Abstract
Bakgrunn
Økte nivåer av NF-kB er kjennetegnene ved bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC), og begge klassiske og alternative NF-kB aktivering pathways har vært innblandet.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at aktivering av alternativ bane er en kilde for høy basal NF-kB aktivitet i PDAC cellelinjer. Økt aktivitet av P52 /relB NF-kB-komplekset er mediert gjennom stabilisering og aktivering av NF-kB-induserende kinase (NIK). Vi identifiserer proteasomal nedregulering av TNF-reseptor-assosiert faktor 2 (TRAF2) som en mekanisme hvorved nivåene av aktivt NIK er økt i PDAC cellelinjer. En slik oppregulering av NIK uttrykk og aktivitetsnivå releer til økt spredning og forankring uavhengig vekst, men ikke migrasjon eller overlevelse av PDAC celler.
Konklusjon /Betydning
Rask vekst er en karakteristikk av kreft i bukspyttkjertelen . Våre data indikerer at TRAF2 /NIK /NF-κB2 pathway regulerer PDAC celle tumorigenicity og kan være et verdifullt mål for behandling av denne kreftformen
Citation. Doppler H, Leo GY, Storz P (2013) nedregulering av TRAF2 formidler NIK-Induced Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP celleproliferasjon og tumorgenisiteten. PLoS ONE 8 (1): e53676. doi: 10,1371 /journal.pone.0053676
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 26. juli 2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 03.01.2013
Copyright: © 2013 Doppler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra AACR (08-20-25-STOR), National Institutes of Health gir CA135102, CA140182 og P50CA102701 (Mayo Clinic SPORE i kreft i bukspyttkjertelen). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
transkripsjonsfaktorer av NF-kB (nukleær faktor κ-light-chain-enhancer av aktiverte B-celler) familie er oppregulert i mange humane kreftformer [1]. NF-kB har roller i alle kjennetegn på karsinogenese eller progresjon av kreft, herunder beskyttelse mot celledød, økning av celleproliferasjon, celle motilitet og metastase, tumor-angiogenese og inflammasjon [1]. I tillegg tumorceller ofte utvikler resistens mot anticancer legemidler (chemoresistance) ved oppregulering NF-kB signale [2].
NF-kB transkripsjonsfaktorkompleksene blir dannet ved homo- eller heterodimerer av underenheter p65 (rela) , relB, c-Rel, P50 eller P52 [3]. Rela /P50 dimer representerer den klassiske (kanonisk) NF-κB1 og relB /P52 dimer alternativ (ikke-kanonisk) NF-κB2 kompleks [4]. Både den alternative og klassiske NF-kB aktiveringsveier er avhengige av IKB-kinase (IKK) kompleks som er sammensatt av IKKα, IKKβ og NEMO /IKKγ. IKKβ og NEMO /IKKγ medierer aktivering av NF-kanonisk κB1 vei, hvor IKKα ikke har noen vesentlig rolle. I motsetning til aktivering av den alternative NF-κB2 veien krever IKKα, men ikke IKKβ og NEMO [5]. Det innebærer også NF-kB-induserende kinase (NIK) som en direkte oppstrøms kinase for IKKα [4]. Når aktivert av NIK, induserer IKKα behandling av NF-κB2 /P100 til P52.
I fravær av en stimulus, er NIK raskt forringet, og dette avhenger av dets assosiasjon med TNF-reseptor-assosiert faktor 3 (TRAF3) . Binding til TRAF3 rekrutterer NIK til TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 ligase kompleks [6], [7]. Cellular inhibitor av apoptose proteiner (cIAPs) er ubiquitin-ligaser som kan fremme ubiquitinering og proteasomal nedbrytning av seg selv, samt deres bindingspartnere TRAF2 og TRAF3 [8], [9]. Begge cIAPs også megle K48 bundet polyubiquitination av NIK, noe som resulterer i sin proteasomal degradering [7]. I stimulerte celler (det vil si ved CD40-reseptor inngrep), TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 /TRAF3 komplekser er rekruttert til reseptoren og TRAF2 induserer ubiquitinering og degradering av TRAF3 [10]. Siden TRAF3 nivåer reduseres, nylig syntetisert NIK er stabilisert og aktiv fordi den ikke lenger kan samhandle med TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 kompleks [6].
I bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom kreft (PDAC), NF-kB nivåene er økt i kreftcellelinjer, så vel som pasientprøver og formidler celle-proliferasjon og motstandsdyktighet overfor kjemoterapi [11], [12], [13]. Økt NF-kB aktivitet i PDAC skyldes både de kanoniske og alternative aktiveringsveier [14], [15]. Siden så langt ingen genetiske endringer for TRAFs, CIAP eller NIK ble beskrevet for denne kreftformen, mekanismer som den alternative veien er oppregulert er i stor grad ukjent for PDAC.
Her viser vi at i PDAC cellelinjer TRAF2 protein nivåer blir nedregulert og at dette er mekanismen ved hvilken stabilisering av NIK blir oppnådd for å indusere aktivering av den alternative NF-kB pathway. Vi viser videre at NIK aktivitet releer til økt celledeling og forankringsuavhengig vekst. Rask vekst er en kjennetegn på kreft i bukspyttkjertelen, og våre data indikerer at TRAF2 /NIK /NF-κB2 veien kan være et verdifullt mål for behandling av denne kreftformen.
Resultater
NIK Expression og aktivitet er økt i PDAC cellelinjer
Aktiv NIK er overuttrykt i humane prøver av PDAC i forhold til normal bukspyttkjertelen vev (fig. 1a). Dette fremmes å analysere et panel av ni etablerte PDAC cellelinjer, så vel som humane bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE) celler som tjente som normal kontroll for ekspresjon og aktivitet av NIK. I de fleste PDAC cellelinjer som ble analysert, ble NIK uttrykk øket sammenlignet med normale HPDE-celler (fig. 1B, øvre panel). Økt uttrykk korrelert med økt aktivitet som bestemmes med en fosfor-spesifikt antistoff (anti-pT559-NIK) som gjenkjenner NIK fosforylering på sitt aktivering loop (Fig. 1B, midtre panelet). Av alle PDAC cellelinjer analysert, bare to, Capan2 og HPAFII, ikke viser økt aktivitet av NIK. Benyttet kvantitative RT-PCR, ved siden testet vi om økt NIK mRNA uttrykk kan være årsaken til de økte proteinnivåer. Selv om vi observerte variasjoner i NIK mRNA-ekspresjon mellom de forskjellige cellelinjer, ble en åpenbar korrelasjon med sin ekspresjon på proteinnivået ikke er angitt (fig. 1C). Dette indikerte at i PDAC cellelinjer økt NIK uttrykk oppnås ikke ved økt transkripsjon, men heller av mekanismer som stabiliserer protein nivåer
A:. Menneske vevsprøver av normal bukspyttkjertelen og PDAC ble immunohistochemically-farget for total NIK ( anti-NIK) eller aktiv NIK (anti-pT599-NIK) uttrykk, eller utsatt for H E farging. Baren viser 50 mikrometer. B: Cellelysater av angitte PDAC cellelinjer eller HPDE-celler ble normalisert til 0,5 mg /ml og så underkastet SDS-PAGE. Prøvene ble overført til nitrocellulose og analysert ved hjelp av Western blot for ekspresjon av NIK (anti-NIK) eller NIK aktivitet (anti-pT559-NIK). Farging for β-aktin (anti-β-aktin) tjente som lasting kontroll. C: Prøver av mRNA av angitte cellelinjer ble underkastet kvantitativ RT-PCR rettet mot NIK. Prøvene ble normalisert til GAPDH.
TRAF2 Expression er nedregulert i PDAC cellelinjer
Vi neste testet om NIK er regulert posttranslationally. I fravær av et aktiveringssignal, ble NIK vist å bli nedregulert i sin ekspresjon ved interaksjon med TRAF2, TRAF3 og cIAP1 /2-komplekset og påfølgende ubiquitinering [15], [16]. Av dette regulatoriske kompleks for NIK, TRAF3 og cIAP1 /2 er rikelig uttrykt i alle PDAC cellelinjer, samt normal HPDE kontrollceller (Fig. 2A). TRAF2 ble imidlertid bare uttrykt i HPDE-celler, men ikke, eller meget lite uttrykt i syv av ni PDAC cellelinjer. I Capan1 og HPAFII celler TRAF2 uttrykk ble oppdaget, men på en uvanlig molekylvekt på ca. 65 kDa (Fig. 2A, fig. S1, hvit pil). Tap av TRAF2-ekspresjon ble observert i alle PDAC cellelinjer som viste økt NIK-aktivitet (se fig. 1A og fig. 2A). Interessant, TRAF2 mRNA var rik på alle PDAC cellelinjer (Fig. 2B), noe som indikerer at dets ekspresjon er også ikke regulert på transkripsjonsnivået. Siden TRAF2 uttrykk nivåer kan reguleres ved ubiquitinering, vi neste testet om sine tap i PDAC cellelinjer skyldes ubiquitinering og påfølgende proteasomal degradering. Når re-uttrykkes i Panc1-celler, ble TRAF2 ubiquitinmolekyler (fig. 2C), mens ingen ubiquitinering ble detektert da ektopisk TRAF2 ble uttrykt i HPDE celler (ikke vist). Behandling av PDAC cellelinjer med MG-132, en proteasominhibitor, gjen endogene TRAF2 nivåer i 4 til 24 timer, avhengig av cellelinjen (fig. 2D). Videre ektopisk re-ekspresjon av TRAF2 i Panc1 førte til en nedgang i NIK ekspresjon, noe som indikerer at ytterligere øket NIK nivåer er mediert ved nedregulering av TRAF2 i disse cellene (fig. 2E). Samlet tyder dette på at en mekanisme for hvordan basal høye NIK uttrykk og aktivitetsnivået er regulert i de fleste PDAC cellelinjer er av ubiquitinering og proteasomal nedbrytning av TRAF2, noe som resulterer i økt NIK stabilitet og aktivitet.
En : Cellelysater av angitte celler ble normalisert til 0,5 mg /ml og deretter 20 ug ble underkastet SDS-PAGE. Prøvene ble overført til nitrocellulose og analysert ved hjelp av Western blot for ekspresjon av TRAF2 (anti-TRAF2), TRAF3 (anti-TRAF3), cIAP1 (anti-cIAP1), cIAP2 (anti-cIAP2) eller β-aktin (anti-β-actin ; lasting kontroll). TRAF2 overexpressed i HEK293 celler fungert som en ekstra molekylvekt kontroll. B: Prøver av mRNA av angitte cellelinjer ble underkastet kvantitativ RT-PCR rettet mot TRAF2. Prøvene ble normalisert til GAPDH. C: Panc1 celler (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) var co-transfektert med TRAF2 og vektor kontroll eller HA-ubiquitin. Etter 24 timer ble cellene lysert, TRAF2 immunopresipitert (anti-TRAF2) og analysert ved immunblotting for ubiquitinering av TRAF2 (anti-HA). Blottene ble re-analysert for TRAF2 (anti-TRAF2). D: Indikert cellelinjer ble behandlet med MG-132 (20 uM) for 0, 4, 8, 16 eller 24 timer. Cellene ble lysert og analysert for ekspresjon av endogent TRAF2 (anti-TRAF2) eller β-aktin (anti-β-aktin, lasting kontroll TRAF2 overexpressed i HEK293 celler tjente som positiv kontroll E:.. Panc1 celler (5 × 10
5-celler, 6 cm skåler) ble transfektert med vektor kontroll eller TRAF2 som angitt. etter 24 timer i cellelysatene ble analysert ved Western blotting for ekspresjon av NIK (anti-NIK), overuttrykt TRAF2 (anti-TRAF2) eller β-aktin (anti -β-aktin) som lasting kontroll.
NIK som megler Basal NF-kB aktivitet i PDAC cellelinjer
Når aktivert NIK kan indusere ikke-kanoniske NF-kB aktivering vei, ved å fremkalle behandlingen av NF-κB2 /P100 til P52. totalt cellelysater av PDAC cellelinjer, økte nivåer av P52 korrelerte med økt NIK uttrykk og aktivitet indikerer at aktiv NIK er også funksjonell (sammenlign fig. 3A og fig. 1B) . Vi har også observert øket ekspresjon av relB, en
bona fide
bindingspartner for P52 i den alternative NF-kB vei, noe som indikerer at NIK øket aktivitet fører til dannelse av relB /P52 NF-kB-komplekser. Faktisk ble begge komponenter av dette komplekset påvises i kjernen av PDAC cellelinjer (Fig. 3B) og EMSA supershift analyse viste at begge har DNA-bindende aktivitet (Fig. 3C). Av notatet, atom ekstrakter også inneholdt p65 og p50 (fig. S2). Bruke luciferasereportergenet analyser vi neste testet om NIK-mediert induksjon av NF-κB2 releer til økt basale nivåer av NF-kB. Når Panc1 celler ble lentivirally infisert med kontroll shRNA eller to spesifikke NIK-shRNA-sekvenser (NIK-shRNA1 og NIK-shRNA2) og deretter transfektert med NF-kB-luciferasegenet reporter, vi har observert en signifikant reduksjon i NF-kB aktivitet når NIK var nedregulert i sin ekspresjon (fig. 3D). I motsetning til dette, når cellene ble transfektert med et aktivt allel av NIK (NIK.T559D) basale NF-kB-nivåene ble øket (figur 3E).
A:. Cellelysater av angitte celler ble normalisert til 0,5 mg /ml og deretter 20 ug ble underkastet SDS-PAGE. Prøvene ble overført til nitrocellulose og analysert ved hjelp av Western blot for ekspresjon av relB (anti-relB), P52 (anti-P52) eller β-aktin (anti-β-aktin; lasting kontroll). B: Atom ekstrakter og cytosoliske fraksjoner av angitte cellelinjer ble analysert ved Western blotting for relB og P52 og i tillegg for p65 og p50 (se Supplemental Figur S2). Farging for nucleolin fungert som en markør for atom ekstrakter. Silver farging av lysatene fungerte som lasting kontroll. C: Nuclear ekstrakter av Panc1 cellene ble inkubert med anti-relB eller anti-P52-antistoffer, som angitt, og deretter underkastet DNA-bindende aktivitet analyse ved hjelp av EMSA. 100x umerket oligonukleotid fungert som en spesifisitet kontroll. D: Panc1 celler som uttrykker kontroll (kryptert) shRNA eller NIK-shRNA (to forskjellige sekvenser, NIK-shRNA1 eller NIK-shRNA2) ble i tillegg tilført med NF-kB-luciferase og Renilla luciferasepreparater journalister. 16 timer etter transfeksjon luciferase reportergen analyser ble utført. Knockdown av NIK ble kontrollert med RT-PCR-analyse. RT-PCR for β-aktin mRNA tjente som kontroll. Stjernene indikerer statistisk signifikans. E: Panc1 celler ble transfektert med NF-kB-luciferase og Renilla luciferasepreparater journalister så vel som vektor kontroll eller en NIK.T599D mutant, som angitt. 16 timer etter transfeksjon luciferase reportergen analyser ble utført. Cellelysater ble analysert for uttrykt aktiv NIK bruker Western blot og antistoffer rettet mot FLAG-merket NIK.T559D (anti-FLAG) eller β-aktin (anti-β-actin) som en lasting kontroll. Stjernen indikerer statistisk signifikans.
NIK er en kritisk regulator av transformert Veksten i PDAC Cells
Neste vi vurderte kravet om NIK i PDAC celle transformert vekst. Derfor må vi først etablerte Panc1 og MiaPaca2 cellelinjer som stabilt uttrykker enten NIK-shRNA eller kontroll egge shRNA. Vi deretter benyttet i disse cellelinjer for å bestemme forankringsuavhengig vekst i softagar kolonidannelse analyser. Knockdown av NIK i Panc1 og MiaPaca2 cellene betydelig redusert forankrings-uavhengig vekst, og dette korrelert med NIK-proteinet uttrykk nivåer i celler (Fig. 4A). Ektopisk ekspresjon av et konstitutivt aktivt NIK allel øket forankrings-uavhengig vekst og kolonidannelse i Panc1 celler (Fig. 4B). Lignende resultater på cellevekst ble oppnådd med ovennevnte revers genetikk (Fig. 4C, øverste rad) eller ektopisk overekspresjon (Fig. 4C, rste rad) nærmer seg, da Panc1 celler ble dyrket i tre-dimensjonal (3D) cellekultur i Matrigel i stedet for softagar. Våre resultater tyder på at NIK er nødvendig og tilstrekkelig for å megle tumorigent vekst av PDAC cellelinjer
A:. Panc1 eller MiaPaca2 celler (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) stabilt uttrykker kontroll (kryptert) shRNA eller NIK-shRNA (to forskjellige sekvenser, NIK-shRNA1 eller NIK-shRNA2) ble utsatt for myke agar kolonidannelse analyser. En brøkdel av de transfekterte cellene ble samlet opp og analysert for NIK ekspresjon ved hjelp av Western blot-analyse og antistoff rettet mot NIK (anti-NIK) eller β-aktin (anti-β-aktin) som lasting kontroll. Stjernene indikerer statistisk signifikans. Skala barer representerer 1 mm. B: Panc1-celler (5 x 10
5-celler, 6 cm skåler) ble lentivirally infisert med kontrollvirus eller virus for ekspresjon av konstitutivt aktivt NIK (NIK.T559D mutant) og utsatt for myk-agar-kolonidannelse analyser. Før såing en fraksjon av cellene ble lysert og analysert for uttrykkes aktivt NIK ved hjelp av Western blot og antistoffer rettet mot FLAG-merket NIK.T559D (anti-FLAG) eller β-aktin (anti-β-aktin) og en lastekontroll. Stjernen indikerer statistisk signifikans. Skala barer representerer 1 mm. C: Panc1 celler (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) stabilt uttrykker kontroll (kryptert) shRNA, NIK-shRNA1 eller NIK-shRNA2 (øverste rad), eller celler lentivirally infisert med kontroll virus eller NIK.T559D mutant (nederste rad) ble sådd i 3D Matrigel kultur. På dager 10 (shRNA celler) eller 14 (NIK.T559D uttrykker celler) etter såing kolonivekst ble analysert ved ImagePro. Baren representerer 500 mikrometer.
TRAF2 /NIK Signa Regulerer PDAC Cell Proliferation
Vi neste testet om NIK påvirker spredning, bevegelighet og chemoresistance av PDAC celler. Derfor anvendes vi våre Panc1 og MiaPaca2 cellelinjer som uttrykker NIK-shRNA eller kontroll kryptert shRNA og utført i sanntid proliferasjonsanalyser løpet av et tidsrom på 30 timer. I Panc1 celler, knockdown av NIK med to forskjellige shRNA sekvenser vesentlig redusert celleproliferasjon til 62 – /+ 1,1 prosent for sekvens 1 og 51 – /+ 1 prosent for sekvens 2 i forhold til kontrollen (100%) ved endepunktet for analyse. I MiaPaca2 celler, knockdown av NIK redusert celleproliferasjon til 49 – /+ 0,7 prosent for sekvens 1 og 63 – /+ 1,7 prosent for sekvens 2 ved endepunktet for analyse (figur 5A.). I tillegg viste Panc1 og MiaPaca2 cellelinjer som uttrykker den konstitutivt aktive NIK.T559D mutant økt celleformering til 138 – /+ 3,7 prosent (Panc1) og 166 – /+ 2,7 prosent (MiaPaca2) i forhold til kontrollen (100%) endepunktet for analyse (fig. 5B). Vi observerte ikke økt følsomhet for celledød når cellene ble stabilt transfektert med NIK-shRNA (ikke vist). Videre ble det knockdown av NIK ikke bevisst PDAC cellelinjer til kjemoterapeutika-indusert celledød. For å teste dette vi sammenlignet med cellelinjer for deres respons til Gemcitabine- og 5-fluorouracil (5-FU) (fig. S3). Men sammenlignet med den ubehandlede kontroll, knockdown cellelinjer viste en redusert signal i MTT, på grunn av deres reduserte potensial til å proliferere. Til slutt, testet vi om potensialet til å migrere eller invadere endres ved NIK uttrykk, men fant ingen signifikant forskjell i cellemigrering eller invasjon i celler utarmet fra NIK eller celler som overuttrykker aktivt NIK (fig. S4). Dette indikerer at basal aktivitet av NIK i PDAC celler utelukkende påvirker spredning
A:. Panc1 eller MiaPaca2 celler (5 × 10
5 celler, 6cm parabol) stabilt uttrykker kontroll (kryptert) shRNA eller NIK-shRNA (to forskjellige sekvenser, NIK-shRNA1 eller NIK-shRNA2) ble sådd i E-plater og etter festing celleproliferasjon ble kontinuerlig overvåket i sanntid for angitte ganger med en xCELLigence RTCA DP instrument. Feilfelt (grå) representerer tre eksperimenter. Kontroll analyse av knockdown av NIK for begge cellelinjer er vist i figur 4A. B: Panc1 eller MiaPaca2 celler (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) ble lentivirally infisert med kontroll virus eller virus for uttrykk av konstitutivt aktiv NIK (NIK.T559D mutant). Den neste dag media ble endret, og etter 48 timer ble cellene sådd ut i E-plater, og etter festing celleproliferasjon ble kontinuerlig overvåket i sann tid for angitte tidspunkter ved hjelp av en xCELLigence RTCA DP instrument. Feilfelt (grå) representerer tre eksperimenter. En brøkdel av de transfekterte cellene ble lysert og analysert for uttrykkes aktivt NIK ved hjelp av Western blot og antistoffer rettet mot FLAG-merket NIK.T559D (anti-FLAG) eller β-aktin (anti-β-aktin) og en lastekontroll (vist for MiaPaca2). Kontroll blots for Panc-1 cellelinjen, er vist i fig. 4B.
Siden våre tidligere data indikerer at NIK stabilitet og aktivitet i PDAC cellelinjer oppnås ved proteasomal nedregulering av TRAF2, vi neste testet om re-uttrykk for TRAF2 kan redusere celleproliferasjon. Ektopisk uttrykk for TRAF2 redusert celleproliferasjon av Panc1, MiaPaca2 og BxPC3 celler. Avhengig av cellelinjen, ble celleformering ble redusert til 68 – /+ 1 prosent (Panc1), 82 – /+ 1 prosent (MiaPaca2), eller 48 – /+ 0,5 prosent (BxPC3) ved endepunktet for analyse (30 timer) . Til slutt, testet vi om aktivering av alternative NF-κB2 veien kan mediere celle spredning av normale pancreatic ductal celler. Derfor smittet vi normale HPDE celler med NF-κB2 /p100 og analysert spredning av sanntidsmåling. Etter ekspresjon av NF-κB2 /p100, vi har oppdaget dets aktive produkt P52 i HPDE celler korrelere med svakt økt celleproliferasjon til 107 – /+ 1,2 prosent i forhold til kontrollen (100%) ved endepunktet for analyse (Fig. 6D) .
A-C: indikerte cellelinjer (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) ble infisert med kontroll eller TRAF2 adenovirus. Etter 48 timer ble cellene sådd ut i E-Plater og etter festing celleproliferasjon ble kontinuerlig overvåket i sann tid i 30 timer ved bruk av en xCELLigence RTCA DP instrument. Feilfelt (grå) representerer tre eksperimenter. En brøkdel av de transfekterte cellene ble lysert og analysert ved hjelp av Western blot for TRAF2 eller β-aktin (lasting kontroll). D: HPDE celler (5 × 10
5 celler, 6 cm retter) ble infisert med kontroll eller NF-κB2 /P100 adenovirus. Etter 48 timer ble cellene sådd ut i E-Plater og etter festing celleproliferasjon ble kontinuerlig overvåket i sann tid i 20 timer ved bruk av en xCELLigence RTCA DP instrument. Feilfelt (grå) representerer tre eksperimenter. En brøkdel av de transfekterte cellene ble lysert og analysert ved hjelp av Western blot for behandlet, aktivt NF-κB2 ved hjelp av antistoffer rettet mot P52 (anti-P52) eller β-aktin (anti-β-aktin) og en lastekontroll.
korrelasjonen av
in vitro
data med kliniske data
Neste vi bestemt om en lignende omvendt korrelasjon mellom NIK uttrykk og aktivitet og TRAF2 downregulation forekommer i humane prøver av bukspyttkjertelen adenokarsinom. Ut av 55 mennesker PDAC prøver analysert, viste 69% redusert TRAF2 uttrykk korrelerer med økt NIK nivåer og økt NIK aktivitet (Fig. 7A, prøver # 58, # 27 og # 44 i rød ramme og Fig. 7B toppen sektordiagram rødt område) . Men 18% av prøvene viste oppregulering av TRAF2 og NIK nivåer, men ingen eller svært liten aktivitet NIK (Fig. 7A, sample # 30 og Fig. 7B sektordiagram grønt område). Ytterligere 13% av alle prøver viste oppregulering av alle tre molekyler (fig. 7A, sample # 35 og Fig. 7B sektordiagram blå området). Ingen korrelasjon av TRAF2 /NIK nivåer med enten alder, kjønn, stadium av svulst eller TNM tilstand ble observert Men det var en sammenheng mellom svulst klasse og TRAF2 /NIK nivåer. Vel differensierte svulster i klasse 1 viste enten høy TRAF 2 og NIK og lav pT559-NIK nivåer, eller hadde alle tre oppregulert. Svulster av denne karakter vises normalt og er ikke vokser raskt. I kontrast mer enn 70% av karakteren 2 tumorer (moderat differensierte) og mer enn 80% av karakteren 3 svulster (dårlig differensierte) viste nedregulering av TRAF2 korrelere med økt NIK nivåer og aktivitet. Tumorceller av disse karakterene vises unormal og har en tendens til å vokse og spre seg mer aggressivt, korrelere med vår
in vitro
data som viser at ovennevnte TRAF2 /NIK signaliserer mekanismen kan megle i bukspyttkjertelen tumor celleproliferasjon.
A: tissue microarrays (TMA) inkludert 10 normale bukspyttkjertel vevsprøver og 55 bukspyttkjertel ductal adenocarinoma ble H E beiset eller analysert for uttrykket av TRAF2 (anti-TRAF2), NIK (anti-NIK) eller aktiv NIK (anti-pT559- NIK). Representative bilder av tumorvev er avbildet. Tallene angir posisjonen til vev på TMA. Baren viser 50 mikrometer. B: Analyse av korrelasjon av TRAF2, NIK, og pT559-NIK i n = 55 humane prøver for bukspyttkjertel addnocarcinoma. Top pai Grafen viser prosentandelen av celler med lav TRAF2 uttrykk og høy uttrykk for NIK og pT559-NIK i rødt, prosentandel av celler med høy TRAF2 og NIK uttrykk og lavt uttrykk av pT559-NIK i grønt, og prosentandelen av celler med høy TRAF2, NIK og pT559-NIK uttrykk i blått. Bottom søylediagram viser prosentandel av disse gruppene i sortering1, klasse 2, og karakteren 3 svulster.
Diskusjoner
Økt basal NF-kB aktivitet ble påvist i humane kreft i bukspyttkjertelen prøver, som vel som PDAC cellelinjer [11]. NIK er blitt identifisert som et viktig regulator av NF-kB i mange krefttyper [17]. I det foreliggende arbeid viser vi at aktivt NIK blir uttrykt i pasientens vev for kreft i bukspyttkjertelen og PDAC cellelinjer (Fig. 1). Vi identifisere nedregulering av TRAF2 gjennom ubiquitinering som en mekanisme hvorved dette oppnås (fig. 2). I PDAC celler øket stabilitet og aktivitet av NIK releer til økt aktivering av den alternative NF-kB pathway (NF-κB2; P52 /relB). Det medierer celle-proliferasjon og forankrings-uavhengig vekst (fig. 4, 5, 6), alle kjennetegnene til kreft i bukspyttkjertelen. Våre data støttes av tidligere arbeid av Schneider et al., Og viser at P52 /relB NF-kB-komplekset kan regulere G1 til S-fase progresjon i PDAC cellelinjer [18].
I mange kreftformer NF -κB aktivering i ondartede celler forekommer som respons på inflammatoriske cytokiner [19]. For eksempel har TNFa-indusert aktivering av den kanoniske NF-kB vei vært implisert som mulig årsak for økt chemoresistance [2]. Det finnes imidlertid eksempler på krefttyper hvor stabilisering av NIK og resulterende aktivering av NF-kB oppnås ved iboende mutasjoner. I ca 20% av myelomatose tilfeller tap-av-funksjon mutasjoner for TRAF2 har TRAF3 og cIAP1 /2 er identifisert hos pasienter, som fører til NIK-indusert aktivering av både de kanoniske og alternative NF-kB pathways å regulere cellevekst og overlevelse [20], [21].
i den alternative NF-kB aktivering vei, i fravær av en stimulus, NIK forbinder med TRAF3 /TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 kompleks som er rettet mot det for degradering. Ved reseptorstimulering den TRAF2 /TRAF3 /cIAP1 /cIAP2 komplekset er gruppert på reseptoren og TRAF2 aktivering fører til cIAP1 /2 og /eller TRAF3 degradering [6]. Dette stabiliserer cytosolisk NIK og tillater nedstrøms signalering for å aktivere IKKα og NF-κB2 /p100 [6], [10]. Men NIK også kan stabiliseres ved andre mekanismer. For eksempel, TWEAK, en kjent induser av den alternative reaksjonsvei NF-kB utløser nedbrytningen av cIAP1 /2 og dette resulterer i NIK stabilisering og NF-κB2 /p100 behandling av [7]. Her beskriver vi en ytterligere og forskjellig aktiveringsmekanisme som forekommer i PDAC cellelinjer. Våre data antyder permanent nedregulering av TRAF2-protein i PDAC cellelinjer under normale vekstbetingelser, som fører til en stabilisering av NIK ekspresjon og aktivering av den alternative NF-kB veien.
Ut fra ni PDAC cellelinjer som ble testet, var syv negativ for TRAF2 protein ekspresjon og to uttrykt TRAF2 på et uvanlig molekylvekt på omtrent 65 kDa i stedet for 53 kDa (fig. 2A). Det er mulig at denne større TRAF2 proteinet representerer en skjøt skjema eller et fusjonsprotein. Men dette betyr økt størrelse ikke ut til å påvirke TRAF2 funksjon mot NIK siden i begge cellelinjene, lik HPDE kontrollceller, NIK protein ekspresjon var lav (Fig. 1B). Naturen og funksjon av dette TRAF2 isoform trenger mer inngående undersøkelse i det videre arbeidet. Det vil også være interessant å bestemme om TRAF2 protein med øket molekylvekt som finnes hos pasienter.
Vi fant at tap av TRAF2 uttrykk er mediert gjennom ubiquitinering av proteinet (fig. 2C, 2D). Ingen vesentlige endringer i uttrykket av cIAP1 /2 eller TRAF3 ble påvist (Fig. 2A). Det ble vist før at ubiquitin ligaser cIAP1 og cIAP2 fremme proteasomal degradering av deres binding partnere TRAF2 og TRAF3 [8], [9]. Dermed observert tap av TRAF2 uttrykk kan skyldes tilstedeværelse av cIAP1 /2. På dette punktet er det uklart hvorfor for å aktivere den alternative NF-kB veien i PDAC, nedregulering av TRAF2 er foretrukket å nedregulering av TRAF3 eller cIAPs stedet. En forklaring for slik regulering kan være at cIAPs tidligere ble vist å være av betydning for tumorcelleoverlevelse [22]. Nedregulering av TRAF2 kan hindre stimulus avhengig nedbrytning av cIAP1 /2 [6], derfor tillater konstituerende overlevelse signaliserer gjennom tilgangspunkter. I tillegg er TRAF2 en viktig stillas kobling mellom cIAPs og NIK og tap av TRAF2 i de fleste PDAC cellelinjer som ble testet, kan frakople cIAP1 /2 mediert overlevelse signalering fra sin funksjon for å tømme cellene fra NIK. Dermed med denne mekanismen PDAC celler kan opprettholde både høye kapasitet til å overleve, så vel som høye sprednings (fig. 8).
Foreslått mekanisme for hvordan NIK aktivitet opprettholdes i PDAC cellelinjer. I normale pancreatic ductal celler TRAF2 uttrykkes og danner en degradering kompleks for NIK med TRAF3, cIAP1 /2. Dette fører til ubiquitinering og nedbrytning av NIK. I PDAC celler, er TRAF2 degradert av ubiquitinering. Dette hindrer dannelsen av en NIK degradering kompleks og NIK forblir uttrykt. NIK signaler til den ikke-kanonisk ikk-komplekset og IKKα medierer aktivering av NF-κB2 og dannelse av relB /P52 dimerer. Netto effekt av en slik signal er en økning i kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon.
For å styrke våre mekanistiske
in vitro
analyse, analyserte vi 55 humane prøver av PDAC (karakterer 1-3) og funnet at ca 69% viste redusert uttrykk for TRAF2 og økte nivåer av NIK og pT559-NIK (fig. 7) lignende som vi hadde observert det i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (fig. 1 og 2). Imidlertid hadde ca. 31% av analyserte prøvene viste høy ekspresjon TRAF2 lignende som tidligere beskrevet av Trauzold
et al.
[23]. Viktigere, i alle disse prøvene, NIK uttrykk ble også oppregulert. Det er mulig at dette delsett av pasientprøver uttrykker høyere molekylvekt variant av TRAF2 som vi har observert som forekommer i enkelte PDAC cellelinjer (dvs. HPAFII). Dette trenger ytterligere raffinement i fremtidige studier. Når skille svulster etter klassetrinn, fant vi at svulster med høy TRAF 2 plan var godt differensierte svulster i klasse 1. Svulster av denne karakter er ikke vokser raskt, mens svulster i karakterene 2 og 3 er moderat eller dårlig differensiert, henholdsvis, og har en tendens til å vokse og spre seg mer aggressivt. Denne økningen i aggressiv vekst og redusert TRAF2 uttrykk i klasse 2 og 3 svulster korrelerer med våre
in vitro
data som viser at ovennevnte TRAF2 /NIK signaliserer mekanismen kan megle i bukspyttkjertelen tumor celleproliferasjon.
I Oppsummert våre resultater identifisere proteasomal nedregulering av TRAF2 som en mekanisme for hvordan NIK stabilitet kan reguleres i PDAC. Targeting denne veien for å redusere spredning av kreftceller kan representere en ny strategi for terapi i PDAC. For eksempel, er den alternative NF-kB-aktivering pathway følsom for proteasominhibitor bortezomib [20], [21]. Derfor ville en potensiell kombinasjonsbehandling tilnærming være å kombinere bortezomib med CIAP hemmere og /eller apoptose-induserende stoffer som gemcitabin.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
TMA
