Abstract
WNT signalering er godt kjent for å spille en viktig rolle i regulering av utviklingen, celleproliferasjon og celle-differensiering i en rekke normale og cancerøse vev. Til tross for vell av kunnskap om når og hvor ulike
Wnt
gener uttrykkes og nedstrøms hendelser under deres kontroll, er det overraskende lite publisert bevis på hvordan de er regulert. Vi har nylig rapportert at avvikende WNT7A er observert i serøs ovariekarsinomer, og WNT7A er den eneste ligand akselerer ovarial tumor progresjon gjennom CTNNB1 (β-catenin) /TCF-signalisering i fravær av CTNNB1 mutasjoner. I denne studien rapporterer vi at
WNT7A
er et direkte mål for
Mir-15b
i eggstokkreft. Vi viste at en luciferase reporter som inneholder den antatte bindingssetet av
Mir-15b
i
WNT7A
3′-UTR ble betydelig undertrykt av
Mir-15b
. Mutasjon av den antatte bindingssetet av
Mir-15b
i
WNT7A
3′-UTR restaurert luciferase aktivitet. Videre
Mir-15b
var i stand til å undertrykke økte nivåer av TOPFLASH aktivitet ved WNT7A, men ikke de som fremkalles av S33Y. I tillegg
Mir-15b
doseavhengig redusert
WNT7A
uttrykk. Når vi vurdert den prognostiske betydningen av
WNT7A Hotell og
Mir-15b
uttrykk ved hjelp TCGA datasett, en signifikant invers korrelasjon hvor høy uttrykk for
WNT7A Hotell og lav-uttrykk av
Mir-15b
var assosiert med redusert overlevelse av eggstokkreft pasienter. Behandling med decitabine doseavhengig økt
Mir-15b
uttrykk, og stanse all
DNMT1
betydelig økt
Mir-15b
uttrykk. Disse resultatene tyder på at
WNT7A
er post-transcriptionally regulert av
Mir-15b
, som kan bli nedregulert av arrangøren hypermethylation, potensielt via DNMT1, i eggstokkreft.
Citation: MacLean JA II, kong ML, Okuda H, Hayashi K (2016) WNT7A Regulering av Mir-15b i eggstokkreft. PLoS ONE 11 (5): e0156109. doi: 10,1371 /journal.pone.0156109
Redaktør: Kwong-Kwok Wong, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 21 mars 2016; Godkjent: 09.05.2016; Publisert: 19 mai 2016
Copyright: © 2016 MacLean et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health CA179214
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikroRNA (mirnas) er små kodende RNA som regulerer genuttrykk ved post-transcriptional mRNA stanse. Prosessene er regulert av mirnas innebære en rekke biologiske pathways, og deres feilregulering er et felles trekk ved kreft hos mennesker [1-3]. Mir-15-familien omfatter seks høyt konserverte medlemmer,
MIR-15a
,
Mir-15b
,
MIR-16-1
,
MIR-16- 2
,
MIR-195 Hotell og
MIR-497
, som er gruppert på tre forskjellige kromosomer [4, 5].
MIR-15a /16-1
klynge, ble opprinnelig rapportert som mål for 13q14 slettinger eller nedregulering i kronisk lymfatisk leukemi (KLL) [6]. Spesielt
MIR-15a Hotell og
MIR-16-1
direkte regulere
BCL2
, som er en anti-apoptotiske onkogen [7], og dermed fungere som tumor suppressors ved å indusere apoptose [8]. Videre studier har vist at
MIR-15a Hotell og
MIR-16-1
fungere som mulige kreftdempere ved å målrette
BCL2
,
BMI1 CCND1
,
MCL1 Hotell og
WNT3A
i KLL, melanom, samt tykktarm, blære, eggstokkene og prostatakreft [4, 9, 10].
Mir-15b Twitter /
MIR-16-2
klynge, som ligger i 3q25, har også blitt rapportert å handle i tumor undertrykkelse av målretting
BCL2
,
BM1
,
CCND1 Hotell og
SUZ12 product: [11-13]. Reduksjon av
MIR-15b
ble observert i CLL, melanom, mage og kjemoresistent tunge kreft, så vel som kreft stamceller [11-15]. Sletting av
Mir-15b Hotell og
MIR-16-2
fremmer B-celle patogenesen [11]. Dermed blir direkte mål av Mir-15 familiemedlemmer er sannsynlig å være kritiske onkogener.
Vi har nylig rapportert at oppregulering av WNT7A (unikt blant 19 Wnt ligander) resulterer i akselerert utvikling og progresjon av eggstokkreft (OvCa), og spiller en avgjørende rolle i tumorprogresjon mediert av WNT7A /CTNNB1 signalveien [16, 17]. Våre studier indikerer videre at
FGF1
er en direkte nedstrøms mål for WNT7A /CTNNB1 signalering, og at denne veien har potensial som en terapeutisk OvCa mål [16]. En av våre funn tydelig viste at høyt uttrykk for
WNT7A Hotell og
FGF1
var korrelert i OvCa, spesielt i serøs karsinomer, og dårlig generelle pasientoverlevelse [16]. Dermed koder WNT7A en potent onkogen faktor av betydning for OvCa. Men vi vet fortsatt ikke svaret på hvorfor WNT7A blir spesielt overexpressed i serøs OvCa.
I denne studien rapporterer vi at rikelig WNT7A, til stede i OvCa, er post-transcriptionally nedregulert ved
MIR-15b
. Til støtte for sin rolle i kreft hemming, OvCa pasienter hadde dårlig total overlevelsesrate i gruppen med høy ekspresjon av
WNT7A Hotell og lavt uttrykk for
Mir-15b
. Videre tyder våre resultater at DNMT1 modulerer
Mir-15b
transkripsjon gjennom arrangøren metylering.
Materialer og metoder
Reagenser og plasmider
3′ UTR segmenter av endogen
WNT7A
genet og dens mutant skjemaet ble forsterket av PCR og subklonet i pMIR-RAPPORT vektor (Thermo Fisher) ved hjelp av Spel og Hindi restriksjonssetene å generere pMIR-
WNT7A
og pMIR-
WNT7A
mutasjon 3′-UTR-holdige plasmider. Decitabine (5’aza-2’deoxycytidine, aka: 5-aza-2′-DC),
mir
Vana miRNA etterligne (negativ kontroll og HSA-Mir-15b-5p), DNMT1 sirnas, pre- MIR-15b uttrykk konstruerer og Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem ble kjøpt fra Cayman Chemical, Thermo Fisher, Qiagen, System biovitenskap og Promega hhv.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
OVCAR3, OVCAR5, SKOV3, og ES2-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). OVCAR4 celler ble begavet fra Dr. Joanna Burdette (University of Illinois i Chicago). Kuramochi, OVKATE og OVSAHO ble kjøpt fra JCRB cellen bank (Osaka, Japan). SKOV3.ip1 celler ble kjøpt fra cellen bank ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Alle celler ble godkjent av kort tandem repeat (STR) analyse og passert innen 6 måneder etter mottak. Alle celler ble undersøkt rutinemessig for celleproliferasjon og BrdU-inkorporering samt mycoplasma forurensning. Alle cellelinjer utstilt lignende morfologi, karakteristiske vekstrater, og forble negativ for mycoplasma forurensning gjennom alle forsøkene. OVCAR4, Kuramochi, OVKATE og OVSAHO-celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS og penicillin /streptomycin, og andre celler ble dyrket i DMEM med 10% FBS, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin. Alle cellelinjer ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C og konstant 5% CO
2.
Kvantitativ real-time PCR (qPCR) assay
Total RNA ble ekstrahert fra cellene og cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit fra Thermo Fisher. Relativ genekspresjon ble bestemt ved SYBR grønn (Bio Rad) inkorporering ved anvendelse av en Bio-Rad myCycler som tidligere beskrevet [18]. Mikro-RNA ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av en lenke Pure miRNA isolasjonskit (Thermo Fisher), og cDNA ble syntetisert ved hjelp av miScript II RT Kit (Qiagen). Relativ miRNA uttrykket ble bestemt av miScript SYBR Grønn PCR kit (Qiagen), og MIR-15b og SNORD68 spesifikke primere (Qiagen). En tabell av oligonukleotider som brukes for hvert gen er presentert i S1 tabell.
celleproliferasjon og heft analyser
Cell spredning, vedheft og migrasjon analysene ble utført ved å følge våre tidligere beskrevne metoder [16, 17] . For å vurdere celleproliferasjon, ble cellene sådd ut i 24-brønners plater, og telles 24, 48 og 72 timer etter Countess II FL Automated Cell Counter (Thermo Fisher) med trypan blå eksklusjon. For å vurdere celle adhesjon ble cellene sådd i 24-brønners plater og høstet etter 4 timers inkubering.
Statistiske analyser
Alle eksperimentelle data ble utsatt for enveis ANOVA og forskjeller mellom de enkelte midler var testet ved en multippel-range test Tukey ved bruk av Prism 5,0 (Graphpad). QPCR data ble korrigert for forskjeller i utvalget lasting ved hjelp av
RPL19
data som en kovariat. Tester av betydning som ble utført med de aktuelle feil vilkår i henhold til forventning om gjennomsnittskvadratene for feil. En p-verdi på 0,05 eller mindre ble betraktet som signifikant. Data er presentert som gjennomsnitt med standard feil av gjennomsnittet (SEM). Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne overlevelse og ble evaluert av log-rank test med en TCGA datasett, ble TCGA-OV som inneholdt 554 primær ovarietumorer med ferdige datasett, valgt for overlevelsesanalyse.
resultater
WNT7A uttrykk i OvCa celler avhengig av genetisk bakgrunn eller har
Når vi rapporterte kliniske betydningen av WNT7A under malign transformasjon av OvCa våre resultater viste at
WNT7A
ble sterkt uttrykt i serøs karsinomer, den vanligste /aggressive undertype av OvCa [16, 17]. Dermed kunne avvik WNT7A være forårsaket av unormal genetisk bakgrunn eller korrelert med aggressive tegn i OvCa. Når vi undersøkte
WNT7A
uttrykk nivåer i OvCa celler, rikelig
WNT7A plakater ( 1000 ganger) ble observert i invasive eller høyverdig serøs OvCa celler (SKOV3.ip1, Kuramochi, OVCAR4 og OVSAHO, S1 fig). Merk: Kuramochi, OVCAR4 og OVSAHO celler har nylig blitt bekreftet som høyverdig serøs OvCa cellelinjer av genomisk profilering [19]. SKOV3.ip1 celler besitter svært invasive og metastatiske egenskaper som disse cellene er isolert fra ascitesvæsker [20]. ES2, OVCAR3 og OVCAR5 celler har genomisk profiler som er delvis lik serøs OvCa svulster.
WNT7A er et direkte mål for Mir-15b
Vi undersøkte transkripsjonen aktivering av
WNT7A
promoter ved hjelp luciferaserapportørplasmid analyser, men vår sletting analyser viste ingen kritiske områder eller potensielle regulatorer innenfor en avstand på 10 kb opp- eller ned-stream av
WNT7A
promoter (data ikke vist) . Derfor har vi utsatt
WNT7A
3′-UTR til en in silico analyse ved hjelp av 3 forskjellige algoritmer (TargetScan, PicTar og Miranda) for å identifisere mulige miRNA frø-samsvarende sekvenser. Alle tre søkemotorer oppdaget
MIR-15a
,
Mir-15b Hotell og
Mir-195
konsensus bindende sekvenser (figur 1A) i 3′-UTR av
WNT7A product: (fig 1B). Vi neste evaluert den prognostiske betydningen av
WNT7A Hotell og /eller
Mir-15b
uttrykk ved hjelp TCGA datasett (totalt pasientnummer er 554). Mens høy uttrykk for
Mir-15b product: (n = 278) viste en god prognose (P = 0,0394) sammenlignet med lav-uttrykk for
Mir-15b product: (n = 276),
WNT7A
viste ingen korrelasjon (høy-uttrykk for WNT7A, n = 279 vs low = uttrykk for WNT7A, n = 275, P = 0,2364). En signifikant invers korrelasjon hvor høy uttrykk for
WNT7A Hotell og lavt uttrykk for
Mir-15b product: (n = 147 vs n = 146 med lav uttrykk for
WNT7A
og høy uttrykk for
Mir-15b
) var assosiert med redusert overlevelse av eggstokkreft pasienter ved log-rank test (P = 0,0297, figur 1C). MERK: høy uttrykk for
WNT7A Twitter /
Mir-15b
n = 132 og lav uttrykk for
WNT7A Twitter /
Mir-15b
n = 129 ble ikke inkludert i omvendt korrelasjonsanalyse. Det ble imidlertid ikke invers korrelasjon sett mellom
WNT7A Hotell og
MIR-15a
eller
MIR-197 plakater (data ikke vist). Derfor fokuserte vi på
Mir-15b
for videre analyser. I tillegg undersøkte vi den inverse sammenhengen mellom
BCL2 Hotell og
Mir-15b
, som
BCL2
er en av de kjente mål for Mir-15 familie og fungerer som et onkogen. Men ingen signifikant sammenheng mellom
BCL2 Hotell og
Mir-15b
om overlevelse av eggstokkreft pasienter som bruker TCGA-OV datasett (P = 0,2760) ble observert, noe som tyder på at
WNT7A
er en mer relevant kritisk mål på
Mir-15b
med hensyn til OvCa.
(A) Bioinformatikk prediksjon av miRNA samspill med seeded sekvenser fra 3′-UTR av
WNT7A
ved hjelp av tre forskjellige algoritmer. (B) Skjematisk av den antatte
Mir-15b
bindende sekvens i
WNT7A
3′-UTR. (C)
WNT7A
eller
BCL2 Hotell og
Mir-15b
uttrykk omvendt korrelerer med overlevelse beregnes med TCGA-OV datasett (totalt n = 554, høy
WNT7A Twitter /
Mir-15b
, n = 132; høy
WNT7A Twitter /lav
Mir-15b
, n = 147; lav
WNT7A
/høy
Mir-15b
, n = 146, lav
WNT7A Twitter /
Mir-15b
, n = 129) av Kaplan-Meier metoden å bruke Prism 5.0. P-verdi ble fastsatt av den lange rank test.
Vi brukte TargetScan 7.0 [21], for å identifisere
Mir-15b
målse i
WNT7A
3′-UTR og fant en antatt
Mir-15b
bindingssete (figur 1B). For å undersøke om
Mir-15b
binder seg til denne sekvensen, OvCa celler ble transfektert med pMIR-RAPPORT plasmid som inneholder den antatte bindingssetet av
Mir-15b
i
WNT7A
3′-UTR, og
mir
Vana miRNA etterligne (negativ kontroll eller Mir-15b), og deretter luciferaserapportørplasmid aktivitet ble målt (figur 2A). Luciferase aktivitet ble betydelig undertrykt av
Mir-15b
sammenlignet med negativ kontroll. I forrige undersøkelse, har vi vist at WNT7A aktiverer kanoniske CTNNB1 signalveien [16, 17]. For å avgjøre om
Mir-15b
hemmer WNT7A handling, undersøkte vi CTNNB1 mediert transkripsjonen aktivitet med TOPFLASH reporter konstruksjon (figur 2B). Vi fant ut at
Mir-15b
betydelig undertrykt TOPFLASH reporter aktivitet. Når TOPFLASH aktivitet ble økt med WNT7A eller S33Y-mutert CTNNB1 (en etablert positiv kontroll for aktivering av TOPFLASH reporter) i ES2 celler, som ydmyk eller undetectably besitter endogene WNT7A,
Mir-15b
var i stand til å undertrykke økt nivåer av TOPFLASH aktivitet ved WNT7A, men ikke de som er indusert av S33Y (fig 2B). Videre mutasjon av den antatte bindingssetet av
Mir-15b
i
WNT7A
3′-UTR (5’TGCTGCT3 «til 5’TaaTGCT3») restaurert luciferaseaktiviteten tidligere undertrykt av
MIR-15b plakater (figur 2C). Til støtte for disse funnene,
Mir-15b
doseavhengig redusert
WNT7A
mRNA nivåer i OvCa celler (figur 3). Disse resultatene tyder på at
WNT7A
uttrykk er direkte regulert av
Mir-15b
i OvCa. Fordi
BMI1 Hotell og
BCL2
har blitt rapportert som målgener av
Mir-15b
i kreft [12, 13], deres mRNA nivåer i OvCa ble også undersøkt. Mens
Mir-15b
var i stand til å redusere
BCL2
,
BMI1
ble ikke regulert av
Mir-15b
i OvCa celler.
(A) Luciferase reporter analyse av
WNT7A
3′-UTR i SKOV3.ip1 og OVSAHO cellene 48 timer etter transfeksjon av
Mir-15b
eller negativ kontroll etterligner. Ulike bokstaver betegner rapportør aktiviteter som har statistisk signifikant (P 0,05) forskjeller i gjennomsnittlig aktivitet. (B) TOPFLASH reporter analyse i SKOV3.ip1 og OVSAHO cellene 48 timer etter transfeksjon av
Mir-15b
eller negativ kontroll etterligner (til venstre). TOPFLASH reporter analyse i ES2 cellene 48 timer etter transfeksjon av
Mir-15b
etterligne, WNT7A eller S33Y med negative kontroller (etterligne eller pcDNA3.1, høyre). (C) Luciferase reporter analyse av
WNT7A
3′-UTR, mutasjon av
WNT7A
3′-UTR eller pMIR-RAPPORT vektor i SKOV3.ip1 og OVSAHO cellene 48 timer etter transfeksjon av
Mir-15b
eller negativ kontroll ligne.
data ble satt til bakgrunnsnivået av en med hensyn til å kontrollere nivåer. Ulike bokstaver angir transkripsjoner som har statistisk signifikant (p 0,05). Forskjeller i gjennomsnittlig uttrykk nivåer
MiR-15b hemmer celledeling og heft
rolle
speil 15b
som en tumor suppressor er blitt karakterisert, som tap av
MIR-15b
hos mus fører til utvikling av B-celle maligniteter [11], og overekspresjon av
MIR-15b
undertrykker metastase formidling ved hjelp av tungen kreft xenografter [12]. I denne studien,
Mir-15b
overekspresjon OvCa celler ble tidsavhengig mindre proliferative (fig 4A), og redusert celle adhesjon (Fig 4B), noe som indikerer at
Mir-15b
fungerer også som tumor suppressor i OvCa.
(A) Celleproliferering eller (B) heft med enten
Mir-15b
uttrykker eller kontroll celler.
MiR-15b er regulert av arrangøren hypermethylation
Våre nåværende resultater tyder på at rikelig uttrykk for
WNT7A
er sannsynligvis forårsaket på grunn av nedregulering av
Mir-15b
. Den prognostiske effekten av OvCa pasienter med invers korrelasjon av
WNT7A Hotell og
Mir-15b
ytterligere støtte denne hypotesen. Derfor testet vi muligheten for at
Mir-15b
kan bli nedregulert i OvCa gjennom promoter hypermethylation. Behandling med en hemmer av DNMTs, 5-aza-2’dC, doseavhengig økt
Mir-15b
uttrykk og redusert
WNT7A
uttrykk i OvCa celler (figur 5A). Når vi undersøkte uttrykk nivåer av tre aktive DNMT isoformer (
DNMT1
,
DNMT3A Hotell og
DNMT3B
) i 5-aza-2’dC (5 mm) behandlet OvCa celler, bare
DNMT1
ble redusert i SKOV3.ip1 og OVCAR4 celler (figur 5B), noe som indikerer at DNMT1 kan være funksjonelt å metilat
Mir-15b
. Faktisk stanse av
DNMT1
betydelig økt
Mir-15b
uttrykk i OvCa celler (figur 5C), noe som tyder på at
Mir-15b
er potensielt nedregulert, spesielt i høy WNT7A-uttrykke celler, av arrangøren hypermethylation via DNMT1 i OvCa.
(A) 5-aza-2′-dC behandling induserer
Mir-15b
uttrykk (til venstre) og reduserer
WNT7A
uttrykk (til høyre) i OvCa celler. Cellene ble behandlet med 5-aza-2′-dC i 3 dager, og
MIR-15b
eller
WNT7A
ble bedømt ved qPCR sammenlignet med 0 uM kontroll (satt til bakgrunnsnivået en i hver celle). Ulike bokstaver betegner transkripter som har statistisk signifikant (P 0,05) forskjeller i midlere ekspresjonsnivåer. (B)
DNMT1
,
DNMT3A Hotell og
DNMT3B
uttrykk nivåer ble vurdert i OvCa celler etter 5-aza-2′-DC (5 mm) behandling i 3 dager . (C) uttrykk nivåer av
DNMT1 product: (øverst) og
Mir-15b plakater (nederst) ble vurdert i OvCa celler transfektert med DNMT1 siRNA 1-4, DNMT1 siRNA blande eller rykke kontroll. Ulike bokstaver angir transkripsjoner som har statistisk signifikant (P 0,05). Forskjeller i gjennomsnitts uttrykk nivåer
Diskusjoner
WNT signalering er godt kjent for å spille en viktig rolle i kreft biologi [22 ]. Mens CTNNB1 er nøkkelen formidler av WNT signalisering, har man vist at WNT7A er den eneste ligand som aktiverer intakt CTNNB1 /TCF-signalering (det vil si i løpet av celler som mangler aktivering ved mutasjon av CTNNB1), spesielt serøs OvCa subtype [16, 17]. Til tross for vell av kunnskap om uttrykket av ulike Wnt ligander og nedstrøms hendelser under deres kontroll, er det overraskende lite publisert bevis på hvor
Wnt
genene er regulert, og hvorfor noen medlemmer er oppregulert i bestemte krefttyper. Nylig,
WNT3A
, som fremmer tumorigenesis via akselerert cellulær proliferasjon og invasjonen [23], er funnet å være direkte regulert av
MIR-15a /16-1
klynge, og oppregulering av
WNT3A
er omvendt korrelert med redusert
MIR-15a Hotell og
MIR-16-1
i avanserte prostatakreft [10]. I denne studien, bioinformatikk seed-samsvarende programmer identifisert tre svært konservert MIR-15 familiemedlemmer,
MIR-15a
,
Mir-15b Hotell og
MIR-195
, som kan være kritiske regulatorer av
WNT7A
. Men verken
MIR-15a
eller
MIR-195
utstilt signifikant invers korrelasjon med
WNT7A
i OvCa pasient overlevelse datasett. Dermed
WNT7A
uttrykk er mest sannsynlig reguleres av
Mir-15b
i OvCa.
Tidligere arbeid i KLL har vist tumor suppressor aktivitet av
MIR-15a /16-1
klyngen er avhengig av undertrykkelse av
BCL2 product: [8].
BCL2
har også blitt rapportert som en direkte mål for
Mir-15b
med en modell av legemiddelresistent magekreftceller [13]. Det har blitt karakterisert som
MIR-15b /16-2
knockout mus utvikler B-celle malignitet, mens BCL2 svakt oppregulert i B-celler fra knockout mus [11]. Våre resultater viste at
Mir-15b
trykt
BCL2
uttrykk i OvCa celler. Men ingen invers korrelasjon mellom
BCL2 Hotell og
Mir-15b
ble observert i analysen av pasientens overlevelse i OvCa. Disse resultatene tyder på at reguleringen av BCL2 av
Mir-15b
har mindre innvirkning på eggstokkene tumorigenesis.
Handlingene til
Mir-15b
som en tumor suppressor har blitt tydelig demonstrert i patogenesen av B-celler i CLL [11]. I tillegg overekspresjon av
Mir-15b
hemmer metastase formidling via epitel-mesenchymale overgang i modellen av kjemoresistent tungen kreft celletransplantater [12]. Nedregulering av
Mir-15b
oppstår i brystkreft stamceller, og overekspresjon av
Mir-15b
hemmer deres vekst og differensiering [15]. Inhibering av celleproliferasjon målretting av cyclin D1, og induksjon av apoptose ved
MIR-15b
har også blitt rapportert [11-14, 24]. Våre resultater ytterligere støtte
Mir-15b
«s tumor suppressor funksjon, og legge til hemming av OvCa celleproliferasjon og celle vedheft til sin liste av relevante svulster.
I denne studien, viste vi at 5-aza-2′-dC, en hemmer av DNMT aktivitet, økt
Mir-15b
uttrykk. Tilsvarende redusert
DNMT1
ble observert ved behandling av 5-aza-2′-DC, og stanse all
DNMT1
økt
Mir-15b
i OvCa celler. Økte DNMT1 nivåer har blitt rapportert i OvCa, med lavere uttrykk i primære stadium I /II svulster og peak uttrykk som forekommer i stadium III /IV [25]. DNMT1-mediert promoter hypermethylation induserer reduksjon av E-cadherin og utvikler invasive trekk OvCa [26]. Det er en rapport som ser på sammenhengen mellom endring i kopiantall på kromosom plasseringen av
Mir-15b Hotell og endringene i
Mir-15b
promoter metylering status for brystkreft, eggstokkreft, hode og nakke , lunge og nyre cancer ved å bruke TCGA datasett [27]. Denne gruppen funnet signifikant korrelasjon mellom
Mir-15b
uttrykk og kopiere nummer variasjon på de loci, samt mellom
Mir-15b
uttrykk og metylering nivåer i de aktuelle krefttyper og den samlede data fra alle krefttyper. Merk: Ingen metylering data er tilgjengelig for eggstokkreft i TCGA (kun uttrykk og kopiantall endring). Videre er promotorområdet av
MIR-16-2
, som er til stede i en klynge med
MIR-15b
lokalisert på kromosom 3q25, metyleres i polycytemi vera CD34 + celler [28]. Selv om epigenetisk regulering av
Mir-15b
i OvCa gjenstår å bli undersøkt, kan DNMT1 være en av de regulatorer å undertrykke
Mir-15b
.
I sammendraget, vi funnet at
WNT7A
er direkte regulert av
Mir-15b
i OvCa. Som WNT7A aktiverer tumorvekst og progresjon i OvCa via WNT7A /CTNNB1 signalveien [16, 17], nedregulering av
Mir-15b
tillater avvikende
WNT7A
uttrykket ytterligere støtte virkningen av WNT7A og dens mekanismer i OvCa.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. . Relative
WNT7A
uttrykk ble vurdert av qPCR i OvCa celler
Data er uttrykt som fold over ES2 uttrykk nivåer, som var nær bakgrunn og vilkårlig satt til 1.
doi: 10,1371 /journal. pone.0156109.s001 product: (EPS)
S1 Table. Primere for qPCR
doi: 10,1371 /journal.pone.0156109.s002 product: (PDF)
Takk
Vi takker Dr. Manjeet Rao (The University of Texas Health Science Center på San Antonio) for å gi pMIR-RAPPORT vektor, og Dr. Joanna Burdette (University of Illinois i Chicago) for å gi OVCAR4 celler.
