig å bestemme diffusjon konstanter av molekyler i løsning . DOSY data ble kjøpt for SOR-C27 /SDS prøven. De 3 kDa SOR-C27 peptider og 80 kDa SDS miceller har lignende diffusjon priser konsistente med sterk binding av peptidet til SDS miceller.
Kultur cellelinjer
Transfeksjon og overekspresjon av TRPV6 i HEK-293-celler.
Humant HEK-293-celler (6-9 passasjer) ble sådd ut i en 24-brønns plate ved en densitet på 5 x 10
5-celler per brønn, 24 timer før transfeksjon . Hver brønn ble fortynnet i serumfritt medium og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og deretter kombinert langsomt og inkubert ved romtemperatur. Etter en 20 minutters inkubasjon ble cellene eksponert for transfeksjon kompleks som består av 0,5 mikrogram av PDI-CAT-L plasmid DNA (en gave fra Dr. V. Flockerzi, experiment und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität des Saarlandes [23]) og 1,5 mL lipofektamin 2000 reagens. PDI-CAT-L er en bicistronisk ekspresjonsvektor som inneholdt cDNA for proteinet-kodende område av TRPV6 og det muterte grønt fluorescerende protein (S65T; EGPF) adskilt av et indre ribosom-uttrykk området (β-actin promoter /KOZAK /TRPV6 /IRES /EGFP i pCAGGS) [23]. Den IRES ble avledet fra encefalomyocardittvirus [32]. Transfeksjon av HEK-293-celler med den bicistronisk vektor muliggjør for samtidig produksjon av TRPV6 og EGFP og seleksjon av celler som produserer fluorescerende TRPV6 for de elektrofysiologiske målinger. Fra tidligere undersøkelser ved hjelp av dette plasmid og andre lignende plasmider, ble det fastslått at TRPV6 kanalen er sterkt uttrykt, lokalisert ved membranoverflaten, glykosylert og konstitutivt aktiv gir opphav til en Ca
2 + -invoked innover strøm [33] – [35].
kultur av kreftcellelinjer.
Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Cell Collection og dyrket ved de anbefalte betingelser for 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. SKOV-3 (ATCC, HTB-77) er en tumorcellelinje opprinnelig avledet fra asket fluid fra et kvinnelig emne med en ovarial tumor. De ble dyrket i McCoys 5a-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). DU145 (ATCC, HTB-81) er en svulst cellelinje avledet fra en hjerne lesjon av en mannlig emne med metastatisk prostatakreft. De ble dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (ATCC) supplert med 10% varme-inaktivert FBS. Skov-3 og DU145 er tumorigent i CD-1 nakne mus, danner primære eggstokkene og prostata adenokarsinomer, henholdsvis.
TRPV6 elektrofysiologi.
Hel-celle patch clamp opptakene ble utført på HEK-293 celler som uttrykker TRPV6 og EGFP. Transfekterte celler ble lett identifisert fra ikke-transfekterte celler ved anvendelse av en fluorescerende Axiovert 135 mikroskop (Olympus). Opptakene ble utført ved hjelp av en Axopatch 1D forsterker styres og overvåkes ved hjelp pClamp 9 programvare (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Datasettene ble digitalisert ved 20 kHz og filtrert ved 2 kHz. Patch pipetter ble trukket fra borsilikatglass ved hjelp av en P-80C pipette avtrekker (Sutter Instrument, San Rafael, CA, USA), og hadde en motstander av 2-4 Megohm når de er fylt med pipette løsning som inneholder: 145 mM cesium-metansulfonat, 8 mM NaCl, 1 mM MgCl
2, 3,64 mM CaCl
2, 10 mM HEPES og 10 mM EGTA (for å bufre den intracellulære Ca
2+) med pH ble justert til 7,2 ved hjelp av CsOH. Det ekstracellulære oppløsning inneholdt: 145 mM NaCl, 10 mM CsCl, 10 mM CaCl
2, 2 mM MgCl
2, 2,8 mM KCI, 10 mM HEPES og 10 mM glukose med pH justert til 7,2 med NaOH
for å isolere TRPV6 strømmer, HEK-293 og transfekterte HEK-293-celler ble spennings klemmes ved 50 mV med en 50 ms lineær rampespenning (-110 mV til 90 mV) protokoll anvendes i nærvær eller fravær av en TRPV6 inhibitor, La
3 + ioner (10 mm), SOR-C27, SOR-C13 eller SOR-C27-Cy5.5. Selv om La
3 + ion er en ikke-spesifikk hemmer det er for tiden ingen kjent selektiv inhibitor av TRPV6 kanalen. Rampen ble fordelt på 10 ganger på 2 sek intervaller mellom ramper.
Analysen ble utført off-line hjelp IGOR (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR, USA) programvare. Den statistiske signifikans ble bestemt med sammenkoblede Studentenes t-test (to-halet). Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM med en
p
-verdi av. . 0,05 ansett som signifikant
Imaging studier
Produksjon av svulster for imaging studier
i likhet med tidligere undersøkelser, ble CD-en naken mus (6-8 uker gamle, Charles River) som brukes for fluorescerende merking (hannmus) og MR (hunnmus) studier [36], [37]. Mus ble plassert i bur i grupper på tre til fem, og holdt på en 12 timers lys /mørke plan ved 22 ° C og relativ fuktighet på 50 ± 5%. Sterilisert mat og vann var fritt tilgjengelig. Subkutan svulst implantasjon ble utført på mus under lett isofluorane anestesi. SKOV-3 eller DU145 (6 x 10
6 celler /50 ul Matrigel fortynning 1:01 i saltløsning) ble implantert i venstre flanke av musene anvendt i fluorescens studien, mens 1 x 10
7 SKOV-3 cellene ble injisert i mus som brukes i MRI studien. Størrelsen av svulstene, beregnes med formelen lengde × bredde
2/2, ble overvåket med calipers. Over en periode på 6 uker, ble tumorene vokst til en maksimal størrelse på 300 mm
3. Denne undersøkelsen ble utført i henhold og etterlevelse av kanadiske Council on Animal Care. Protokollen ble godkjent av Animal Care komité Dalhousie University (protokoll # 09-047). Alle operasjoner ble utført under passende anestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Utarbeidelse av SOR-C27-Cy5.5 for Fluorescent Studies.
SOR-C27 (6,64 × 10
-4 mmol) ble derivatisert ved sålen Cys14 tiol-gruppe ved omsetning med et 25% overskudd av maleimid-derivat av Cy5.5 (8,86 x 10
-4 mmol; GE Healthcare Amersham) i henhold til de medfølgende instruksjoner. Det merkede peptid ble separert fra ureagerte komponenter ved bruk av en Sephadex G-25 størrelseseksklusjonskolonne (20 x 1,5 cm). Fraksjonene som inneholder merket peptid ble frysetørket og renhet bekreftet med HPLC.
Siden SOR-C13 ikke inneholder en eneste unik konjugering stedet, kobling av peptidet til en Cy5.5-NBS ester (GE Healthcare og biovitenskap. Baie d’Urfe, QC) resulterte i en blanding av merkede peptider gjennom Lys1 og Lys8. Følgelig bindende og fluorescents resultatene kan bli fordreid og dermed bare foreløpige
in vivo
Undersøkelsene ble utført.
Forberedelse og karakterisering av SPIO- (SOR-C27)
X for MRI studier .
Overvåke biofordeling ved MRI er avhengig av et kontrastmiddel slik som superparamagnetisk jernoksid (SPIO) perler for å være kjemisk bundet til forbindelsen av interesse SOR-C27 (SOR-C13 ble ikke benyttet som det ikke inneholde en enkelt unik konjugering stedet). SPIO perler funksjonalisert med maleimidgrupper (MicroMod 77-96-201) ble anvendt uten ytterligere rensing. Kulene ble omsatt med en 5-ganger molart overskudd av nyfremstilt og bufret SOR-C27 (1 mM, 50 mM PBS, pH 7,2) i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med 50% metanol og sentrifugert ved 400 RCF inntil supernatanten hadde en svak rød farge og ga en pellet av SOR-C27 funksjon SPIO perler. Den SPIO-peptid pellet ble vasket og resuspendert i steril Dulbeccos PBS (DPBS) til en konsentrasjon på 2,5 mg Fe /ml for injeksjon i mus. For kontroll ble SPIO perler fremstilt ved omsetning av maleimid-funksjonalisert perler med en nylaget løsning cystein ved hjelp av en tilsvarende protokoll. De cystein blokker maleimidgrupper på perlene gjør dem ikke-reaktiv.
Antall SOR-C27 peptider per perle ble bestemt ved kvantitativ
1 H NMR analyse av supernatant å bestemme antall un-reagerte peptid molekyler. I gjennomsnitt 75 SOR-C27 molekyler ble konjugert til hver SPIO partikkel. Konjugering av peptidet til perlene ble verifisert ved trypsin-spaltning av kulesuspensjonen, og analyse de frigjorte peptid-fragmenter ved massespektrometri. Etter spaltning og fjernelse av kulene ved sentrifugering, ble det resulterende supernatanten inneholdt to peptidfragmenter med sekvenser som er forenlige med spaltning av SOR-C27-peptid.
Fluorescent Imaging oppsett og datainnsamling.
alle optiske bildebehandling eksperimenter ble utført ved hjelp av en liten dyr tidsdomene utforske Optix MX2 pre-klinisk imager, og bildene ble analysert eller rekonstruert som fluorescens konsentrasjons kart ved hjelp av ART Optix Optiview analyseprogramvare 2.0 (Advanced Research Technologies, Montreal, QC). En pulset laserdiode 670 nm med en repetisjonsfrekvens på 80 MHz og en tidsoppløsning på 12 ps lyspuls ble brukt for eksitasjon. Fluorescensemisjonen ved 700 nm ble samlet opp ved en svært følsom tids korrelert enkelt foton tellesystem og detektert via en rask fotomultiplikatorrør. Dataene ble registrert som time punkt-spredning funksjoner (TPSF). For bildebehandling, ble isofluorane bedøvet mus plassert på et dyr scene innenfor et kammer som er tillatt for vedlikehold av gassanestesi.
Etter svulster nådd et volum på ~300 mm
3, SOR-C27-Cy5.5 (100 mikrogram) ble injisert intraperitoneal (ip) i TRPV6-positive (Skov-3) xenograft tumor bærende mus, og optisk avbildes på flere tidsintervaller (0,5, 1, 2, 4 og 24 timer) etter injeksjon. For konkurranse studier, ble ukodet SOR-C27 peptid (10 mg) injiseres 10 minutter før injeksjon av Cy5.5 merket SOR-C27 (100 mikrogram). Ved slutten av den avbildning, ble dyrene avlivet henhold dyp anestesi ved intrakardial perfusjon hjelp av saltvann. Organer og svulsten ble skåret ut og skannet
ex vivo
med den optiske imager.
Fluorescent bildebehandling bearbeiding og analyse.
ART Optix Optiview analyse programvare ble brukt for å estimere fluorescens decay rate. Programvaren de-convoluted den målte fluorescens intensitet-tid svekkingskurve ved hjelp av Levenberg-Marquardt-algoritmen, som gjelder en ikke-lineær minste kvadraters minimalisering algoritme for å beregne koeffisientene i en multi-eksponentiell ekspansjon av fluorescens forfall. En to-eksponent beslag ble brukt, og lang (τ
1) og korte (τ
2) fluorescens levetid komponenter, sammen med deres vektede gjennomsnittsverdien (τ
AV), ble automatisk beregnet i henhold til følgende ligning:
hvor A
1 representerer amplituden av den eksponentielle første fluorescens og A
2 representerer amplituden til det andre eksponentiell fluorescens
Magnetisk resonans imaging metode
Alle MR ble utført på en Magnex Scientific 3 Tesla klinisk hodet MR scanner (Oxford, UK) ettermonteres for små dyr bildebehandling, ved hjelp av en Magnex Scientific gradient spole (indre diameter på 21 cm, maksimal drifts gradient styrke på 200 mT /m) tilkobles med en Varian Inc. Direct Drive spektrometer (Palo Alto, California). En 25 mm ID «Litzcage» kvadratur RF spole (Doty Scientific, Columbia, SC), innstilt til 128,8 MHz, ble brukt som en sender /mottager volum spiral for bildebehandling.
In vivo
bildene ble innhentet ved hjelp av en 3D-sann-FISP (T2 /T1 vektet) bildesekvens. Repetisjon tid (T
R), ekko tid (T
E), flip vinkel og båndbredde (BW) ble optimalisert for best mulig bildekvalitet. Sekvensen besto av T
R /T
E = 8/4 ms, flip vinkel = 30 ° og BW = 50 kHz. En synsfelt (FOV) på 38,4 × 25,5 × 25,5 med matrise dimensjoner 256 × 170 × 170 ble brukt til å erverve 150 mikrometer
3 isotrop romlige oppløsning med seks signal gjennomsnitt (-48 minutter per MR). Dette FOV tillatt for samtidig avbildning av svulst området samt lyske og knehasen lymfeknuter.
Mus ble bedøvet med en startdose på 3% isofluorane (i 100% oksygen) i en induksjon kammer, og ble overført til en integrert nosecone, og høyfrekvensspolen avbildning slede (utviklet i huset) for å bli opprettholdt ved 1,5-2% isofluorane for varigheten av MR. Den respirasjonsfrekvens og indre kroppstemperatur på musene ble overvåket ved hjelp av en MR-kompatibel fysiologisk overvåking og gating system (SA Instruments Inc, Stony Brook, New York). Det indre legemet Temperaturen i mus (målt rektalt) ble opprettholdt ved 37 ± 1 ° C via temperaturkontroll tilbakekoblingssløyfe og luftoppvarmingssystem.
Mus ble injisert med ~300 ul tilsvarende ca. 24 mg Fe /kg kroppsvekt på enten cystein blokkert SPIO perler (CYS-SPIO, kontroll,
n
= 9) eller SOR-C27 konjugerte perler (SOR-C27-SPIO;
n
= 9) av enten intravenøs (iv) eller ip injeksjon og avbildes ved 2 timer (dag 0) og 26 timer (dag 1) etter injeksjonen. Baseline skanner (dag -1) av hver mus ble også utført forut for injeksjoner for å tillate riktig sammenligning av tumor og lymfeknute morfologi og kontrast før og etter injeksjon. Etter MR tidsforløpet, ble dyrene avlivet og svulstene ble umiddelbart skåret for histologisk /biokjemisk analyse.
MRI bildebehandling.
Alle bildene var første null-fyllt med ImageJ (NIH) programvare . Bilder ble co-registrert i rview (Colin Studholme, University of California) for hver mus. En semi-automatisert volum segmentering rutine ble gjennomført via segmentering i rview å fastslå nøyaktig tumorvolum.
Resultater
Løsning NMR strukturen SOR-C27
Informasjon om SOR-C27 peptid sekundærstruktur ble utledet ved å undersøke H
α kjemiske skift under tre forskjellige betingelser, 10 mM fosfat-bufret vann, natriumdodecylsulfat (SDS) og dodecylphosphocholine (DPC). Strukturelle beregninger utnytte kjernekraft Hauser effekt (nOe) Avstand støtter på 10 mM SOR-C27 i bufret vann, NaCl eller DPC (Fig. 1A) genererte totalt 40 laveste energistruktur hver som hadde ingen brudd på NOESY begrensninger 0,5 Å . Siden ingen del av peptidet kan bli identifisert som å ta i bruk en vanlig struktur, ble strukturelle valideringskontroller ikke utført. Men i SDS-miceller endringer i amidet
1H kjemiske skift ble observert for rester Lys15, Phe17, Leu18, His19, Ser21, Val23, og Arg27 indikativ for en strukturendring i den anioniske miljø. Struktur beregning av SOR-C27 i 100 mm SDS miceller ved hjelp av Noé avstand begrensninger som gis to omdreininger av en α-heliks (rester 15-25) som var konsekvent i de 10 laveste energi strukturer av 50 beregnet (Fig. 1B) .
En representativ NMR oppløsning struktur av 10 mM SOR-C27 i 50 mM kaliumfosfatbuffer, 200 mM NaCl og 100 mM dodecylphosphocholine (A). En representativ NMR oppløsning struktur av 2 mM SOR-C27 i anioniske 100 mM natriumdodecylsulfat miceller som viser induksjon av helisk struktur fra rester 15 til 25 (B).
Elektro av TRPV6 og SOR-C27 og SOR C13
Wild-type HEK-293 celler uttrykker ikke TRPV6 kanaler.
elektro forsøkene ble utført i HEK-293 celler transfektert med TRPV6 kanaler. Først, for å utelukke tilstedeværelse av TRPV6 kanaler i villtype HEK-293 celler, ble hel-celle patch clamp opptak med 50 ms lineær spenning rampen (-110 mV til 90 mV) brukt i fravær eller nærvær av La
3 + ioner (10 mm). Lantan ioner, som hemmer TRPV6 strøm, hadde ingen effekt på dagens amplituder fremkalt av rampen (kontroll: 106 ± 27 pA; La
3 + ioner: 111 ± 13 PA,
n
= 3;
p
0,05, fig. 2). Hel-celle patch clamp opptak av HEK-293 celler transfektert med TRPV6 /EGFP ble kjøpt i fravær eller nærvær av La
3+ ioner (10 mm). Lantan ioner redusert amplitudene til strømmene TRPV6 fremkalt av rampene ved 82 ± 5% (kontroll: 1065 ± 450 pA; La
3 + ioner: 224 ± 105 Pa;
n
= 3, fig . 2). Amplitudene til strømmene fremkalt ved rampen i villtype HEK-293 (106 ± 27 pA,
n
= 3) var signifikant mindre (
p
= 0,002) enn strømninger i TRPV6 /EGFP transfekterte HEK-293 celler (1065 ± 450 pA,
n
= 3).
De målte strømninger i villtype HEK-293 celler er induktiv ingen over-uttrykk for TRPV6 kanaler. For TRPV6 /EGFP HEK-293, fravær av La
3+ ioner viste en stor strøm med strømmen som effektivt blokkert, i nærvær av La
3 + ioner. Effekt av La
3 + ioner (10 mm) på strøm fremkalt av en 50 ms rampe (nederst) i villtype HEK-293 celler og TRPV6 /EGFP HEK-293 celler.
SOR C13 og SOR-C27 redusere amplituden til TRPV6 strømninger.
Lignende undersøkelser ble utført for å karakterisere virkningen av økende konsentrasjoner av peptidene SOR-C13 og C27-SOR på TRPV6 kanaler. I nærvær av 83,5 nM, 417,5 nM, 835 nM og 25 uM SOR-C13 amplituden av TRPV6 strømmene ble redusert med 18 ± 4,0% (
p
0,05,
n
= 9), 22 ± 4% (
p
0,05,
n
= 9), 24 ± 4% (
p
0,05,
n
= 7), og 25 ± 5% (
p
0,05,
n
= 7), henholdsvis (fig S1-A og -B).. Fig.
