Abstract
Flere kjemoterapeutika utøve immunmodulerende effekter. En av disse er den nukleosidanalog gemcitabin, som er mye brukt i pasienter med lungekreft, eggstokk-kreft, brystkreft, mesothelioma og flere andre typer kreft, men med begrenset effekt. Vi har antatt at disse immunpotensierende effekten av dette stoffet blir delvis hemmet av den hemmende T-celle-molekyl CTLA-4 og således kan økes ved å kombinere den med en blokkerende antistoff mot CTLA-4, som i seg selv har nylig vist seg gunstige kliniske effekter i behandling av pasienter med metastatisk melanom. Her vises, ved hjelp av to ikke-immunogene murine tumormodeller, som behandling med gemcitabin kjemoterapi i kombinasjon med CTLA-4 blokade resulterer i induksjon av en potent anti-tumor immunrespons. Uttømming eksperimenter vist at både CD4
+ og CD8
+ T-celler er nødvendig for en optimal terapeutisk virkning. Mus behandlet med kombinasjonen oppviste tumorregresjon og langvarig beskyttende immunitet. I tillegg, viser vi at effekten av kombinasjonen er moderert ved tidspunktet for administrering av de to midlene. Våre resultater viser at immun sjekkpunkt blokade og cytotoksisk kjemoterapi kan ha en synergistisk effekt ved behandling av kreft. Disse resultatene gir grunnlag for å forfølge kombinasjonsterapier med anti-CTLA-4 og immunpoten kjemoterapi og har viktige implikasjoner for fremtidige studier hos kreftpasienter. Siden begge legemidlene er godkjent for bruk hos pasienter våre data kan umiddelbart oversatt til kliniske studier
Citation. Lesterhuis WJ, Salmons J, Nowak AK, Rozali EN, Khong A, Dick IM, et al. (2013) synergistisk effekt av CTLA-4-blokkaden og Cancer Chemotherapy i Induksjon av Anti-Tumor Immunity. PLoS ONE 8 (4): e61895. doi: 10,1371 /journal.pone.0061895
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 20 desember 2012; Godkjent: 14 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Lesterhuis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra National Health and Medical Research Council of Australia og Forsikring Commission of Western Australia. WJL støttes av en translasjonsforskning fellesskap av den nederlandske Kreftforeningen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv i det siste, holdt ortodoks klinisk praksis som kjemoterapi og immunterapi ikke kunne kombineres på grunn av myelosuppressiv natur fleste cytotoksiske legemidler, dette begrepet har blitt utfordret de siste årene av en stor mengde eksperimentelle data (anmeldt i [1], [2]). For eksempel, behandling med antracykliner og oksaliplatin resulterer i immunogent tumorcelledød og platinabaserte kjemoterapeutiske nedregulere den hemmende STAT6 /PD-L2 veien og sensibilisere tumorceller for T-celle-mediert cytotoksisitet [3] – [5]. Vår gruppe har vist at nukleosid-analog gemcitabin kan forbedre tumor antigen kryss-presentasjon av dendrittiske celler og andre har vist at denne behandling fører til oppregulering av tumor MHC klasse I ekspresjon og uttømming av begge regulatoriske T-celler og myeloide-avledet suppressorceller [6 ] – [10]. Disse dataene gir en sterk begrunnelse for å utnytte den immunopotensierende effekt av gemcitabin ved å kombinere det med andre immunterapeutiske metoder.
Immunsuppressive nettverk spiller en viktig rolle i den unnvikelse av anti-tumor-immunitet, og som sådan kunne beherske immunopotensierende virkning kjemoterapi. En av de potensielt relevante begrensende veier medieres av immun hemmende molekylet cytotoksiske T-lymfocytt antigen 4 (CTLA-4). Ekspresjonen av CTLA-4 er oppregulert etter T-celleaktivering og veien er blitt vist å spille en viktig rolle i immunmodulerende kreft. Terapeutisk blokade av CTLA-4 har vist seg å være en effektiv behandling for melanomer [11]. Den anti-CTLA-4 monoklonalt antistoff ipilimumab er nå registrert av FDA som første behandling som har vist en total overlevelse fordel i en randomisert fase III studie i metastatisk melanom i kombinasjon med dacarbazine kjemoterapi [12], [13]. Men selv om noen pasienter oppnådde komplett respons og andre gikk videre til langsiktig progresjonsfri overlevelse, de fleste pasientene opplevde sykdomsprogresjon.
Vi setter ut for å finne ut om den CTLA-4 sjekkpunkt begrenser potensialet terapeutisk aktiviteten til gemcitabin ved å kombinere den med en CTLA-4-blokkerende antistoff. I denne studien viser vi for første gang at CTLA-4-blokkade og immunpotensierende kjemoterapi i en terapeutisk dose ha en synergistisk effekt, noe som resulterer i induksjon av en potent anti-tumor immunrespons og langvarig beskyttende immunitet. I tillegg, viser vi at den totale effekten av kombinasjonen i mus er avhengig av tidspunktet for administrering av de individuelle komponentene.
Materialer og metoder
Mus
BALB /C (H-2
d) og C57BL /6 (H-2
b) mus ble oppnådd fra Animal Resources Centre (Canning Vale, Australia), og ble holdt under standardbetingelser (M-blokk Animal Facility, dronning Elizabeth II Medical Centre, The University of Western Australia). Alle mus ble brukt i disse studiene var mellom 8-12 uker gamle.
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til The University of Western Australia dyreetikk Committee godkjenninger (protokoll RA /3 /100/1016) og code of conduct av National Health and Medical Research Council of Australia. The Western Australia Animal etiske komité spesielt godkjent denne studien.
Cellelinjer
MHC klasse I-positive, klasse II-negative, svært tumorigent og dårlig immunogene BALB /C-avledet asbest-indusert mus mesothelioma cellelinje AB1, transfektert med influensa HA-genet (AB1-HA) er blitt beskrevet tidligere [6], [7]. For reintroduksjon eksperimenter ikke-HA-transfekterte AB1 celler ble anvendt. Den dårlig immunogene og svært tumorgene Lewis Lung Cancer (LLC) cellelinje ble oppnådd fra CellBank Australia (Westmead NSW, Australia), hvor identiteten av cellelinjen ble validert. Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Australia) supplert med 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-merkaptoetanol, 100 enheter /ml penicillin (CSL, Melbourne, Australia), 50 ug /ml gentamicin (David Bull Labs, Kewdale , Australia), og 10% FCS (Invitrogen). AB1-HA-celler ble opprettholdt i media inneholdende neomycin analoge geneticin (Invitrogen) ved en sluttkonsentrasjon på 400 ug /ml. Alle cellelinjer ble regelmessig testet og forble negativ for Mycoplasma spp.
Tumor Challenge og eksperimentell protokoll
ABI-HA tumorceller (1 × 10
6) eller LLC (2,5 × 10
5) i 100 ul PBS ble inokulert sc inn i den nedre høyre flanke av resipientmus. Standard kjemoterapi startet 9 dager senere for AB1-HA og 6 dager senere for Advisor når en håndgripelig svulst på ca 10 mm
2 var tydelig. Mus ble injisert i.p. med gemcitabin 120 ug /g kroppsvekt hver tredje dag i fem doser (q3dx5), et regime som tidligere er etablert som en maksimalt tolerert dose for BALB /C-mus (figurer S1, S2 og S3) [6], [7]. Alternativt kan mus ble behandlet med en enkelt dose av cisplatin 6 ug /g på dag 9 for AB1-HA eller dag 6 for LLC, som vi har funnet å være den maksimale tolererte dose i denne modellen basert på titrering eksperimenter (data ikke vist). Kontroll mus fikk 100 mL PBS alene. Anti-CTLA-4 ble administrert intraperitonealt hver tredje dag i fire doser (q3dx4). I utgangspunktet brukte vi 100 mikrogram per dose, men påfølgende titrering studier dosering viste at med 75 mikrogram per dose like resultater ble oppnådd, og derfor tok vi denne dosen for senere eksperimenter (figur S4). I kombinasjons eksperimenter ved hjelp AB1-HA med cisplatin, brukte vi en enkelt dose på 200 mikrogram anti-CTLA-4 på dag 9, basert på en fersk rapport demonstrere gjennomførbarheten og styrken på den planen [14], og basert på vår egen data viser ekvivalens med 75 mikrogram q3dx4 tidsplan (data ikke vist). Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av mikro calipers minst tre ganger ukentlig i løpet av behandlingen og deretter inntil tumorstørrelse nådde 100 mm
2, og da musene ble avlivet etter regionale dyreetiske retningslinjer. Under behandlings muse vekter ble overvåket og avlivet om betydelig vekttap (mer enn 15%). Eller toksisitet ble observert
For noen eksperimenter mus som hadde vist fullstendig regresjon av tumorer ble gjenopptatt bruk av ikke-HA transfekterte celler AB1 mesothelioma i nedre venstre flanke (figur S5). Hvis minst to måneder etter gjentatt administrering ingen tumorer var håndgripelig ble musene anses å være immun. Tumor-drenerende lymfeknuter ble deretter samlet opp og farget for minne-T-celle markører (se nedenfor). Ikke-tumorbærende naive mus ble brukt som kontroller.
Antistoffer og kjemoterapi
gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly) ble levert av apotek avdeling av Sir Charles Gairdner Hospital. Den anti-CTLA-4 (klone 9H10) monoklonalt antistoff ble forberedt og renset ved monoklonalt antistoff Facility, WAIMR (Perth, Australia). Den CTLA-4 hybridoma var en slags gave fra professor JP Allison (Memorial Sloan Kettering Cancer Centre, New York, USA)
For utarming eksperimenter, ble følgende antistoffer brukes. Anti-NK1.1 (klone PK136), anti-CD4 (klone GK1.5) og anti-CD8 (klone YTS169.4), alle fra det monoklonale antistoff Facility, WAIMR (Perth, Australia). Anti-CD4 og CD8 ble gitt 150 ug i.v., en dag før gemcitabin /anti-CTLA4, etterfulgt av 100 pg i.p. hver 3. dag, siste dose på dag 27. Anti-NK1.1 ble administrert 200 mikrogram ip på dag 6, 9 og 12. Nedbryting ble bekreftet ved flowcytometri av perifert blod fra halen blødninger (figur S6).
følgende antistoffer ble brukt for flowcytometri: CD3 FITC, CD4-PECy7, CD4 Pac Blå, CD8 PerCpCy5.5, CD3 PE og ICOS APC, CD44-PE, CD49b FITC, CD62L-FITC, (alle Biolegend), Ki67 AF488 Ki 67 PE og CD4 APCH7 (alle BD Biovitenskap), CD3 PeCy7 foxp3-PerCPCy5.5 og CD8 PECy7, CD8 ef780 (eBioscience).
Cell Farging og flowcytometri analyse
perifert blod prøvetaking ble utført via haleblod på dag 29. et volum på 100 ul blod ble oppsamlet i et rør heparin. Antistoff cocktails av overflaten flekker (CD3, CD4, CD8 og ICOS) ble fremstilt, og 20 ul tilsatt til 30 ul blod i 1 time. Prøvene ble lysert (BD FACS lyserende løsning) og permeabilized (eBioscience Fixation /Perm Buffer), antistoffet for intracellulær farging (Ki-67) ble fremstilt og 20 mL tilsatt i 45 minutter. Prøvene ble resuspendert i 200 mL stabiliserende fiksativ (BD) og 50000 lymfocytt gated hendelsene ble kjøpt på FACS Canto II flowcytometer (BD Biosciences) og data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare.
For noen eksperimenter, med mus som var blitt helbredet med behandling og senere motsto en ny behandling av tumorceller på den kontralaterale flanke, tumor-drenerende lymfeknuter (TDLN) ble høstet (se ovenfor) for analyse av T-celleundergrupper hukommelse. Lymfeknuter fra begge flanker ble høstet og slått sammen og farget for CD4, CD8, CD44 og CD62L, i henhold til den samme protokoll som flowcytometri analyse av perifert blod (se ovenfor og figur S5).
For analyse av T-celle responser i svulsten, TDLN (ipsilaterale aksillær og inguinal noder) og milt, ble musene avlivet på dag 15 og organene ble høstet. Dag 15 ble valgt som tidspunkt da fra omtrent dag 12 vekstkurver mellom gruppene begynte å dele seg, slik at tilfredsstillende vurdering av T-celle-responser. Milt og LNS ble most mellom glassplater, resuspendert i røde blodcellelyse oppløsning (eBioscience) og filtrert gjennom et 40 um filter (BD) og farget med de aktuelle antistoffer. Svulster ble hakket fint og overført til fordøyelse oppløsning som besto av RPMI /2% FCS med 10 mg /ml Collagenase og 1 mg /ml DNAse I (Sigma-Aldrich) og inkubert i en time på en valse bank. I løpet av de siste 10 minuttene EDTA ble tilsatt til en endelig oppløsning på 5 mM. Prøvene ble vasket med RPMI /2% FCS og filtrert gjennom et 40 um filter og farget med de aktuelle antistoffer.
Statistiske analyser
Data ble analysert ved bruk av Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc.) . Tumorvekst data ble analysert ved hjelp av PASW statistikk versjon 18 MIXED prosedyre (IBM SPSS, Chicago IL). Sammenligninger mellom behandlingsgruppene ved hvert tidspunkt ble justert for multiple sammenligninger ved Sidak metoden. Data for svulst overlevelse ble analysert i henhold til Kaplan Meier metoden og overlevelses proporsjoner ble sammenlignet mellom grupper som bruker en Log Rank Test. Data fra T-celleundersett ble sammenlignet med den Student t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant når P-verdi var. 0,05
Resultater
Anti-CTLA-4 og Gemcitabine Kombiner i en terapeutisk synergistisk måte
Ved å bygge på tidligere data demonstrere gemcitabin som en immunogen cytotoksisk legemiddel [7], hypotese vi at den terapeutiske effekt av gemcitabin kan bli ytterligere forbedret ved å kombinere det med en blokkerende antistoff mot CTLA-4. AB1-HA-inokulert BALB /C-mus ble behandlet med anti-CTLA-4 i kombinasjon med gemcitabin (fig S1 og figur 1). Behandling med gemcitabin alene resulterte i god kontroll av tumorutvekst når legemidlet ble administrert, som tidligere rapportert, imidlertid kommet tumor ved opphør av behandling i de fleste mus [15]. Behandling med anti-CTLA-4 alene reduserte raten av tumorveksten, men var mindre effektiv enn gemcitabin som monoterapi (figur 1A). Imidlertid, når anti-CTLA-4 og gemcitabin ble kombinert, ble det observert en klar additiv effekt av begge behandlingene med en betydelig forsinkelse av tumorutvekst. Antallet dyr som oppnådde fullstendig regresjon ble super-additiv (-60% i kombinasjonsgruppen versus ~13% for anti-CTLA-4 og ~8% for gemcitabin alene i AB1-HA modell, fig. 1A og B). Vi fant også forbedret tumorkontroll i LLC-modellen, men effekten var mindre markert (figur S7). Dette samsvarer med studier på mennesker som bruker immun sjekkpunkt blokkerende antistoffer, viser store forskjeller i effekt mellom ulike typer kreft [16]. Interessant, da vi behandlet mus med den ikke-immunogene kjemoterapeutisk middel cisplatin, [17], var der ingen klar synergistisk effekt i enten modellen (figur 1C og D og fig S7).
(A) Tumor overflate i mm
2 (gjennomsnitt ± SD) av AB1-HA svulster som ble injisert på dag 0, mus (n = 87) ble behandlet på dag 9/12/15/18 med 75 ug anti-CTLA-4 og med 120 ug /g gemcitabin på dag 9/12/15/18/21, eller med PBS (samlede data av 5 separate forsøk er vist). (B) Kaplan-Meier overlevelses tomt på samme eksperiment. (C) Tumor overflate i mm
2 (gjennomsnitt ± SD) av AB1-HA svulster som ble injisert på dag 0, mus (n = 65) ble behandlet på dag 9 med 200 ug anti-CTLA-4 og 6 ug /g cisplatin, eller med PBS (sammenslåtte data fra 3 separate eksperimenter er vist). (D) Kaplan-Meier overlevelses tomt på samme eksperiment.
Tidligere studier hos kreftpasienter og dyr har antydet at ICOS
+ T-celler spiller en viktig rolle i handlingen av anti-CTLA -4, så vel som å ha prognostisk betydning [18], [19]. Vi analyserte ICOS ekspresjon og proliferative status av sirkulerende T-celler i mus og funnet at mus som ble behandlet med kombinasjonsterapien viste en signifikant økning i CD4
+ ICOS
+ T-celler i perifert blod, samt en klar økning i CD4
+ proliferative T-celler som fastsatt av Ki-67 farging (figur 2A-D, p 0,001).
En sammenligning er vist i perifert blod T-celle aktivering og spredning markører på dagen 29 etter vaksinasjonen for de ulike behandlingsgruppene (* p≤0.05; ** p 0,01 *** p 0,001). ICOS
+ /CD4
+ Th-celler (A); Ki-67
+ /CD4
+ Th-celler (B); CD8
+ /ICOS
+ CTL (C) og CD8
+ /Ki-67
+ CTL (D). (E og F) flowcytometrisk analyse av voksende CD8
+ T-celler og treg i svulst, tumor-drenering lymfeknuter og milt på dag 15. Avbildet er prosentandelen av Ki-67
+ CD8
+ CD3
+ celler og foxp3
+ CD4
+ CD3
+ celler (F). Seks mus per gruppe ble testet for kontroll og anti-CTLA-4, 12 mus per gruppe for gemcitabin-inneholdende regimer sammenslåtte per 2 mus på grunn av den lille tumorstørrelse i disse gruppene. Betyr med SEM vises (n = 36). (G) Kaplan-Meier-overlevelses plott av AB1-HA svulster som ble injisert på dag 0, mus (n = 57) ble behandlet med anti-CTLA-4 og /eller gemcitabin, eller med PBS i kombinasjon med nedbrytende antistoffer mot CD4 eller CD8 (samlet data av 2 separate forsøk er vist).
for å få mer innsikt i sammensetningen av tumor-infiltrerende celler under behandling, vi beregnet hyppigheten av foxp3 + CD4 + Tregs, CD49b
+ CD3
– NK-celler og ICOS
+ CD4
+ aktivert Th-celler og Ki-67
+ CD8
+ prolifererende CTL i svulst, tumor-drenering lymfeknuter (TDLN) og milt på dag 15 (figur 2E-F, figur S8). Prosentandelen av CD8
+ CTL var ikke forskjellig mellom gruppene (figur S8), men deres proliferative kapasitet, som målt ved hjelp av Ki-67 gjorde øke når mus ble behandlet med anti-CTLA4, både i tumor og TDLN. Interessant, det relative tap av prolifererende tumor-infiltrerende CD8
+ T-celler i gemcitabin-behandlede mus ble delvis reddet av anti-CTLA-4 (figur 2E). Tumor CD4 + T-celleinfiltrasjon ble ikke signifikant endret ved enten gemcitabin eller anti-CTLA-4, selv om ICOS uttrykk som en markør for aktivering ble redusert i alle gemcitabin-behandlede mus, enten med eller uten anti-CTLA4 (fig S8). Prosentdelen av tumor-infiltrerende foxp3
+ CD4
+ T-celler ble signifikant redusert i tumorer behandlet med gemcitabin, anti-CTLA-4 eller kombinasjonsbehandling (figur 2F), en finne i samsvar med tidligere publiserte data [10 ]. Ingen klare forskjeller ble observert i NK celle tall mellom behandlingsgruppene (Figur S8).
For å undersøke om økt respons på kombinasjonsbehandling involvert hovedsakelig CD4
+ eller CD8
+ T-celler eller NK -celler utførte vi nedbrytende forsøk under anvendelse av monoklonale antistoffer mot CD4, CD8 (AB1-HA modell) og NK1.1 (LLC modell, siden BALB /C-mus uttrykker ikke NK1.1). Vi har funnet at den terapeutiske effekten av gemcitabin pluss anti-CTLA4 ble fullstendig opphevet når enten CD4
+ eller CD8
+ celler ble utarmet (figur 2G), mens reduksjon av NK-celler ikke påvirke effektiviteten av behandlingen ( Figur S9). Samlet utgjør disse data viser at anti-CTLA-4 og kjemoterapi synergistisk til induksjon av en potent anti-tumor immunrespons, med en viktig rolle i både CD4
+ og CD8
+ T-celler for å oppnå optimal terapeutisk virkning .
Anti-CTLA-4 og gemcitabin kombinasjonsterapi induserer langvarig Protective Anti-tumor immunologisk hukommelse
en av de viktigste teoretiske fordelene med immunterapi i løpet av kjemoterapi er at det tidligere har potensial til å induserer immunologisk hukommelse, og derfor mulighet for å oppnå varige responser. Vi testet hvorvidt kombinasjonsbehandling med anti-CTLA-4 og gemcitabin resulterte i anti-tumor immunologisk hukommelse. Vi reinoculated mus som hadde helt avvist deres tumorer etter kombinasjonsbehandling og fant at 93% (13 ut 14 mus) av disse musene var helt resistent mot tumor reintroduksjon (figur 3A). Viktigere, for reintroduksjon eksperimenter brukte vi AB1 celler som ikke var transfektert med HA, noe som indikerer at den induserte immunitet var mot delte tumor-antigener på AB1 mesothelioma celler og ikke utelukkende mot transfektert HA-antigenet. Strømningscytometrisk analyse av T-celleundersett i de drenerende lymfeknuter i disse mus viste økte nivåer av både sentral hukommelse og effektor hukommelse CD4
+ T-celler, og i mindre grad CD8
+ minneceller (figur 3B-E , p 0,001). Sammen tyder disse data på at kombinasjonen behandling resulterer i en økning av minne-T-celler og induksjon av beskyttende immunitet.
(A) Kaplan-Meier-overlevelses plot av mus som var blitt herdet ved enten anti-CTLA- 4 alene eller kombinasjonsterapi og som ble senere gjenopptatt bruk AB1 mesothelioma celler, viser beskyttende immunitet i 80% og 92% henholdsvis. T-celle undergruppe analyse i tumordrenerende lymfeknuter i disse musene (* p 0,05, ** p 0,01 *** p 0,001): CD44
+ /CD62L
+ /CD4
+ T sentral minneceller (B); CD44
+ /CD62L
– /CD4
+ T effektor minneceller (C); CD44
+ /CD62L
+ /CD8
+ T sentral minneceller (D); CD44
+ /CD62L
– /CD8
+ T effektor minneceller (E)
Effekt av anti-CTLA-4 /gemcitabin Avhenger Timing
for å bestemme den optimale behandlingsplanen når det gjelder timing av både anti-CTLA-4 og gemcitabin, vi behandlet AB1-HA tumor-bærende mus med tre forskjellige regimer: gemcitabin fulgt av anti-CTLA-4, samtidig kombinasjonsterapi og anti-CTLA-4, etterfulgt av gemcitabin (fig S3, figur 4). Ett dyr i anti-CTLA-4, etterfulgt av gemcitabin-gruppe ble avlivet på grunn av vekttap som er større enn 15%, ellers var det ingen åpenbar toksisitet. Vi observerte markerte forskjeller i svulst utvekst mellom disse gruppene (figur 4). Det var ingen signifikant additiv verdi av kombinasjonsbehandlingen i løpet av enten anti-CTLA-4 eller gemcitabin alene når det kjemoterapeutiske legemiddel ble administrert separat fra anti-CTLA-4. Den synergistiske anti-tumor effekten ble observert bare når begge legemidlene ble gitt samtidig. Overraskende, når bare den første dosen av gemcitabin ble utelatt (som i «anti-CTLA-4 første «arm versus samtidig arm), reduserte anti-tumor effekt dramatisk (figur 4). Disse data viser at hensiktsmessig tidsplanlegging av de separate forbindelser som er avgjørende for en optimal effekt.
(A) Tumor område i mm
2 (gjennomsnitt ± SD) av AB1-HA svulster som ble injisert på dag 0, mus (n = 86) ble behandlet med ulike timeplaner for anti-CTLA4 og gemcitabin (se fig S2), eller med PBS (sammenslåtte data fra 3 separate eksperimenter er vist). (B) Kaplan-Meier overlevelses tomt på samme eksperiment.
Diskusjoner
Kombinasjonen av kjemoterapi og immunterapi i behandlingen av kreft har urealisert løfte [1]. Den nylig FDA-godkjente anti-CTLA-4 antistoff er en logisk og lett å oversette immunterapeutisk tilnærming til å kombinere med kjemoterapi. Vi antok at vi ville finne en synergistisk interaksjon med en kombinasjon av anti-CTLA-4 blokade og en immunpoten cellegift. Vi forventet at ville føre til kjemoterapi tumorkrympning og immunogene antigen frigivelse, mens anti-CTLA-4 ville forbedre T-celleaktivering og ekspansjon. Tidligere data som støtter denne hypotesen var begrenset. En stor fase III studie i metastatisk melanom sammenligne anti-CTLA-4 pluss DTIC versus DTIC alene fant en overlevelse fordel for kombinasjonsbehandling sammenlignet med DTIC kjemoterapi alene [13]. Men fordi det var ingen sammenligning med anti-CTLA-4 alene, det relative bidrag av kjemoterapi til den observerte effekten ble ikke nøyaktig vurdert. Tilsvarende er en fase II studie i ikke-småcellet lungekreft, fant bedre progresjonsfri overlevelse for kombinasjon av ipilimumab og kjemoterapi versus kjemoterapi alene; igjen her ipilimumab alene var ikke en komparator [20]. I en fase II-studie som fant sammenligne ipilimumab alene versus ipilimumab pluss DTIC, men å bruke lavere doser av studiemedisin var det en trend mot bedre sykdomskontrollrate for kombinasjonsarmen, men dette nådde ikke signifikans [21]. Basert på disse publiserte studier på mennesker, kan ingen endelig konklusjon trekkes på en mulig synergistisk effekt av anti-CTLA-4 og kjemoterapi. Selv om en tidligere dyrestudie fant forbedret anti-tumor effekt når anti-CTLA4 ble innført i melfalan kjemoterapi, dette eksperimentet brukte subterapeutiske doser av melfalan, ment å forskyve T-celle responser mot en Th1 fenotype [22]. Nylig, Wu og kolleger fant at anti-CTLA-4 behandling i kombinasjon med cisplatin resulterte i bedre sykdomskontroll i en murine mesothelioma modell, når svulster ble behandlet før de ble håndgripelig, antagelig på grunn av hemmet kreft celle repopulation [23]. Vi fant ingen publiserte data fra dyreforsøk er relevante for vår hypotese, ved bruk av terapeutiske doser av kjemoterapi i overt kreft.
Som gemcitabin er mye brukt i behandling av mange krefttyper, inkludert mesothelioma, vi testet den kombinasjonen på et godt etablerte ikke-immunogen murine modell av mesothelioma. Behandling av AB1-HA med gemcitabin resultater i moderat tumorreduksjon eller forsinket svulst utvekst i denne modellen, og dermed etterligne den kliniske situasjonen i kjemoterapeutisk behandling av de fleste metastatisk kreft.
Vi fant her at kombinasjonsbehandling av gemcitabin og anti -CTLA-4 utøves en langt større anti-tumor effekt enn noen av midlene alene, således som virker på en synergistisk måte (figur 1). Dette korrelert med en markert økning i CD4
+ ICOS
+ T celler i perifert blod, samt en klar økning i prolifererende CD4
+ T celler som bestemmes av Ki-67 flekker, selv om vi ikke detektere denne økningen i tumoren samt (figur 2). CD4
+ T-celle-infiltrasjon i tumoren ble forsterket av kombinasjonsbehandling, og en gemcitabin-assosiert reduksjon i prolifererende tumor-infiltrerende CD8
+ T-celler ble delvis reddet av CTLA-4-blokade. Viktigere, vi fant ikke noen reduksjon i tumorvekst når anti-CTLA-4 ble kombinert med cisplatin. Cisplatin har vist seg å indusere en ikke-immunogen form av celledød [17], og selv om det ikke nedregulere den hemmende molekylet PD-L2 [5], tumormodellen bruker vi uttrykker bare meget lave nivåer av PD-L2 (data ikke vist). Derfor vurderer vi cisplatin å være et ikke-immunopotensierende form av cellegift i denne modellen. Disse resultatene tyder på at kombinasjonsbehandling med anti-CTLA-4 vil være mest potente når den kombineres med immunpoten kjemoterapi.
Siden en av de teoretiske fordeler ved å kombinere kjemoterapi med immunterapi er induksjon av en langvarig immunologisk hukommelse, vi undersøkte minne T-cellerespons i mus med tumorer som hadde tilbakedannede etter behandling (figur 3). Vi fant at disse musene hadde forbedret nivåer av både CD4
+ og CD8
+ effektor minne og sentrale minne T-celler i tumor-drenering lymfeknuter, sammenfaller med beskyttende immunitet mot en reintroduksjon av tumorceller. Disse funn er i overensstemmelse med studiene i en murin OVA-uttrykk
Listeria monocytogenes
modell, hvor CD8
+ T-celle hukommelse ble forsterket av en enkelt dose av anti-CTLA-4 [14]. Viktigere i vår modell, hverken dannelse av CD4
+ eller CD8
+ minne T-celler ble hemmet av gemcitabin.
Vårt tredje mål var å bestemme den optimale sekvensen av kjemoterapi og anti-CTLA -4 terapi. Siden det er kjent fra flere dyrestudier at timing er avgjørende for bruk av anti-CTLA-4 når den kombineres med vaksinasjonsfremgangsmåter [24], [25], hypotese vi at optimal timing /planlegging i kombinasjon med kjemoterapi vil også være avgjørende for anti-CTLA-4-effekt. Vi har funnet at effekten av kombinasjonen faktisk var avhengig av scheduling: hvis gemcitabin ble administrert før eller etter at anti-CTLA-4, var det intet additiv verdi over hver behandling alene, mens samtidig behandling resulterte i sykdomskontroll i de fleste mus ( figur 4).
som konklusjon, våre resultater viser at anti-CTLA-4-terapi og cytotoksisk kjemoterapi kan ha en klar synergistisk effekt ved behandling av kreft. Våre data gir en begrunnelse for å videreutvikle kombinasjoner av cytotoksiske medikamenter og anti-CTLA-4 i klinikken. Men basert på vår data foreslår vi at for ulike grupper av cytotoksiske anti-kreft forbindelser, optimal tidsplan og immunogenisitet bør først være nøye bestemt i prekliniske modeller og små kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Behandlingsplan av gemcitabin og anti-CTLA-4 i AB1-HA modell. Balb /c-mus ble inokulert med 1 x 10
6 AB1-HA murine mesothelioma celler på dag 0 og deretter injiseres ip med PBS, 120 ug /g kroppsvekt gemcitabin hver tredje dag i fem doser (q3dx5) på dager 9- 12-15-18-21 eller 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) på dagene 9-12-15-18, enten alene eller i kombinasjon, som angitt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895. S001 product: (PDF)
Figur S2.
Behandlingsplan av gemcitabin og anti-CTLA-4 i Advisor modell. C57BL /6-mus ble inokulert med 2,5 x 10
5 LLC murine lungekreftceller på dag 0 og deretter injiseres ip med PBS, 120 ug /g kroppsvekt gemcitabin hver tredje dag i fem doser (q3dx5) på dager 6-9 -12-15-18 eller 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) på dag 6-9-12-15, enten alene eller i kombinasjon, som vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895.s002 product: (PDF)
Figur S3.
Behandlingsplan for kombinasjonsbehandling av gemcitabin og anti-CTLA-4 i AB1-HA-modellen, å sammenligne forskjellige behandlingsskjemaer. Balb /c-mus ble inokulert med 1 x 10
6 AB1-HA murine mesothelioma celler på dag 0 og deretter injiseres ip med 120 ug /g kroppsvekt gemcitabin (q3dx5) og 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) dividert over tre grupper, «samtidig» (anti-CTLA-4 på dager 9-12-15-18, gemcitabin på dager 9-12-15-18-21), «anti-CTLA-4 første» (anti-CTLA- 4 på dager 9-12-15-18, gemcitabin på dager 12-15-18-21-24) og «gemcitabin første» (gemcitabin på dager 9-12-15-18-21, anti-CTLA-4 på dager . 24-27-30-33)
doi: 10,1371 /journal.pone.0061895.s003 product: (PDF)
Figur S4.
doseoptimaliseringsstudie av anti-CTLA4 i AB1-HA modell. Tumor overflate i mm
2 (gjennomsnitt ± SD) av AB1-HA svulster som ble injisert på dag 0, mus (n = 40) ble behandlet med 75 ug anti-CTLA-4 i.p. på dager 9-12-15-18 i de angitte doser og med gemcitabin 120 mikrogram /g kroppsvekt på dager 12-15-18-21-24
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895.s004
(PDF)
Figur S5.
Gating strategi for bestemmelse av minne T-celle undergrupper i tumordrenerende lymfeknuter, ved hjelp av flowcytometri. Tumor-drenering lymfeknuter ble høstet som beskrevet i materialer og metoder delen.
