Abstract
Ikke-konvensjonell MHC klasse I mic molekyler samhandle ikke med TCR, men med NKG2D, en C-type lectin activatory reseptoren til stede på de fleste NK, γδ og CD8
+ αβ T-celler . Selv om denne interaksjonen er kritisk utløser /kalibrering av den cytotoksiske aktivitet av disse cellene, det faktiske omfanget av dens
in vivo
involvering, i mennesket, i infeksjon, kreft eller autoimmunitet, behov for ytterligere vurdering. Sistnevnte har steget sammen med rapporterte utvidelse av perifer CD4
+ CD28
-NKG2D
+ T-celler i revmatoid artritt (RA). Vi først satt i gang for å utvide denne rapporten til en større kohort av ikke bare RA-pasienter, men også de som er rammet av systemisk lupus erythematosus (SLE) og Sjögrens syndrom (SS). I RA og SS, var dette første observasjonen testet videre i mål vev: felles og spyttkjertler, henholdsvis. I konklusjonen og til tross for sporadisk og tilfeldig utvidelse av tidligere inkriminert T-celle subpopulasjon, kan ingen sammenheng observeres mellom CD4
+ CD28
-NKG2D
+ og autoimmunitet. Dessuten
in situ
, tilstedeværelse av NKG2D matchet som CD8
+, men ikke den av CD4
+ T-celler. Parallelt totalt kroppsvev skanning av både
MICA Hotell og
MICB
transkripsjon viser tydelig at til tross opprinnelige forutsetninger, og med unntak av det sentrale nervesystemet, både gener er mye transkribert og derfor muligens oversatt og membranbundet. Utvide denne analysen til en rekke humane tumorer ikke avsløre et sammenhengende mønster av uttrykk vs. normalt vev. Kollektivt disse dataene spørsmålet tidligere antakelser, korrelere en vev-spesifikke uttrykk /induksjon av
MIC
i relevans til auto-immune eller tumor prosesser
Citation. Schrambach S, Ardizzone M, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)
In Vivo
Expression Pattern of MICA og MICB og dens relevans til autoimmunitet og kreft. PLoS ONE 2 (6): e518. doi: 10,1371 /journal.pone.0000518
Academic Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public-Santé, Luxembourg
mottatt: 17 april 2007; Godkjent: 07.05.2007; Publisert: 13 juni 2007
Copyright: © 2007 Schrambach et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Université Louis Pasteur, den Hopitaux Universitaires de Strasbourg, Association Française du Gougerot Sjögren et des syndromer sekunder, Ligue contre le Cancer, Association pour la recherche sur le Cancer (ARC).
Konkurrerer interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
cytotoksiske CD8
+ og hjelper CD4
+ αβ T-celler gjenkjenner vanlig peptid-lastet Major Histocompatability Complex (. MHC) klasse I og II molekyler henholdsvis [1]. Mens det tidligere interaksjonen fører til eliminering av viralt infiserte eller tumorized målcellene, det sistnevnte, bidrar til forsterknings /regulere først og fremst den humorale immunrespons mot exo eller autoantigener [2], [3]. Selv om dette lærebok definisjonen av den adaptive immunresponsen er klare og reelle funksjonelle /dysfunksjonelle konsekvensene av disse interaksjonene, i forbindelse med den andre, medfødte, skuespillere av immunitet, er langt fra enkel. Dette er kanskje best eksemplifisert i auto-immune reaksjoner, hvor avhengig av sykdommen, arten (human eller mus i essens) og den eksperimentelle modellen, har forskjellige komponenter i immunsystemet er sekvensielt satt til forkant, som fører til den logiske antagelse at praktisk talt alle aktører i immunsystemet er involvert, enten i å utløse og /eller opprettholdelse av sykdommen [4] – [6].
i motsetning til de ovenfor nevnte konvensjonelle MHC-i molekyler, MIC-molekyler [7], [8] ikke samhandle med TCR
per se
men gjør det med NKG2D, uttrykte en C-type lectin activatory reseptor på NK, γδ og CD8
+ αβ T-celler [9], [10 ]. Denne interaksjonen har vist seg å overstyre den hemmende signal fra Killer Inhibitory reseptorer (KIR) og /eller CD94 /NKG2A /B-molekyler som avføler tilstedeværelsen av henholdsvis HLA-ABC og -E på målceller. Mens på T-celler, NKG2D fungerer som en ko-stimulerende molekyl [11], vil det aktivere NK-celler, så vel som IL-15-aktiverte intraepitelial T-lymfocytter i en TCR uavhengig måte [12]. MIC-NKG2D inngrep er antatt å være kritisk følgelig i å eliminere infiserte celler og /eller tumorer [13], [14]. Hvorvidt dette samspillet er også relevant i autoimmunitet er et spørsmål om nyere vekt [15].
Revmatoid artritt (RA) er en arketypisk auto-immune sykdommer og som sådan fortsetter vår nåværende kunnskap og utfordringer vedrørende autoimmunitet [16 ]. Et stort kropp arbeid har gitt til en rekke hypoteser om initiering og opprettholdelse av sykdommen. Gjennom tidene har T-celler eller B-celler blitt anerkjent som den primære aktører av sykdommen. Den antatte vevsspesifikk eller systemisk auto-antigen (er) i mennesket fortsatt ukjent, i motsetning til flere naturlige eller transgene /gen-rettet dyremodeller hvor flere selvantigener har blitt anerkjent for å kunne sette i gang den sykdom [17]. En av de siste mulige aktører i RA patogenesen har blitt videresendt som en diskret befolkning på CD4
+ T-celler som mangler co-stimulerende molekyl CD28 og har blitt rapportert å bli utvidet i RA [18], [19]. Nyere undersøkelser rapportert at disse T-cellene uttrykker, i stedet for CD28, den ovenfor beskrevne NKG2D [15]. Følgende arbeid ble igangsatt på denne forutsetningen, og forsøkte å først kopiere disse innledende data i en større, bedre definert, kohort av RA-pasienter. Det ble videre forlenget til to andre autoimmune sykdommer: systemisk lupus erythematosus (SLE) og Sjøgrens syndrom (SS). I RA og SS lider pasientene var det også mulig å undersøke
MIC
ekspresjonsnivået i målvev, både på budbringer-RNA og proteinnivået. Videre i perifert blod i tillegg til å måle tilstedeværelsen av CD4
+ NKG2D
+ celler per se, vi også satt til å analysere TCR β repertoar av disse cellene i visse individer (jf
infra
). Endelig, og for første gang, en omfattende organ /vev skann lov til å avdekke det faktum at i motsetning til det som opprinnelig ble antatt og har siden angitt lærebøker [20], og med unntak av det sentrale nervesystemet,
MICA Hotell og
MICB
ble transkribert i nesten alle vev /organ undersøkt. Den videre forlengelse av denne analysen til tumorized prøver bidratt til å gi en bedre forståelse av
MIC
transkripsjon i både helse og sykdom.
Materialer og metoder
Pasienter og kontroller
25 friske frivillige samt 75 pasienter som lider av RA (n = 35, 1988 American College of Rheumatology kriterier) [21], SLE (n = 15, 1997 reviderte American College of Rheumatology kriterier) [22] og SS ( n = 25; 2002 amerikanske og europeiske kriterier) [23] ble inkludert i denne studien (tabell 1). Alle prøver ble innhentet fra frivillige som deltar på revmatologi klinikken i Strasbourg universitetssykehusene og ble samlet inn under rutinemessige kliniske (diagnose /prognostiske /terapeutisk) prosedyrer fastsatt av en av medforfatterne, Dr. J. Sibilia. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver enkelt i overensstemmelse med Helsinkideklarasjonen og fransk lovgivning, der ingen godkjennelse fra en etisk komité var nødvendig i dette tilfellet. Alle pasienter og kontroller var irrelevant.
flowcytometrisystemer
Følgende, vekslet konjugert (PE, FITC, PerCP, Cy5 eller APC) antistoffer ble brukt i tre- og -four- farge flowcytometri: anti -CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, – TCR γδ. T-cellerepertoaret ble analysert ved den følgende PE og FITC-konjugert anti-TCRV
β (1, 2, 3, 4, 5,1, 5,2, 5,3, 7,1, 7,2, 8, 9, 11, 12, 13.1, 13.2 , 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21,3, 22, 23) (Beckman Coulter) antistoffer. Isotype-matchede kontroller ble benyttet for hver farging. NKG2D uttrykk ble analysert ved bruk av PE-konjugert ON72 (Beckman Coulter) og 1D11 (BD PharMingen), enten PE-konjugert eller biotinylated; sistnevnte oppdaget av streptavidin-PC5 (BD PharMingen). Perifere blodceller ble undersøkt, enten ufraksjonert eller etter Ficoll-tetthetsgradient-sentrifugering. Mononukleære celler ble også isolert ved Ficoll-tetthetsgradient-sentrifugering fra leddvæsker erholdt fra en RA, osteoartritt 3 og 2 ikke auto-immune artritt. Flowcytometri ble utført på enten en BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) eller FC 500 (Beckman Coulter) systemer.
Immunohistochemistry
synovial vev ble oppnådd fra en RA albue og en Artrose pasienter på tiden av kneet protesekirurgi. Spyttkjertelen vev ble hentet fra fire SS og en sunn frivillige under neseplastikk. For immunhistokjemi, ble 4 mikrometer kryostatsnitt laget av synovial vev eller spyttkjertler og snap-frosset i flytende nitrogen. Suksessive seksjoner ble fiksert i aceton, lufttørket, rehydratisert i PBS og blokkert med 0,3% hydrogenperoksid. Seksjoner ble inkubert med anti: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), -CD4, -CD8 i 1 time ved romtemperatur. Binding ble påvist ved hjelp av biotinylert sekundært anti-IgG og streptavidin peroksidase. Seksjoner ble kontra med Harris «hematoksylin og montert med Glycergel.
Northern Blotting
Menneskelig mRNA blotter ble kjøpt fra Invitrogen (Invitrogen Northern Territories). Membranene ble sekvensielt hybridisert med
MICA, β-actin Hotell og
β
2-mikroglobulin (β
2 meter)
cDNA, utsettes deretter for høye stringensvask (64 ° C , 0.1XSSC, 0,1% SDS), før eksponering for Kodak Xomat (Eastman Kodak, Rochester, NY) for henholdsvis 8 timer ved -70 ° C, 1 time ved romtemperatur og 4 timer ved -70 ° C henholdsvis.
Sanntids kvantitative PCR
Tilbehør spyttkjertelbiopsi ble hentet fra et uavhengig sett med 20 (19 kvinnelige og en mannlig, gjennomsnittsalder 51, median 52) pasienter med primær SS. Spyttkjertler fra 5 pasienter som gjennomgår orofacial kirurgi (for uavhengige årsaker) ble oppnådd i løpet av de prosedyrer og fungerte som kontroller mens både patologi samt pasientens historie videre eliminert noen tegn til autoimmunitet i disse kontrollpersoner. Total cellulær RNA ble isolert ved TRIzol LS® (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. Kvaliteten av ekstrahert RNA ble fastslått ved gelelektroforese. 1 mikrogram total RNA ble utsatt for revers-transkripsjon ved hjelp av oligo-dT og ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega), etter produsentens anbefalinger. Sanntids kvantitativ PCR ble utført på en ABI PRISM 7000 ved anvendelse av følgende oligonukleotider og TaqMan® prober. Uttrykket nivåer av
MICA Hotell og
MICB
ble kalibrert ved hjelp av at huset holde 18S RNA påvises ved hjelp av følgende forover og bakover primere henholdsvis 3′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-5 «, 3»-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 «og SYBR Green.
MICA
transkripter ble detektert ved hjelp av følgende forover, revers oligonukleotider og TaqMan®-probe henholdsvis 3′-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 «, 3′-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5′ og 3»-ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5 «og de av
MICB
med F 3′-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 «, R 3′-CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5′, 3»-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 «i samme rekkefølge som ovenfor. Positive oppregulering av
MIC
transkripsjon ble konstatert i HeLa-celler dyrket ubehandlet eller varmesjokk, som tidligere beskrevet [24].
Diskusjon
Resultater og
Til tross for det faktum at den innledende » glitch «utløsende auto-immune sykdommer generelt og revmatoid artritt i særdeleshet, forblir det meste gåtefulle, tiår med forskning har brakt sammen flere plausible scenarier mens ved innvielsen, ulike stier og kaskader tendens til å mer eller mindre forevige en auto-reaktivt (T og /eller B-celle drevet) kraft, til slutt fører til symptomatisk patologi [6], [25] – [28]. En av de nyeste inkriminert T-celle-subpopulasjoner som sådan, er den fraksjonen av CD4
+ hjelper-T-celler som uttrykker den aktiverende reseptor NKG2D, men fri for ko-stimulerende molekyl CD28 [15]. NKG2D, en type-II-trans-membranoverflaten homodimer består av en C-type lektin ekstracellulære domene, etterfulgt av et transmembran og en kort cytoplasmatisk hale blottet for enhver spesiell signaleringsfunksjon. Molekylet signaliserer faktisk (minst i mennesket) via interaksjon med trans-membran adapter protein DAP10 (DAP10 og DAP12 i mus avhengig NKG2D isoform) [29]. NKG2D gjenkjenner en rekke fjernt beslektet ikke-konvensjonelle MHC klasse I-molekyler; i mennesket MIC [7] og RAET1 [30] (ULBP) [31] og i mus RAE1 og H60 [9], [29]. Den innledende Målet med dette arbeidet var å fremme vår kunnskap om potensielle rolle i MIC-NKG2D samhandling i autoimmunitet i mennesket. For at en slik å være tilfelle, (minst) to betingelser må være oppfylt: (1) for det første og ideelt sett organer målet for autoimmunitet (derav potensielt alle organer og /eller vev), bør ikke uttrykker MIC på basal tilstand, i Med andre ord, bør MIC skal kun påvist i sykt vev eller patologiske tilstander. (2) for det andre at systemisk og /eller vev-infiltrert autoreaktive CD4
+ T-celler uttrykker NKG2D og bli faktisk utvidet i en slik sykdom; et forspill til sitt potensial funksjonell relevans.
Igjen og selv om lærebok definisjonen av MIC uttrykk er at av kvasi-begrensning til enterocytes [20], [24], er virkeligheten langt fra å være så entydig og dette reduksjonistisk utsikt rett og slett ikke gjenspeiler virkeligheten (jf nedenfor). Faktisk er de første monoklonale antistoffer dannet mot MICA viste seg å farge fortrinnsvis, om ikke utelukkende kvasi-, humane enterocytter, med unntak av tymisk epitel [24]. Dette var i tråd med første nord blottings fremhever transkripsjon av genet, ikke i cellelinjer (transformert) av lymphohematopoeitic avstamning, men i de av epitel /fibroblastisk opprinnelse [7]. På den annen side har genoverføring eksperimenter klart vist, om og om igjen, at uansett linjen av mottakercellelinje, hvis transgenet (under en heterelogous promoter som er) er riktig transkribert, er MIC-proteinet er alltid syntetisert og delene celleoverflate-[24], [32] – [37], derav med unntak av en hvilken som helst celledelt «restriksjonselement (er)» slik som de som precedently vist seg å være nødvendig for riktig overflate ekspresjon av andre ikke-klassiske MHC klasse i gener f.eks klassisk HLA signalsekvens avledede peptider i tilfelle av HLA-E /Qa-1 i menneske /mus [38] eller bakterielt-avledede N-formylerte peptider i tilfelle av H2-M3 i mus [39]. Derav den kritiske spørsmålet er hvor vev /organ
MICA Hotell og
MICB
er faktisk transkribert, og da kan man trygt anta deres påfølgende overflate uttrykk. Så trivielt som dette spørsmålet kan virke, nesten 15 år siden deres identifikasjon [7], ingen systematisk transcriptional analyse av
MIC
gener har blitt publisert hittil. Her presenterer vi en første slike analyser. Faktisk omfattende Northern blotting av et stort antall av menneskelig vev og organer viser tydelig at i motsetning til tidligere stridigheter, både
MICA Hotell og
MICB
er mye transkribert. Som vist i figur 1 (toppfeltet), er disse transkriptene finnes i nesten alle organer undersøkt med unntak av det sentrale nervesystemet (topp, panel ytterste høyre, figur 1). Dette faktisk korrelerer perfekt med transkripsjon mønster av klassiske MHC-I loci, noe som gjenspeiles ved sondering de samme membraner med en
β
2 meter
cDNA probe (mellomliggende paneler, figur 1). Betale nærmere oppmerksomhet til
MIC
uttrykk mønster, en observerer at selv et organ «fylt» med lymphohematopoeitic celler – milten – er ikke blottet for
MICA
transkripsjoner og inneholder
MICB
transkripsjoner i like mengder som til andre organer (lunge, nyre …). Igjen er det klart fravær av
MIC
fra sentralnervesystemet er bemerkelsesverdig, og faktisk uventet, ved at det helt klart at paralleller av klassiske MHC-I-genene (
β
2m
panel ), og dette til tross for det faktum at i det minste de umiddelbare promotorområdene for disse loci (
MIC
og konvensjonell
MHC-i
) viser ikke noen tydelig sekvenshomologi [24]. Til slutt, og for å dekke den begrunnelse så mye som mulig med hensyn til
MIC
transkripsjon, utvidet vi dette transkripsjonen kartlegging fra friske til tumorized vev. En rekke av tumorer av forskjellige vevstyper ble analysert og sammenlignet med friske tilstøtende vev (figur 2). Igjen,
MIC
transkripsjon var mye til stede, og ingen generell mønster av induksjon /undertrykkelse kunne observeres i tumorer versus friskt vev (figur 2), i motsetning til precedently foreslo [13]. Derfor, alt i alt,
MIC
er transkribert i nesten alle undersøkte vev med unntak av sentralnervesystemet. Den generelle mønster i tumorer er en indikasjon på en «løs» transkripsjon mønster. Grunnen til at noen anti-MIC-antistoffer har tydeligvis vist seg å skildre en begrenset vev uttrykk mønster må derfor ligge andre steder, f.eks genetisk polymorfisme [40], ulike N-koblede glykosyleringsmønstre (MICA har 8 potensielle N-bundne glykosyleringsseter) [7], [24].
Panelet representerer RNA som stammer fra store organer. Hvert panel inneholder lunge-RNA som en intern standard. Toppanelet ble hybridisert med
MICA
cDNA. Differensial avskrift lengde
MICA Hotell og
MICB
skyldes en tidligere dokumentert større 3’UT i
MICB
mRNA [50]. Den midterste panelet viser uttrykk for
β
2 meter
, som vitner om β
2 meter bundet konvensjonell MHC-I uttrykk. Endelig
β-aktin
transkripsjon fungerer som en lasting kontroll. For mer detaljert forklaring se hovedteksten.
Det samme disposisjon som figur 1 gjelder, men denne gangen blotter inneholde kreft og kontroll (tilstøtende sykdomsfri vev) baner.
Etter å ha fastslått at
MIC
er transkribert og derfor potensielt oversatt i noen /alle vev, setter vi nå å undersøke relevansen av
MIC Hotell og indirekte at av MIC-NKG2D uttrykk i auto- immunitet. For eksempel ble tre prototypiske autoimmune sykdommer valgt, på grunn av deres iboende betydning for å forstå humane autoimmunitet [25], [41], [42], klinisk /medisinsk interesse, så vel som det faktum at med hensyn til RA, tidligere data hadde pekt MIC-CD4
+ NKG2D
+ samhandling i sykdom etiologi /patogenese [15]
for denne analysen følgende kohort av personer var samlet. 25 friske kontroller og 75 pasienter som lider fra de ovenfor nevnte auto-immune forstyrrelser, dvs. 35 RA, 15 SLE og 25 SS (tabell 1). Blant disse en undergruppe blant 10 kontrollpersoner, 10 RA, 2 SS og 2 SLE-pasienter ble i stor utstrekning immunophenotyped med et stort panel av antistoffer, i forskjellige kombinasjoner, for å måle interne standarder før full skala innsats (se Materialer og Metoder for full liste av antistoffer). På denne måten forskjellige T, B og NK-cellepopulasjoner ble undersøkt. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom pasient og kontroll populasjoner (data ikke vist). Nærmere bestemt fordeling av NKG2D ved overflaten av αβ CD8
+ og γδ T-lymfocytter, samt NK-celler, først testet ved bruk av de totale perifere blodcellepreparater, avdekket ikke som forventet noen nevneverdig forskjell mellom pasienter og kontroller. Vi snudde fokus til befolkningen av interesse dvs. CD4
+ NKG2D
+ T celler (figur 3). Forholdet av NKG2D ekspresjon på CD4
+ T-celler ble funnet å være like lik hos alle friske frivillige (0,8 til 8,5%, gjennomsnittlig 2,7%, standardavvik 2), alle RA (0,4 til 9,7%, gjennomsnittlig 2,1%, standard avvik 1,9), alle SLE (0,3 til 7,8%, gjennomsnittlig 2,4%, standardavvik 2), og alle pasienter SS (0 til 36,2%, gjennomsnittlig 4%, standard avvik 7,6) (figur 4). To SS pasienter ble faktisk funnet å ha høyere NKG2D uttrykk på deres CD4
+ T-celler (18,6% og 36,2% henholdsvis) (se nedenfor for videre analyse) (Tall 4 og 3.
NB
: Figur 3 viser faktisk en slik pasient). Fordi en presedens studien, som hadde funnet betydelig høyere CD4
+ NKG2D
+ T-celler i RA vs kontroller, hadde brukt et annet anti-NKG2D mAb, dvs. 1D11 (BD PharMingen) (vs ovenfor brukes ON72 klone , Beckman Coulter), har vi også testet dette antistoffet. Sammenligning av NKG2D farging med enten antistoffer på CD4
+ T-celler i 3 friske frivillige, 4 RA, en SLE og to SS viste ingen signifikant forskjell (gjennomsnittlig forskjell: 0,21, standardavvik: 0,24). Videre kan vi også sammenlignet denne immunfenotyping sammenligne den totale perifere blod vs. mononukleære celler, ved hjelp av ON72 mAb. Dette ble vurdert i en sunn frivillige, to RA og to SS uten hinter til noen forskjell (gjennomsnittlig forskjell: 0,33, standardavvik: 0,52). Til slutt, og for å fullt validere oppsett, intra-individuell stabilitet NKG2D uttrykk på CD4
+ T-lymfocytter ble bekreftet over tid i 2 friske frivillige ved henholdsvis dager 1/14 og 1/120, for en RA pasient på d1 /D120 og for 2 SS pasienter ved D1 /d150. Ingen nevneverdige forskjeller (betyr: 0,31, standardavvik: 0,5) ble observert i ulike lymfocytsubpopulasjoner og spesielt de CD4
+ T-celler uttrykker NKG2D. Gitt at den samme ovennevnte rapporten hadde hintet til induksjon av NKG2D uttrykk på CD4
+ T celler ved adjunction av TNFa (
in vitro
), RA pasienter under anti-TNFa terapi ble ikke tatt med i denne studie, til tross for det faktum at en foreløpig analyse av tre RA-pasienter som ble behandlet med infliximab ikke viste noen signifikant forskjell på graden av NKG2D ekspresjon på CD4
+ T-lymfocytter (data ikke vist). Derav alt i alt, var vi ikke i stand til å finne noen signifikant forskjell mellom CD4
+ NKGD
+ befolkningen i friske kontroller vs RA, SS eller SLE-pasienter. Til slutt, Figur 5 gir et fullstendig bilde av CD4
+ T-celle-basseng med hensyn til NKG2D og /eller nærvær eller fravær av CD28.
Dette eksempel, tatt fra en av de to pasientene SS (Fru XET) skjuler en spesielt høy andel av CD4
+ NKG2D
+ T celler (36,2%) illustrerer metoden som er benyttet for å nummerere disse cellene i alle individer (kontroller og pasienter) som inngår i dette arbeidet under en rutinemessig 50 000 arrangementer analyse.
Dette tallet viser forholdet mellom CD4
+ NKG2D
+ T-celler innen totale perifere CD4 basseng i kontroll, RA, SLE og SS individer. Variasjonen i SS pasienter skyldes 2 personer som representerer en uvanlig høy andel (se hovedteksten for forklaring). Ingen av forskjellene er viktig som vurderes av Wilcoxon tekst: p = 0,1658 for kontroller vs RA; p = 0,9547 for kontroller vs SLE og p = 0,5012 for kontroller vs SS.
Dette, mer global figur, analyserer forholdet mellom CD4
+ T-celler som bærer eller ikke CD28 og /eller NKG2D, eller ikke. Ingen av forskjellene er statistisk signifikante.
Slutt mål i RA være felles, vi satt ute ved siden analysere CD4
+ NKG2D
+ uttrykk nivåer innenfor mononukleære celler i leddvæsken høstet etter Ficoll densitetsgradientsentrifugering fra en RA albue og 5 kontroller (tre artrose og to ikke auto-immune kne leddgikt) pasienter. Igjen ble ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av NKG2D på CD4
+ T-celler ble fremhevet mellom kontroller og RA i leddvæsker, og mellom perifert blod og leddvæske i en RA pasient (data ikke vist). For ytterligere å undersøke betydningen av uttrykket av NKG2D på CD4
+ og CD8
+ T celler
in situ
, synovial vev ble analysert ved immunhistokjemi for å kvantifisere tilstedeværelsen av CD4, NKG2D, CD8 og MICA /B uttrykker celler. Dette ble utført i en RA (hofteprotese) og en slitasjegikt kontroll (kne kirurgi) individ. I kontrollgruppen ble enkelte NKG2D funnet å bli uttrykt på 3,8% av perifert blod CD4
+ T-lymfocytter sammenlignet med 2,5% av de som finnes i leddvæsken. Som denne personen ikke bære noen aktiv intra-leddbetennelse, det var ikke overraskende ikke å observere en bemerkelsesverdig infiltrasjon av CD4
+, CD8
+ +/- NKG2D
+ lymfocytter (ingen MIC uttrykk ble funnet enten i denne pasient). I RA pasient, ble NKG2D uttrykt på 0,9% av sirkulerende CD4
+ T-celler (ikke leddvæske kan hentes fra RA hoftegjennomgår kirurgi). Vevet infiltrere i RA (figur 6A) var hovedsakelig CD4
+ (figur 6B), mens CD8 uttrykk var mindre viktig (figur 6C). NKG2D uttrykk var tydelig eksklusive CD4 og mer i tråd med at av CD8 (figur 6D) (NB .: disse er forskjellige vev seksjoner, derav ingen superimposition er menings). Til slutt ble MICA /B uttrykkes på fibrinoblast /epitelceller og ikke på inflammatoriske infiltrater (Figur 7A og B).
(A) Farge flekk med Hematoxylin-eosin-farging. Immunhistokjemisk analyse ved bruk av (B) CD4 (C) CD8 og (D) NKG2D antistoffer. Den infiltrat er klart for lymfatisk opprinnelse med et flertall av CD4 T-celler.
Immunhistokjemisk analyse av (A) (B) RA synovitt og en (C) (D) SS utstyret spyttkjertel farget med en anti-MICA monoklonalt antistoff. MIC uttrykk er tydelig av epitel /fibroblastisk naturen i både vev /organer.
Selv om våre resultater i RA er på kant med noen av de tidligere publiserte data, kan noen avklaring av sistnevnte bidra til å sette våre resultater og faktisk hele spørsmålet i perspektiv. Før du gjør slikt, vi åpenbart ikke replikere arbeidet ved Groh et al. med hensyn til utvidelse av CD4
+ NKG2D
+ i RA selv om vi gjorde vårt beste for å holde seg til sin protokoll f.eks bruke de samme anti-NKG2D antistoffer etc. [15]. Det kan være rasjonelle forklaringer på sådan, en vesen mangelen på noen detaljert informasjon med hensyn til deres pasientpopulasjon, for eksempel fraksjonen i henhold til anti-TNFa-behandling etc. En dypere analyse av litteraturen viser faktisk at utvidelsen av dette tidsrom, CD4
+ CD28
– T-celler, er ikke så pathognomonic av RA som det kunne ha virket i starten [18]. Faktisk en nyere analyse av en uavhengig kohort av pasienter viser tydelig at halvparten av pasientene med RA (n = 94) (ifølge forfatterne de blottet for knute RA og sicca-syndrom) ikke har en betydelig økning i deres perifere CD4
+ CD28
– T-celle basseng med hensyn til kontroller (se figur 1 i [43] Endelig Saez-Borderias et al bringe inn en ny vri på problemet, ved å rapportere induksjon av CD4
+ NKG2D..
+ T-celler i respons til human cytomegalovirus (HCMV), som førte til forestille seg at den tidligere rapporterte utvidelser kan ha behov for å bli re-vurderes i lys av de HCMV serologiske status for pasienter og kontroller. Dette åpner også den avenue for denne undergruppe til å gjenkjenne, utover HCMV, andre mikrobielle midler, et punkt ikke testet i tidligere (og nåværende) studier [44].
for å undersøke potensielle betydningen av CD4
+ NKG2D
+ T-celler i immunpatologi av SS, immunhistokjemi ble utført på spyttkjertelvevet som mål å påvise CD4, NKG2D, CD8 og MICA /B. Tre SS spyttkjertelvevet ble oppnådd ved biopsi under sykehusoppholdet, mens en kontroll spyttkjertel vev ble hentet fra en ellers frisk frivillig individuell under neseplastikk for uavhengige grunner. I kontrollgruppen individ, gjorde immunohistokjemi ikke avsløre tilstedeværelsen av merkbare mengder CD4, CD8 og /eller NKG2D uttrykkende celler i samsvar med fravær av en hvilken som helst inflammatorisk infiltrat; Dette var like tilfelle for MICA /B uttrykk (data ikke vist). I SS, ble NKG2D uttrykt på henholdsvis 0,4, 0,9, 2% av perifert blod CD4
+ T-lymfocytter. Immunhistokjemi (figur 8A), focalized på inflammatoriske infiltrater, viste at i alle 3 pasienter, CD4 T-celler var mest utbredt, igjen gjensidig utelukkende med CD8-farging (figur 8B og C). Mengden og partisjonere av NKG2D uttrykk så ut til å være sammenlignbar med den til CD8, men ikke den av CD4 (figur 8D, C og B). Videre ble MICA /B uttrykk oppdaget på epitelceller kjertel kanaler, men ikke på lymfoide infiltrater (figur 7C og D).
(A) Color flekk av Hematoxylin-eosin farging. Immunhistokjemisk analyse ved bruk av (B) CD4 (C) CD8 og (D) NKG2D antistoffer. Den infiltrere er helt klart av lymfatisk opprinnelse med et flertall av CD4 T-celler.
Når det gjelder SS, gitt dokumentert uttrykk for MIC gener og proteiner i epitelceller [24], antatte involvering av ulike virus i SS patofysiologi [45] og det er relativt enkelt å få tilgang til målet vev, dvs. spyttkjertler; Vi forsøkte å kvantifisere graden av
MIC
transkripsjon i sunn og SS rammet spyttkjertlene. Dette ble oppnådd ved real-time kvantitativ PCR-analyse av
MICA Hotell og
MICB
transkripsjoner. Før du gjør slikt på kjertel RNA, ble metodikken godkjent for HeLa-celler; dokumentert å være husing
MICA /MICB
transkripsjoner på betydelige nivåer, der disse er regulert av stress i cellene f.eks varmesjokk [7], [24]. Varmesjokk ble utført som tidligere beskrevet [24]. Med hensyn til
MICA
det var en 8x induksjon etter 15 minutter og 3,5 × for
MICB
. Etter 60 minutter induksjon holdt seg på 4,5 × for
MICA
og 2 × for
MICB
. Typiske QRT-PCR tomter er vist i figur 9A og B. Innen spyttkjertelvevet, selv om uttrykket viser en klar inter-individuell variasjon, kunne observeres ingen signifikant forskjell mellom pasienter og kontroller (Figur 10A og B).
MICA product: (A) og
MICB product: (B) uttrykk profil som analyseres ved RT-qPCR. ▪ Prøvene 15 minutter etter varme sjokk, ♦ Samples 60 minutter etter varmesjokk, ▴ ubehandlede kontroller.
Relativ uttrykk nivå av
MICA product: (A) og
MICB
(B) i Sjögrens syndrom pasienter sammenliknet med friske kontroller. Forskjellene mellom pasienter og kontroller er ikke viktig som vurderes av Mann-Whitney
U
test (α = 0,27 for
MICA Hotell og α = 0,53 for
MICB
).
Som antydet ovenfor, blant alle 75 pasienter analysert, to SS pasienter (Mrs. XET og xrl, i denne rekkefølgen i dette avsnittet) gjorde faktisk presentere en spesielt høy forekomst av CD4
+ NKG2D
+ T-lymfocytter i perifert blod (henholdsvis 36,2% og 18,6%).
