Abstract
Bakgrunn
Nøyaktig påvisning av karakteristiske proteiner utskilt av tykktarm kreft kreftceller i biologiske væsker kan tjene som en biomarkør for sykdommen. Målet med denne studien var å identifisere og validere nye serum biomarkører og demonstrere sitt potensial nytten for tidlig diagnose av kreft i tykktarmen
Metoder
Studiet ble organisert i tre faser i rekkefølge:. 1) biomarkører, 2) teknisk og biologisk validering, og 3) proof of concept å teste potensialet klinisk bruk av utvalgte biomarkører. Et prioritert undergruppe av differensielt-uttrykte gener mellom vevstyper (50 tykktarmsslimhinne fra kreft-frie individer og 100 normal-tumor parene fra tykktarmskreftpasienter) ble validert og videre testet i en serie av serumprøver fra 80 kolon krefttilfeller, 23 pasienter med adenom og 77 kreftfrie kontroller.
resultater
i discovery fasen, ble 505 unike kandidat biomarkører identifisert, med svært betydelige resultater og høy kapasitet til å diskriminere mellom ulike typer vev. Etter en påfølgende prioritering, alle testet gener (N = 23) ble vellykket validert i vev, og en av dem, COL10A1, viste relevante forskjeller i serumproteinnivåer mellom kontroller, pasienter med adenom (p = 0,0083) og tykktarmskrefttilfeller (p = 3.2E-6).
Konklusjon
Vi presenterer en sekvensiell prosess for identifisering og videre validering av biomarkører for tidlig deteksjon av tykktarmskreft som identifiserer COL10A1 proteinnivåer i serum som en potensiell diagnostisk kandidat til å oppdage både adenom lesjoner og tumor.
Impact
bruk av en billig serum test for tykktarmskreft screening bør forbedre sin deltakelse og bidra til å redusere byrden av denne sykdommen.
Citation: Solé X, Crous-Bou M, Cordero D, Olivares D, Guinó E, Sanz-Pamplona R, et al. (2014) Discovery og validering av nye potensielle biomarkører for tidlig deteksjon av tykktarmskreft. PLoS ONE ni (9): e106748. doi: 10,1371 /journal.pone.0106748
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spania
mottatt: 23 april 2014; Godkjent: 01.08.2014; Publisert: 12. september 2014
Copyright: © 2014 Solé et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Genuttrykket datasettet er tilgjengelig i National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus med GEO serie sjonsnummer GSE44076. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den katalanske Institute of Oncology (ICO) og Foundation Private of Biomedical Research Institute of Bellvitge (IDIBELL), den Instituto de Salud Carlos III [bevilger PI08-1635, PI08-1359, PS09-1037, PI11-1439], CIBERESP CB06 /02/2005 og «Acción Transversal del Cancer», den katalanske regjeringen DURSI [bevilgning 2009SGR1489], Fundació Privada Olga Torres (FOT), den spanske foreningen mot kreft (AECC) Scientific Foundation, EU-kommisjonen [innvilge FP7-COOP-Helse-2007-B HiPerDART], og Xarxa de Bancs de Svulster de Catalunya sponset av Pla direktør d’Oncologia de Catalunya (XBTC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har innlevert en patent når det gjelder bruk av COL10A1 som biomarkør for tidlig diagnose av tykktarmskreft med tittelen: «SERUM biomarkør for diagnostisering kolorektal kreft». Europeisk patent nummer: EP2680003A1 (28.06.2012) og Spania ES2436667A2 (03.01.2014). Forfatterne bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en ledende dødsårsaken i verden, med over en millioner nye tilfeller og en halv million dødsfall rundt om i verden hvert år [1]. Fem års relativ overlevelse er under 50%, men dette i stor grad avhenger av stadium ved diagnosetidspunktet [2]. Ingen primærforebyggende tiltak har dokumentert effekt i å redusere forekomsten, men tidlig diagnose gjennom befolkningen screening har vist seg å redusere dødeligheten [3].
I dag er det debatt om hvilken test som skal brukes for CRC screening. Inntil videre bevis er samlet, gjeldende europeiske retningslinjer akseptere fekal skjult blod etterfulgt av bekreftende kolonoskopi, som er terapeutisk når reseserbare adenomer er identifisert [4]. De fleste populasjonsbaserte screeningsprogrammer bruker guaiac basert fekalt skjult blod, som biokjemisk detekterer små spor av blod avledet fra blødende lesjoner i avføring eller fecal immunologisk test, som er basert på immundeteksjon av humant hemoglobin i feces. Disse testene har en sensitivitet på 80% for CRC og 28% for adenom 1 cm, og spesifisiteter i størrelsesorden av 91 94% [5]. Dessuten, for pasienten med avføring baserte analyser har en tendens til å være lav [6]. Bruken av koloskopi som en gullstandard for CRC screening er kontroversielt. Det har rapportert høyere sensitivitet (97%) og spesifisitet (98%) for tidlig deteksjon av CRC, men det har også flere fallgruver knyttet til det: økt økonomisk kostnad; Kravet om høyt utdannet personale; ubehagelig tarm forberedelse; invasivitet; risikoen for sykelighet og dødelighet som er knyttet til fremgangsmåten [7], [8]. Videre, i land der nasjonal koloskopi screening er tilgjengelig, compliance har ofte vært lav [9].
Serum-baserte markører vil være svært attraktiv for CRC screening siden de er minimal invasiv og kan integreres i enhver rutine helse sjekk uten behov for ytterligere krakk sampling, for derved å øke aksept hos pasientene. Molekylærbiologiske teknikker tillate en enklere dannelse av mange hypoteser av kandidat biomarkører for diagnose, prognose og terapeutisk respons i CRC, men behovet for en skikkelig validering er ofte rapportert [10] – [12]. Den underliggende hypotesen er at kreftceller av CRC, selv i sin pre-invasive etapper, lider viktige genetiske endringer som induserer frigjøring av karakteristiske proteiner eller nukleinsyrer potensielt påvise i biologiske væsker oppnådd ved ikke-invasive metoder som blod eller avføring [11] . Påvisning av molekylære biologiske teknikker av disse stoffene vil tjene som en biomarkør for sykdom for å utvikle diagnostiske tester med forbedret prediktiv kraft av aktuelle screening-tester. Derfor er målet med denne studien var å identifisere og validere nye serum biomarkører og demonstrere sitt potensial nytten for tidlig diagnose av kreft i tykktarmen.
Metoder
biomarkør vurdering i denne studien ble organisert i sekvensielle og påfølgende faser for oppdagelse, teknisk og biologisk validering, og proof of concept å teste potensialet klinisk bruk av utvalgte biomarkører. For det første ble genuttrykk microarray data analysert for å identifisere kandidat biomarkører i vevsprøver fra tykktarm kreft-tilfeller og kreftfrie kontroller (
Discovery fase
). For det andre, ved hjelp av en alternativ metode basert på kvantitativ real-time PCR (RT-qPCR), et utvalg av differensielt uttrykte gener ble validert i det samme settet av vevsbiopsier (
Teknisk Validering fase
), så vel som i biopsier hentet fra et uavhengig sett med pasienter (
biologisk Validering fase
). Til slutt ble den potensielle kliniske anvendelse av de mest lovende validerte kandidater testet i serumprøver fra tykktarm krefttilfeller, et lite sett med adenomer, og kreft-frie kontroller ved påvisning av den tilsvarende utskilte proteinet ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) tester (
Proof of Concept fase
). Rapporterte Stard retningslinjer [13] har vært grunnlag for å definere vår protokoll.
Pasienter og prøver
Hovedtrekkene i de fagene som inngår i denne studien er vist i tabell 1. Colon svulst og sammenkoblede tilstøtende (~5-10 cm) patologisk normal slimhinne vevsprøver brukt i denne studien ble oppnådd på tidspunktet for kirurgi fra en rekke tilfeller med en hendelse diagnose av tykktarms adenokarsinom delta på Bellvitge universitetssykehus (Barcelona, Spania) mellom januar 1996 og desember 2007. Inkludert saker ble valgt ut til å danne en homogen serie av pasienter med stadium II, mikro-stabil sporadisk kreft i tykktarmen. Alle pasientene gjennomgikk radikal kirurgi og ikke fikk kjemoterapi før operasjonen. Patologer bekreftet alle tykktarmskreftdiagnoser og valgt ferske vevsprøver fra svulsten og tilstøtende slimhinnen tatt fra den proksimale reseksjon margin. En hematoxylin-eosin-farging ble utført på et objektglass snitt av tumor prøven for å lede patologen i å velge et område med minst 75% av tumorcellene. Scenen gruppering fulgt den autoritative UICC guide «TNM Atlas, sjette Edition». Den beste tilnærmingen til denne klassifiseringen ble hentet fra den innsamlede informasjonen på diagnosetidspunktet for hvert enkelt tilfelle.
Vevsprøver av tykktarmsslimhinnen fra kreftfrie kontroller ble innhentet gjennom koloskopi mellom februar og mai 2010. En sammenhengende rekke av pasienter som gjennomgikk koloskopi indikert av symptomer (vanligvis anemi, blødning, gastrointestinal smerte eller endret rytme) ble invitert til å delta. De med negative resultater (dvs. uten kolon lesjoner) ble inkludert i denne studien. Ingen av dem rapporterte familiehistorie med kreft.
Til slutt, serumprøver fra tykktarm kreft-tilfeller og kreftfrie kontroller ble valgt ut fra en epidemiologisk case-control studie på gen-miljø interaksjoner som tidligere er beskrevet i detalj [ ,,,0],14]. Alle serumprøver ble samlet før operasjonen for saker og like før koloskopi for kontroller.
For å forenkle navngi forskjellige prøvetyper, her vil vi bruke
svulst product: (T) når det refereres til tumorprøver fra tykktarmskreftpasienter,
tilstøtende normalt product: (A) når det refereres til patologi normale tykktarmsslimhinnen prøver fra tykktarm kreftpasienter, og
kreftfri product: (F) når det refereres til tykktarmsslimhinnen prøver fra kreftfrie enkeltpersoner.
klinisk forskningsetiske komité for Bellvitge universitetssykehus godkjent studieprotokollen, og alle personer gitt skriftlig informert samtykke til å delta og for genetiske analyser gjøres på sine prøver.
RNA utvinning
Total RNA ble isolert fra frosne vevsprøver ved hjelp Exiqon miRCURY RNA Isolation Kit (Exiqon A /S, Danmark), i henhold til produsentens protokoll, og vurderer alle anbefalte forholdsregler for å unngå RNA degradering av RNases. Hentet RNA ble kvantifisert ved Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og lagret ved -80 ° C. Kvaliteten på disse RNA prøver ble ytterligere kontrolleres ved hjelp av RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) etter produsentens retningslinjer, og ble bekreftet ved gel elektroforese. RNA integritet nummer (RIN) viste god kvalitet ([Q1 = 7,5; Median = 8,25; Q3 = 8,9] for svulster, [Q1 = 7; Median = 7,5; Q3 = 8] for tilstøtende normalt og [Q1 = 7,8; Median = 8,3; Q3 = 8,65] for sunn normal). RNA renhet ble målt med forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm (gjennomsnitt = 1.96, SD = 0,04), med ingen forskjeller mellom vevstyper
Discovery-serien -. Uttrykk arrays
oppdagelsen serien inkludert 100 par svulsten og tilstøtende normale tarmslimhinnen prøver og 50 prøver av tykktarmsslimhinnen fra kreftfrie individer (totalt n = 250). Total RNA hentet fra disse prøvene ble hybridisert til Affymetrix Human Genome U219 array-plater (Affymetrix, Santa Clara, CA) etter produsentens anbefalinger. Fire prøver (to tilstøtende normal-tumor par) ble ekskludert fra datasettet etter kvalitetskontroll. Dermed ble en endelig datasett av 246 arrays brukes for senere analyser.
Rådata ble normalisert ved hjelp av Robust Multiarray Gjennomsnittlig algoritme [15] implementert i
AFFY
pakke [16] av Bioconductor suite (https://www.bioconductor.org) [17]. All statistisk analyse ble gjort med R statistisk databehandling programvare (https://www.r-project.org) [18].
Før ble utført differensial uttrykk analyse, lav-variant og Y-kromosom transkripsjoner ble fjernet fra etterfølgende analyser. For de resterende probesets, ble ordnet-Student t-test brukes til å oppdage betydelig overekspresjon mellom tilstøtende normalt (A) eller tumorprøver (T) og kreft-fri slimhinnen (F). Bonferronikorreksjon ble brukt til å gjøre rede for flere hypotesetesting. For å begrense de opprinnelig innhentet lister, ble kandidat probesets ytterligere filtreres basert på ulike kriterier: lave nivåer og lav variasjon i kreft-fri slimhinner; stor gjennomsnitts ganger endring mellom T /F eller A /F; og homogenitet av effekter blant flere prober for det samme genet, når det er tilgjengelig. Probesets som passerte filtreringskriteriene ble kartlagt til gener, enheter av informasjon som brukes for nedstrøms analyser
En prioritering prosedyren ble utført for å velge den beste kandidaten gener for validering ved hjelp av offentlig tilgjengelige data [19] -. [24] . Kriterier sto for var knyttet til reproduserbarhet og spesifisitet problemer: observert reproduserbarhet av uttrykket forskjeller; meget lave nivåer av ekspresjon i blod vev; og valg av gener med stor ekspresjon i tykktarmen vev sammenlignet med annet vev i henhold til GeneCards database (https://www.genecards.org) [25], selv om de fleste genene ble uttrykt i flere vev. Genuttrykket datasettet er tilgjengelig i National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus [26] med GEO serie sjonsnummer GSE44076 og i prosjektets hjemmeside (https://www.colonomics.org).
Teknisk og biologisk validering – RT-qPCR for uttrykk vurdering
Expression nivåer av utvalgte gener ble vurdert med RT-qPCR både for oppdagelsen serien og for et ekstra sett med 104 prøver (70 sammenkoblede tilstøtende normale /tumorvev fra tykktarmskreft pasienter og 34 fra kreftfrie kontroller). Disse prøvene ble samlet mellom januar 1996 og juni 2011 etter samme protokoll og lagres under samme vilkår som oppdagelsen serien. cDNA ble syntetisert fra mRNA ekstrahert med transkripsjonen første tråd cDNA syntese-sett (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) ved å følge standardprosedyrer.
To sett med primere ble konstruert for hvert gen, og hvert sett ble analysert i duplisere. Tre kontroll gener ble inkludert i analysen:
ACTB
,
TPT1
, og
UBC
.
ACTB
ble valgt basert på den omfattende forrige litteratur peker det som et egnet husholdningsgenet for genekspresjon analyser i tykktarm prøver [27] – [29].
UBC Hotell og
TPT1
ble valgt basert på den høye stabiliteten i sine uttrykk nivåer på tvers av alle prøvene i vår rekke data (Tall S1 og S2). Interessant, de hadde også tidligere blitt foreslått som potensielt egnede rengjørings gener for genuttrykk analyser i tykktarm prøver [29].
multipleksede RT-qPCRs analyser ble gjort ved hjelp av BioMark Dynamisk Array 96 × 96 plater (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Resulterende bildene ble analysert med Fluidigm Biomark programvare ved hjelp av standard parametere. Rå qPCR data ble behandlet med HTqPCR pakken v1.10.0 [30]. Før vurderingen av differensial uttrykk mellom ulike typer vev, ble uttrykket matrise filtrert av kvalitetshensyn.
UBC
ble til slutt valgt som housekeeping kontroll basert på stabiliteten av sine terskelsykkel verdier (Figur S2). Mann-Whitney tester ble brukt for å sammenligne uttrykk nivåer mellom kreft-frie og tilstøtende normale prøver og mellom kreftfrie og tumorprøver. Hvert sett av primere ble analysert uavhengig av hverandre, og sett av primere som viste de høyeste betydelige resultater i analysen av differensial uttrykk ble valgt som representant
Identifikasjon av serum biomarkører -. Proof of concept for screening gyldighet
for å teste den potensielle verdien for tidlig oppdagelse, ble de mest lovende kandidater fra det biologiske validering analysert i serumprøver i en serie på 80 tykktarm kreft tilfeller, 23 pasienter med adenom og 77 kreftfrie kontroller, alle testet i duplikat for å øke presisjonen av forsøket. Ten-milliliter prøver av perifer venøs blod ble samlet inn fra tykktarm kreft tilfeller, pasienter med adenomer og kontroller. Etter sentrifuger i 15 minutter ved 1000 opm i løpet av 30 minutter etter prøvetaking, ble serum alikvotert og lagret ved -80 ° C. Kommersiell ELISA kits fra biovitenskap Inc og R D Systems, avhengig av tilgjengelighet, ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for å vurdere serumproteinkonsentrasjoner. Alle analyser benytter kvantitativ sandwich-enzym immunoassay teknikk. Konsentrasjonen av målproteinene i hver prøve ble beregnet ut fra en standardkurve drives i duplikat i hver plate. Forskerne har undersøkt disse serumprøver var uvitende om pasientens diagnose. En lineær modell justert for alder, kjønn og potensielle partieffekter ble brukt for å vurdere den statistiske betydningen av differensial protein nivåer mellom gruppene. Foreningen av markører med pasientkarakteristika som alder og kjønn, flere epidemiologiske faktorer og tumor egenskaper er vist i tabell S1. Siden noen blodprøver viste ekstreme verdier for noen fag, ble en rang-basert test også utført. Resultatene ble ikke endret på en relevant måte og p-verdiene avledet fra de lineære modeller er rapportert.
Antall prøver som brukes ble beregnet til å oppnå 10% presisjon på sensitivitet og spesifisitet anslag for forventede verdier av 75%. Dette krevde minst 72 individer per gruppe. For oppdagelsen serien, dette tallet var ubalansert til oversample svulster, som har større variasjon og et bredt spekter av kandidater måtte bli analysert. Validerings serien i serum ble supplert med en mindre undergruppe av adenom (n = 23) for å utforske nytten av markørene for å oppdage denne premaligne lesjon.
Resultater
biomarkører
i denne godt valgt homogen sett av prøver, forskjeller i mRNA uttrykk målt med Affymetrix HG-U219 array-platene var så bemerkelsesverdig at en ukontrollert teknikk (hoved~~POS=TRUNC komponentene~~POS=HEADCOMP analyse) ved hjelp av et komplett sett med probesets separert nesten perfekt de tre vevstyper ( Figur 1a). Den første hovedkomponent skiller klart tumorprøver av tykktarm kreft tilfeller (T) og ikke-tumorprøver. Bemerkelsesverdig er den andre hovedkomponent også delt kreft-fri (F) fra tilstøtende normale prøver som hører til pasienter med kreft (A).
A. Prinsipal komponent analyse. B. differensielt uttrykte gener mellom tilstøtende normale og kreftfrie prøver. C. differensielt uttrykte gener mellom tumor og kreftfrie prøver.
Fra 33,853 probe sett inngår i rekken med høy variabilitet, 5503 var over-uttrykt i A sammenlignet med F, og 11 229 var over -expressed i T sammenlignet med F (p 0,05, Bonferroni korrigert). Vi har fokusert spesielt på over-uttrykte gener, fordi disse forskjellene er større sannsynlighet for å bli oppdaget i serum, og er derfor mer egnet til å brukes som diagnostiske markører. Interessant nok var en bemerkelsesverdig grad av overlapping (3,101 probe sett, ~56%) funnet mellom disse to lister over probe sett, tyder på at tilstøtende normal slimhinne hos pasienter med kreft hadde allerede opplevd viktige endringer i genuttrykk, og økende betydningen av å bruke kreft-fri slimhinne som referanse vev. Global resultater fra differensial uttrykk analysen er vist i figur 1b og 1c.
For å prioritere kandidater til diagnostiske biomarkører, et sett med filtre ble brukt til første sett av forskjellig uttrykt probe sett. Disse filtrene ble hovedsakelig basert på statistiske kriterier (dvs. stor fold-endring mellom A /F eller T /F, lave nivåer av uttrykk og lav variasjon i F prøver). Disse filtrene ga et endelig antall av 242 markerte sondesett mellom A /F og 443 mellom T /C, noe som tilsvarer et sett av 194 og 352 gener, henholdsvis (tabell S2).
Det første valget gitt en liste av 505 unike kandidat biomarkører med signifikante uttrykk forskjeller mellom svulst og kreft-fri vev. På grunn av tekniske problemer som stammer fra valideringen av en så stor mengde av biomarkører, ble ytterligere tekniske og biologiske kriterier brukt for å ytterligere innskrenke listen over potensielle kandidater. Dette andre sett med filtre var basert på vurderingen av konsistens mellom de ulike probesets for hvert gen; bekreftelse på våre resultater i uavhengige og offentlig tilgjengelige genuttrykk datasett; og null eller lave nivåer av disse genene i blodprøver fra kreftfrie individer. Dessuten ble forkunnskaper og molekylinformasjon for hvert gen hentet fra litteraturen og online databaser for å sikre at valget av de mest pålitelige kandidater (dvs. protein sekresjon, vev spesifisitet, protein funksjon, tidligere bevis som en biomarkør, blant andre). En liste over de 23 beste kandidatene ble til slutt valgt for validering i neste trinn (tabell 2, kolonne 1-2).
Teknisk og biologisk validering
For å sikre påliteligheten av resultatene oppnådd fra de genekspresjon matriser ble seleksjonen av 23 biomarkører validert med en alternativ teknikk (RT-qPCR) begge i det samme settet av prøver (dvs. teknisk validering), og også i en uavhengig serie med tilsvarende kliniske og epidemiologiske egenskaper (dvs. biologisk validering).
Figur 2 viser to-veis gen og prøve gruppering av RT-qPCR uttrykk verdier både for resultatet av den tekniske (figur 2a) og den biologiske validerings (figur 2b). Horisontale aksene til heatmaps (dvs. kolonner) viser et klart skille mellom tumorprøver fra tilstøtende normale og kreftfrie grupper. Den vertikale aksen av gener (dvs. rader) viste to klynger av gener, ett for de differensielt uttrykte mellom A /F og en annen for den differensielt uttrykte mellom T /F. Disse resultatene svært gjenskape mønsteret av uttrykket observert i arrays i discovery fasen, forsterke den potensielle rolle disse genene som diagnostiske biomarkører for tykktarmskreft. En formell sammenligning av ekspresjonsnivåene forskjeller mellom prøvetyper for den tekniske og biologiske validering er vist i tabell 2, kolonne 3-4. Selv om bare p-verdier er vist i tabell 2, uttrykket nivåer av alle validerte genene oppførte seg konsekvent gjennom de ulike fasene, som vist i Figur S3.
Prøver er fargekodet på toppen av varmekart basert på vevstype (dvs. kreft-fri slimhinner = grønn, tilstøtende normalt vev fra kolon kreftpasienter = blå, svulstvev = rød)
Proof of concept -. identifikasjon av serum biomarkører
som en pilot proof-of-concept å demonstrere sitt potensial nytten som tykktarmskreft tidlig diagnostiske biomarkører, ble et utvalg av 9 gener testet i serum ved hjelp av ELISA-tester. Prioritering av disse kandidatene var basert på en omfattende litteraturgjennomgang og tilgjengelighet av kommersiell ELISA kit.
Resultatene for hvert protein er vist i figur 3. Bemerkelsesverdig, kollagen type X alpha1 (COL10A1) vises svært høye konsentrasjoner i tykktarm krefttilfeller og adenomer i forhold til kontrollene (p = 3.2E-6 og p = 0,0083, henholdsvis). Serumkonsentrasjoner av COL10A1 i kontroller, adenomer og tykktarmskrefttilfeller hos trinn er vist i figur S4. Interessant, statistisk signifikante forskjeller ble funnet ved kontrollene ble sammenlignet med hver enkelt av de forskjellige tumorstadier, bortsett fra stadium I, sannsynligvis på grunn av den lille prøvestørrelsen i denne gruppen. Arealet under mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve var 0,75 for kreft, og 0,76 når adenom og tykktarmskreft ble vurdert sammen (figur 4), og viser potensielle god klassifisering evne. Matriksmetalloproteinase-7 (MMP7) viste også en signifikant sammenheng, men ble ikke videre ansett fordi det var på grunn av en underexpression i adenomer sammenlignet med kontroller, som representerte det motsatte følelse av differensial uttrykk som vi prøvde å validere. Ingen kombinasjon av COL10A1 med noen av de andre proteiner betydelig økt arealet under ROC-kurven
A (data ikke vist).. Mottaker opererer karakteristiske kurver for både adenomer og tykktarmskreft sammen (lilla) og tykktarm kreft tilfeller bare (rød). B. Ulike markør cutpoints mot sensitivitet og spesifisitet kurver.
Diskusjoner
CRC screening med fekal okkult blod test har vist effekt i randomiserte studier. Ikke desto mindre, den lave spesifisitet av test antyder behovet for mer presise alternative diagnostiske tester. Sigmoidoskopi, koloskopi og datastyrte tomografi scan (dvs. virtuell koloskopi) er sterke alternative kandidater, men alle har viktige begrensninger, hovedsakelig når det gjelder kostnader, mulige alvorlige bivirkninger og redusert deltakelse. Deltakelse er en viktig faktor for screening effektivitet, og det er også en generalisert observasjon at screening basert på fekal okkult blod test har lav deltakelse [31] – [33]. Dermed vil en diagnostisk test basert på en rutinemessig blodprøve trolig være i stand til å nå en høyere prosentandel av befolkningen, og helsemyndighetene ville favorisere en slik test hvis effekt og kostnader var lik fekal okkult blod test. Med disse lokalene i tankene, startet vi denne studien for å søke etter diagnostiske biomarkører som kan oppdages i blodet med en enkel og rimelig ELISA-testen.
Vår studie av genuttrykk i tykktarmen vev har bekreftet tidligere observasjoner at en stor antall gener er deregulert i tumor sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne. Fra ca 20 000 gener avhørt i uttrykket array, og etter filtrering av flere restriktive kriterier, har 505 unike kandidat biomarkører blitt identifisert (tabell S2), med svært betydelige resultater og høy kapasitet til å diskriminere mellom paret svulst og tilstøtende normale prøver. En sterk funksjon i vårt studiedesign er inkluderingen av et sett med prøver fra kreftfrie kontroller (n = 50). Dette har gjort det mulig for oss å identifisere gener som ikke viser uttrykk forskjeller mellom tilstøtende normalt og svulstvev fra tykktarmskreftpasienter, samt å bekrefte at overuttrykt gener i svulster ikke vise høye uttrykk nivåer i kreft-fri kolon vev, noe som kan være til hinder deres potensielle bruk som biomarkører. Vi har tidligere beskrevet at genekspresjon av tilstøtende normal tykktarmsslimhinne hos en pasient med cancer allerede har blitt vesentlig endret i forhold til kreft-frie kolon mukosa [34], som forsterker behovet for å inkludere vev fra kreftfrie individer i prosjekter tar sikte på å finne diagnose biomarkører for tykktarmskreft.
det store antallet kandidater som er identifisert i analysen av uttrykket data ledet oss til å prioritere hvilke som var å bli valgt for ytterligere validering. Vi brukte en kombinasjon av kriterier, som inkluderte konsistens med andre offentlig tilgjengelige datasett og litteratur; lav eller ingen uttrykk nivåer i kreft-fri slimhinner eller andre vev; uttrykk dominerende til tykktarmskreft vev; og valg av utskillbare proteiner. Etter identifisering av serumproteiner er kostbart og tidkrevende, foretok vi en teknisk og biologisk validering av de beste kandidatene før prøver ELISA-tester. Den tekniske godkjenningen (dvs. i samme sett av prøver, men med en annen teknikk) viste en bemerkelsesverdig reproduserbarhet av uttrykk nivåforskjeller målt ved RT-qPCR og microarrays for alle testede gener, noe som bekrefter at uttrykket datasettet oppnådd med Affymetrix HG-U219 mikromatriser var av fremragende kvalitet og identifisert pålitelig uttrykk forskjeller mellom de ulike vevstyper. Derfor forventer vi at antall falske positiver i de resterende liste (ikke validert) av betydelige differensielt uttrykte gener mellom vevstyper som lav. Videre bekreftelse av de tidligere identifiserte forskjellene i en biologisk uavhengige datasett fremhever også gyldigheten av resultatene oppnådd med mikromatriser.
Det neste trinnet i vår sekvensiell valideringsprosessen ble forsøker å identifisere i serum de tilsvarende proteiner for vår kandidatgener og vurdere deres potensial bruk for tidlig diagnose. Vi har også tatt med en undergruppe av pasienter med adenom, siden dette er også et viktig mål for CRC screening. Ved hjelp av kommersielle ELISA kits kan vi vurdere protein nivåer av alle genene prioriterte. Bemerkelsesverdig, viste COL10A1 relevante nok forskjeller mellom kontroller og tykktarmskreftpasienter (p = 3,2 × 10
-6) for å bli foreslått som en potensiell diagnostisk kandidat. MMP7 viste også noen forskjeller for adenomer (p = 0,0092), men viste en motsatt retning til den forventede en.
Vi har identifisert protein COL10A1 som, når de oppdages ved høye konsentrasjoner i blod, kan det være en indikasjon på tilstedeværelse av en neoplastisk lesjon i tykktarmen. Dette proteinet ble valgt etter en sekvensiell prosedyre der vi begynte å utforske hele genomet ekspresjonsdata i tykktarmen vev. Forhøyede serumnivåer av COL10A1 ble observert både for adenom og tykktarmskreftpasienter. Arealet under ROC-kurven var 0,76, noe som gjør COL10A1 som en lovende diagnostisk biomarkør. Den skjæringspunkt av 280 ng /ml oppnådd 0,63 sensitivitet og spesifisitet 0,85 for kreft i tykktarmen eller adenom (figur 4). Lignende verdier ble oppnådd for kreft bare. Noen kreftfrie fagene viste høye nivåer av COL10A1 i serum, høyere enn gjennomsnittet for adenom, noe som indikerer at andre prosesser ikke er relatert til kolorektal lesjoner kan øke COL10A1 nivåer.
COL10A1
er en kort kjede kollagen hovedsakelig uttrykt av chondrocytes under forbening. Defekter i dette proteinet har vært knyttet til Schmid-type metaphyseal chondrodysplasia [35]. COL10A1 blir ikke uttrykt i normal tykktarm epitel, men er et direkte mål av transkripsjonen
RUNX2 product: [36], en transkripsjonsfaktor som blir uttrykt i cancerceller, og har vært knyttet til flere kreftformer. Den forhøyede uttrykk for
COL10A1
observert i tumorer kan være en indirekte effekt av høyere nivå regulatoriske endringer som oppstår i svulsten. Faktisk har vi observert en høy korrelasjon mellom RUNX2 og
COL10A1
uttrykk i tumorer (Pearson R = 0,5, resultater ikke vist). Våre uttrykk data identifiserer også høy korrelasjon mellom
COL10A1 Hotell og andre gener:
SFRP4
,
INHBA
,
TNFSF4 Hotell som er involvert i cytokin og Wnt signal [37] – [40].
