Abstract
kreftstamceller (cscs) har vist seg å megle tumorigenicity, cellegift-motstand, radio-motstand og metastasering, som foreslår at de anses terapeutiske mål. Fordi deres differensierte dattercellene ikke lenger tumorigen, for å indusere differensiering av cscs kan være en av strategiene som kan utrydde cscs. Her viser vi at ATOH1 kan indusere differensiering av mage kreft stamceller (GCSCs). Real time PCR og Western blot analyse viste at ATOH1 ble indusert under differensiering av GCSCs. Videre lentivirus-indusert overekspresjon av ATOH1 i GCSCs og i magekreftcellelinjer betydelig indusert differensiering, redusert spredning og sfære formasjon, og redusert
in vivo
tumordannelse i subkutane injeksjons og levermetastaser xenograft modeller. Disse resultatene foreslår ATOH1 anses for utvikling av en differensiering terapi for magekreft
Citation. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) ATOH1 kan regulere tumorigenitet av magekreft celler ved å indusere differensieringen av kreft stamceller. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10,1371 /journal.pone.0126085
Academic Redaktør: Gianpaolo Papaccio, Second Universitetet i Napoli, Italia
mottatt: 03.09.2014; Godkjent: 30 mars 2015; Publisert: 07.05.2015
Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir, bortsett fra RNA sekvense data som ble avsatt på offentlig register. (GEO-tilgangsnummeret: GSE46597)
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av Bio and Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) av National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MEST), og et stipend fra National R D Program for Cancer Control, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, republikken Korea (0920050) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Etter kreft stamceller (cscs) ble opprinnelig isolert fra leukemi pasienter, hadde de vært isolert fra mange krefttyper, blant annet magekreft [1,2,3,4,5,6]. Cscs har blitt foreslått å være et terapeutisk mål fordi de kan formidle tumorigenicity, cellegift-motstand, radio-motstand og metastase [7,8,9]. Konvensjonell anti-kreft terapi i hovedsak retter seg mot voksende ikke-cscs, noe som forklarer den hyppige tilbakefall av kreft [9]. Den dårlig prognose for pasienter med større CSC befolkningen, oppfordrer også utvikling av legemiddel som er rettet mot cscs [10].
En av karakteristikkene av cscs er at de kan differensiere til datterceller som ikke lenger er tumorigen, for eksempel , cscs fra tykktarm og mage kreft har blitt overtalt til å differensiere ved serum [5,6]. Dette betyr at CSC hypotesen avviker fundamentalt fra den tradisjonelle klonal ekspansjon hypotese. Videre kan det hierarkiske forholdet mellom cscs og deres dattercellene forklares med epigenetiske mekanismer som kan brukes til normale stamceller [11,12]. I tillegg kan mikromiljøet påvirke differensieringen av cscs [13], og disse egenskaper kan utnyttes for utvikling av behandlingsformer.
I henhold til induksjon av differensiering er en strategi som kan brukes til å utrydde cscs. Epigenetiske regulatorer er blitt foreslått å indusere deres differensiering, for eksempel, histon-deacetylase (HDAC) inhibitorer er blitt vist å indusere differensiering av cscs i leukemi som ble forårsaket av fusjonsproteiner, så som AML1-ETO og PML-RARα [14,15 ]. Dessuten kan all-trans retinsyre (ATRA) indusere differensiering av cscs i akutt promyelocytisk leukemi (APL) via C /EBP faktorer [16,17], vill-type transkripsjonfaktorer, for eksempel, C /EBPα kan induserte differensiering av human AML og i lungekreftcellelinjer og i mus
in vivo
modeller [17,18,19,20]. I magekreft, har suramin vist å indusere differensiering av menneskelige mage kreft cellelinjer [21].
ATOH1 er en grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktor homolog til Drosophila atonal [22]. Den aktiverer E boks avhengig transkripsjon i samarbeid med E47 [23]. HES1, et molekyl som i hakk signalveien, kan hemme dets ekspresjon [24]. Knock-out mus studier har vist at ATOH1 spiller avgjørende roller i generering av lillehjernen granule nevroner, indre øret hårcellene, ryggmargs interneurons, Merkel celler i huden og tarm sekretoriske celler [25]. Interessant nok har ATOH1 vært forbundet med ulike typer kreft, inkludert tykktarmskreft [25].
For å utvikle en ny differensiering terapi i magekreft, analyserte vi uttrykk endringer på mRNA-nivå i løpet av differensiering av magekreft stammen celler (GCSCs). Det ble funnet at i løpet av differensieringen av GCSCs, ekspresjonsnivået av ATOH1, noe som er viktig for differensiering av intestinale epitelceller [26,27], ble betydelig økt. I tillegg induksjon av ATOH1 i magekreft cellelinjer og i GCSCs betydelig redusert sin tumorigenicity i subkutane injeksjons og levermetastaser modeller
Materialer og amp.; Metoder
Magekreft stamcellekulturer
magekreft vev ble hentet etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Pusan National University Hospital (PNUH) og Pusan National University paraply Hospital (PNUYH ). Studien protokollen ble godkjent av Pusan National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) og Pusan National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Gastric kreftstamceller ble dyrket som tidligere beskrevet [6], og ble overtalt til å differensiere ved å tilsette 5% FCS til media i stedet for vekstfaktorer.
Kultur av magekreftcellelinjer
Magekreft -celler (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100
ug
/ml penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet inkubator. Disse cellelinjer ble oppnådd fra Korean cellelinje Bank (Seoul, Korea).
Culture of 293ft cellelinje
293ft-celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og 0,1 mM MEM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1 mM MEM natrium pyruvat (begge fra Sigma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM L-glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), og 1% Pen-streptokokk i en 5% CO
2 fuktet inkubator.
RNA sekvensering og dataanalyse
Bibliotek ble utarbeidet etter den IlluminaTruSeq RNA Sample Prep Kit og sekvensert ved hjelp av Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, California, USA) for å generere 76 bp sammenkoblet slutten leser. Sekvensert leser ble justert på et menneskelig referanse genom 19 bruker Tophat 2 [PubMed id 19289445]. mRNA uttrykk ble målt som RPKM (Leser Per kilobase per million kartlagt leser) fra entydig kartlagt leser ved hjelp av en hg19 RefSeq modell og HTSeq pakken (https://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Bed filene ble produsert ved hjelp Tophat 2. Alle RNA sekvense data ble avsatt på offentlig register (GEO-tilgangsnummeret: GSE46597)
Real time PCR
Utvinning av RNA og sanntids PCR ble utført. ut ved hjelp av en Power SYBR Grønn PCR Master Mix og en ABI Prism 7500 sekvens detektor (begge fra Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), som tidligere beskrevet [28]. Primersekvensene som brukes (forover og bakover, henholdsvis) var som følger: Differensierings markører; CA1, 5’TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG -3 «og 5’CCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G -3»; SSTR2, 5’CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG -3 «og 5’CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C -3»; CHGA, 5’GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C -3 «og 5’TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT -3»; PGC2, 5’TGG CCT ACC CTG CTC TGT CCG -3 «og 5’ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3»; MUC5AC, 5’TCA CAC GGT CCT GCC CAC AGA G -3 «og 5’ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC -3»; ATP4B, 5’GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C -3 «og 5’TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3»; Stemness markører; CD44, 5’GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT -3 «og 5’AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3»; LGR5, 5’GAG CTG CCT TCC AAC CTC AG -3 «og 5’CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3»; BMI1, 5’TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG -3 «og 5’AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG -3»; og c-myc, 5’ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 «og 5’CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3»; ATOH1, 5’CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 «og 5’ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC -3»; GAPDH 5’GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC -3 «og 5’ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3». GAPDH ble brukt til å standardisere cDNA inngangsnivåer
Western blot analyse
Western blot analyse ble utført som tidligere beskrevet [24], ved hjelp av følgende antistoffer:. ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, USA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); c-myc, caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); kløyvet caspase-3, caspase-9, kløyvde caspase-9 (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, β-actin antistoff (Abcam, Cambridge, MA, USA) og HRP-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA).
Lentiviral konstruerer og generering av aktive virus
Hvis du vil lage et uttrykk klone, sekvens verifisert viral ORF Clones (ATOH1, IOH34744, Life Technologies, Grand Island, New York) i Gateway oppføring vektorer ble overført til pLenti7.3-MÅL vektor (pLenti7.3/V5-dest Gateway Vector Kit, Life-teknologi, Grand Island, NY, USA) ved hjelp av en LR rekombinasjon reaksjon (LR Clonase II enzym mix, Life-teknologi, Grand Island, NY, USA). For transformasjon ble One Shot Stbl3 kompetente E. coli (Life Technologies) benyttet. Etter kotransfeksjon av uttrykket klone og ViraPower emballasje Mix (Life Technologies) i 293ft cellelinje (Life Technologies) for å produsere lentivirus, ble lentiviral supernatantene høstet. Disse lentiviral aksjer ble brukt til å omsette GCSCs og mage kreft cellelinjer.
Virus innsamling og spredning ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Life Technologies). Kontrollen viruset ble generert parallelt uten inkludering av ATOH1.
Bygging av RASSF4-reporter cellelinjer og luciferase assay
Gluc-ON Arrangøren Reporter Clones, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) ble anvendt for å konstruere RASSF4-luciferase reporter cellelinjer (NCI-N87 og SNU216 celler), og puromycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble anvendt for seleksjon. Lentivirus beskrevet ovenfor ble brukt til å indusere ATOH1. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Secrete-Pair Gaussia Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) i henhold til produsentens instruksjoner på 72 timer etter transduksjon.
Xenotransplantat analysen
Celler ble fortynnet til en passende injeksjonsdose (1×10
6-celler), blandet med BD Matrigel (BD Biosciences, CA, USA) ved en 1: 1-forhold, og injisert subkutant på den dorsale side av hver flanke i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus (n = 5 /gruppe). For å minimalisere variabiliteten eksperimentelt på grunn av individuelle forskjeller i resipientmus ble celle-populasjoner som skulle sammenlignes sprøytes på motstående flanker av de samme dyrene. Svulster ble høstet etter 4 uker og tumorvekt ble målt. For levermetastase modell, ble SCID-mus ble bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av ketamin /xylazin kombinasjon. Deretter ble musene snittet ca 10 mm til venstre subcostal ble milten bekreftet under peritoneum, ble peritoneum åpnet for omtrent 8 mm, og milten ble eksponert over peritoneum. Cellene (5×10
4 celler /100
ul
) ble langsomt injisert i milten til mus via en 27-gauge nål (n = 5 /gruppe) og deretter ble milten ble returnert til bukhulen , peritoneum og såret ble sydd. 4 uker etter inokulering med celler, ble musene avlivet [37]. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr utstedt av National Institute of Health. Pusan National University-Institutional Animal Care og bruk Committee (PNU-IACUC) godkjent alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr.
Celleproliferering analysen
Fem dager etter transduksjon med lentivirus, 10
ul
av ferdigblandet vannløselige tetrazoliumsalt-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) ble tilsatt til brønnene. Disse cellene ble deretter inkubert i to timer og cellelevedyktigheten ble bestemt ved å måle absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en ELISA-leser (TECAN, Mannedorf, Sveits).
Sphere dannelsesbestemmelsen
sfærer ble dissosiert i enkeltceller og sådd ut i 96-brønners plater i 0,2 ml volumer av mediet. Hver brønn i 96-brønners plate inneholdt mindre enn 10 celler. Celler ble deretter dyrket og overvåket i 5-7 dager. Spheres større enn 25 mikrometer ble regnet med invertert mikroskop og effektiviteten i sfæren formasjonen ble sammenlignet.
Dataanalyse
Den parametriske Mann-Whitney U-test eller t-test (uparede sammenligninger) ble anvendt for å bestemme de betydninger av forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene til to grupper, og en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey største multiple sammenligninger ble anvendt for å bestemme de betydninger av forskjeller mellom middelverdiene av tre eller flere grupper . * Angir en P-verdi av 0,05, som ble ansett betydningen kriteriet. Data ble analysert ved hjelp av SPSS programvare, versjon 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SDS.
Resultatene
Induksjon av ATOH1 under differensiering av GCSCs
differensiering av GCSCs av serum har tidligere blitt vist [6]. Å identifisere faktorer assosiert med differensiering, sammenlignet vi mRNA uttrykk profiler av stamceller og celler i differensierte celle stater av RNA sekvensering. Mange tumorsuppressorgener ble indusert under differensiering (data ikke vist). Interessant, ATOH1, en transkripsjonsfaktor kritisk for differensiering av intestinale epitelceller ble også indusert. For å bekrefte dette induksjon av ATOH1 under differensiering, undersøkte vi endringer i uttrykket nivået av ATOH1 av real time PCR og Western blot analyse. Vi fant som GCSCs nærmet terminal stadier av differensiering, uttrykk for ATOH1 økt (figur 1).
differensiering av GCSCs ble indusert ved å legge FBS. mRNA-ekspresjonsnivåer ble bestemt ved sanntids-PCR (A). Resultatene er uttrykt som middel ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Protein uttrykk nivåer ble bestemt ved western blot analyse (B).
Overuttrykte av ATOH1 indusert differensiering av GCSCs
For å bestemme roller ATOH1 under GCSC differensiering, vi overexpressed det i GCSCs hjelp lentivirus. For å sjekke differensiering statuser, undersøkte vi uttrykket nivåer av ulike markører for differensiering eller stemness. Spesielt, overekspresjon av ATOH1 i GCSCs økt uttrykket nivået av ulike differensieringsmarkører, men reduserte uttrykket nivåer av ulike stemness markører (fig 2).
Ulike markører for differensiering (A) eller stemness (B) var undersøkt etter overekspresjon ATOH1 i GCSCs ved real-time PCR (A, B) og western blot analyse (C). Resultatene er uttrykt som middel ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0.01.
Neste vi undersøkt om ATOH1 kunne regulere spredning eller sfære formasjon. Interessant, overekspresjon av ATOH1 betydelig redusert de proliferations av ulike typer mage kreft cellelinjer og sfære formasjon ved GCSCs (fig 3).
Scale bar = 100
mikrometer
. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk *
P
0.01.
ATOH1 overekspresjon redusert
in vivo
tumorigenicity
For å finne ut om ATOH1 kan regulere
in vivo
tumorigenicity av magekreftceller, vi brukte en levermetastase modell produsert ved injisering av magekreftceller i milten (celler senere overføres til leveren). Spesielt, overekspresjon av ATOH1 betydelig redusert tumordannelse i leveren ved GCSCs og ved NCI-N87 magecancerceller (fig 4). Dessuten, når vi har gjort subkutane xenografter, ble tilsvarende resultater observert (figur 4).
Etter 4 uker, tumormasser ble innhentet og deres vekter måles (C).
ATOH1 økt RASSF4 promoter aktivitet
for å bekrefte om differensiering av GCSCs av ATOH1 er formidlet gjennom sin transkripsjonen aktivitet, undersøkte vi arrangøren aktiviteten til en ATOH1 målet genet (RASSF4) ved hjelp av luciferase analyser [29]. Etter RASSF4 promoteren, som ble koblet med den lucifease-genet, ble stabilt introdusert inn i magecancercellelinjer (NCI-N87 og SNU216 celler), undersøkte vi effekten av ATOH1 på aktiviteten av luciferase. Transduksjon med ATOH1 øket luciferase-aktivitet av RASSF4 promoter betydelig. (Fig 5).
RASSF4 promoter kombinert med luciferase genet ble innført i NCI-N87 og SNU216 celler. Transduksjon med ATOH1 øket luciferaseaktiviteten betydelig. Dataene er midler ± SD av tre uavhengige eksperimenter *
P
0.01.
Involvering av apoptose og cellesyklus trasé i virkningene av ATOH1
Tidligere rapporter har rapportert apoptose og cellesyklus trasé er involvert i effektene av ATOH1 på svulster i retina [30] og tykktarm [25]. Så undersøkte vi om beslektede proteiner er også involvert i effektene av ATOH1 på spredning (figur 3A) og sfære dannelse (figur 3B) i denne studien. Endringen i proliferasjon og sfære dannelse kan skyldes en langsommere cellesyklus, en øket apoptotisk hastighet, eller begge deler.
Vi fant transduksjon med ATOH1 økt nivå av spaltede-kaspase-3 og kaspase-9- i GCSCs og mage kreft cellelinjer (fig 6), noe som tyder på at den indre apoptose veien kan være involvert. Videre har vi også funnet oppregulering av p21 på ATOH1 overekspresjon (fig 6).
Total og spaltede former av caspase 3 og 9 ble undersøkt 2 dager etter transduksjon med ATOH1 i NCI-N87 celler, SNU216 celler og GCSCs. Kløyving av caspase 3 og 9, oppregulering av p21 ble observert i ATOH1-overexpressed celler.
Diskusjoner
I denne studien, viser vi at ATOH1, en HLH transkripsjonsfaktor kan indusere differensiering av GCSCs, og dette fører til et tap av tumorigenitet. ATOH1 overekspresjon har tidligere blitt vist å indusere differensieringen av tarm stamceller inn i sekretoriske celler [24], og i ATOH1-null-mus, ble sekretoriske celler ikke er generert i tarmen [26]. Denne effekten av ATOH1 på differensiering har også blitt observert i kolorektal kreft celler, der den fungerte som en tumor suppressor. Videre i ca 70% av kolorektal kreft, dens uttrykk er blitt rapportert å være svekket av genetiske og epigenetiske mekanismer [25,31]. I kolorektal kreft celler, ATOH1 overekspresjon redusert spredning og vekst i myk agar og xenografter [31], og sletting av ATOH1 forbedret tumorigenicity hos mus [25]. Disse resultatene tyder på at kollektivt ATOH1 kan benyttes som en differensierings terapi for gastrointestinal kreft.
I kontrast til dens effekt på differensiering, ATOH1 kan også fremme proliferasjon av progenitorceller og tumordannelse. Under cerebellar utvikling av mus, ble ATOH1 funnet å initiere differensiering program av lillehjernen granulat neuron-forløpere på et tidlig stadium (P0). Imidlertid, på et senere tidspunkt (P5), det fremmes spredning av forløpere [32,33,34]. ATOH1 sletting ved P0, sterkt hemmet differensiering, men sletting på senere tidspunkt ført ut fra cellesyklusen og differensiering [35]. Disse ulike rollene ATOH1 på ulike stadier kan forklares med ulike targetomes [35]. ATOH1 fremmet medulloblastoma formasjon sammen med Shh pinnsvinet signalveien [36,37]. Videre ble det uttrykk funnet å være signifikant forhøyet i mucinous adenokarsinom, signetring karsinom, og tarm nevroendokrine svulster [38]. Derfor, for å kunne utnytte ATOH1 for differensiering terapi, dets direkte mål som induserer differensiering må identifiseres.
Selv om uttrykks statusene ATOH1 har blitt rapportert i normal mageslimhinnen og i magekreft, rollene er dårlig karakterisert. ATOH1 blir uttrykt i normale humane mage-epitelceller ved lave nivåer [39,40], men dens ekspresjon ble ikke observert hos normale gastriske epitel-celler i mus magen [26]. Videre mus og menneske metaplastiske mageslimhinnen viste ATOH1 uttrykk [41], men uttrykket ble ikke observert i mage kreft cellelinjer, inkludert MKN74, MKN45, KATOIII, og HSC58 [40]. I noen mage kreftpasienter, er det overuttrykt [39]. Dens patofysiologiske roller har aldri blitt undersøkt i magekreft. I denne studien fant vi at induksjon av ATOH1 uttrykk kan redusere spredning, invasjon, og tumorgenisiteten av mage kreftceller. Vi fant også mulig involvering av p21 og apoptose sti i ATOH1 effekter.
Våre observasjoner tyder på muligheten for at ATOH1 genet bør sees på som potensiell behandling mål for magekreft. Små molekyler som induserer dens uttrykk eller genterapi ved hjelp av virus eller stamceller kan utvikles. Spesielt ble ATOH1 funnet å indusere differensiering av mage kreft stamceller, og dermed therapeutics målretting ATOH1 kan være i stand til å utrydde kreft stamceller.
