Abstract
Vi har tidligere rapportert at økt eksitabilitet av ryggmargen (DRG neuroner) bidrar til utvikling av bein kreft smerte, noe som sterkt reduserer livskvaliteten til kreftpasienter. Nav1.8, en tetrodotoxin-resistente (TTX-R) natriumkanalen, bidrar det meste av natriumstrømmen underliggende virkningspotensialet oppoverslaget og står for det meste av strømmen i senere toppene i et tog. Vi spekulerer i at Nav1.8 natriumkanalen er en potensiell kandidat ansvarlig for den forbedrede oppstemthet av DRG nevroner i rotter med bein kreft smerte. Her, ved hjelp av elektrofysiologi, Western blot og atferdsanalyser, dokumentert vi at dagens tetthet av TTX-R natriumkanaler, spesielt Nav1.8 kanal, økt betydelig i DRG nevroner av rotter med kreft-indusert skjelettsmerter. Denne økningen kan skyldes økt uttrykk for Nav1.8 på membranen av DRG nevroner. Accordantly, blokade av Nav1.8 natriumkanaler ved sin selektive blocker A-803467 betydelig lindres kreft-indusert mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi hos rotter. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at funksjonell oppregulering av Nav1.8 kanaler på membranen av DRG nevroner bidrar til utvikling av kreft-indusert bensmerter
Citation. Liu XD, Yang JJ, Fang D, Cai J , Wan Y, Xing GG (2014) Funksjonell oppregulering av Nav1.8 natriumkanaler på membranen av Dorsal margen Nerveceller bidrar til utvikling av kreft-indusert Bone Pain. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10,1371 /journal.pone.0114623
Redaktør: Joseph Charles Glorioso, University of Pittsburgh School of Medicine, USA
mottatt: 7 august 2014; Godkjent: 11 november 2014; Publisert: 11.12.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81371237, 31171063,81072951), Beijing Natural Science Foundation (7112079), den spesielle grunnlaget for offentlig velferd yrke vitenskapelig forskningsprogram fra Helsedepartementet av Folkerepublikken Kina (201302013-01) og «973» program for departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2013CB531905). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
smerte Bone kreft som følge av primære svulster eller svulster som metastaserer til bein er en av de mest alvorlige og vanskelige typer kreft smerte, som reduserer livskvaliteten til pasienter [1]. Mekanismene bak utviklingen av skjelettsmerter kreft fortsatt i stor grad ukjent.
Nylig har vi og andre har funnet at termisk hyperalgesi og mekanisk overfølsomhet i murine modeller av bein kreft smerte er assosiert med økt eksitabilitet av primære nociceptive DRG nevroner [ ,,,0],2], [3]. Svarene på nociseptorer til skadelige stimuli er kodet av aksjonspotensialer som Genesis og forplantning er avhengig av spenningsstyrte natriumkanaler. Således har avvikende uttrykk mønstre i disse kanaler og nedarvede natrium- kanalopatier vært knyttet til neuropatisk og inflammatorisk smerte [4]. Voksen DRG nevroner kan uttrykke både tetrodotoxin følsomme (TTX-S) og tetrodotoxin-resistente (TTX-R) natriumkanaler. Blant de sistnevnte er det TTX-R-natriumkanal Nav1.8 spesifikt uttrykt på sensoriske nevroner [5], [6]. Derfor er Nav1.8 en av de mest attraktive mål for utvikling av nye farmasøytiske midler til å behandle smerte.
Nav1.8 gir en langsom inaktive, raske repriming TTX-R natrium oppdatert med depolarisert aktivering og inaktivespenningsavhengigheten [6], [7]. Nav1.8 bidrar det meste av natriumstrømmen underliggende aksjonspotensialet oppoverslaget i nerveceller som uttrykker kanal [8], [9]. Den biofysiske egenskapene Nav1.8, sin kritiske rolle i repeterende skyting, og sin tilstedeværelse i frie nerveender, hvor smertesignalering initiert, tyder på at Nav1.8 kan betydelig påvirke nociseptorer oppstemthet, og dermed bidra til smerte. Rollen Nav1.8 i nevropatisk og inflammatorisk smerte er godt gjennomgått av Dib-Hajj et al. [4]. Men om Nav1.8 bidrar til utvikling av kreft-indusert skjelettsmerter er i stor grad ukjent. Nylig, Qiu og medarbeidere [10] har observert en økt ekspresjon av Nav1.8 innenfor DRG i en rottemodell av Walker 256 tumorcelle-indusert benkreft smerte, noe som antyder den potensielle engasjement av Nav1.8 i utvikling av kreft-indusert ben smerte. I denne studien bruker elektrofysiologi, Western blot og farmakologiske atferd metoder, gir vi bevis som viser at funksjonell oppregulering av Nav1.8 kanaler på membranen av DRG nevroner bidrar til utvikling av kreft-indusert skjelettsmerter.
Materialer og metoder
Dyr
Voksen Sprague-Dawley rotter som veide 180-220 g på begynnelsen av forsøkene ble levert av Department of Experimental Animal Sciences, Peking University Health Science Center. Rottene ble plassert i adskilte bur med fri tilgang til mat og vann. Romtemperaturen ble holdt ved 24 ± 1 ° C under naturlig lys /mørke syklus. Alle eksperimentelle dyre prosedyrer ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra International Association for Study of Pain [11] og ble godkjent av Animal Care og bruk komité Peking University.
Inoculation av tumorceller
MRMT-1 rottebrystkjertler karsinom-celler ble dyrket i medium inneholdende RPMI 1640 (Hyclone, USA) og 10% føtalt bovint serum. Celler ble frigjort fra plasten ved kort eksponering til 0,25% (vekt /volum) trypsin (Gibco, USA), og deretter klargjort for injeksjon som følger: cellene ble først oppsamlet ved sentrifugering av 10 ml medium i 3 minutter ved 1000 opm . Den resulterende pellet ble deretter resuspendert i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS), og cellene ble tellet ved bruk av et hemocytometer. Deretter ble cellene fortynnet for å oppnå den endelige konsentrasjonen for injeksjon, og holdt på is inntil de injiseres i dyr. En rottemodell av benkreft smerte ble etablert ved intratibial injeksjon av syngene MRMT-1-celler som tidligere beskrevet [12]. I korthet, etter bedøvd med kloralhydrat (0,3 g /kg, i.p.), ble rotten venstre tibia nøye eksponert, og en 23-gauge nål ble ført inn i intramedullære kanal av benet. Den ble deretter fjernet og erstattet med en lang tynn stump nål festet til en 10-ul Hamilton-sprøyte som inneholdt det medium som skal injiseres. Et volum på 4 pl MRMT-1 rottebrystkjertel carcinoma celler (4 x 10
4) eller bærer (PBS) ble injisert i tibial benhulrommet. Etter injeksjon området ble forseglet med bein voks, og såret ble endelig avsluttet. Ingen av dyrene viste tegn på motorisk dysfunksjon etter implanteringen av tumorceller.
Hel-celle-patch clamp opptak
nevroner ble isolert fra L4 og L5 DRG av voksne rotter ved hjelp av fremgangsmåter som er beskrevet i vår tidligere studier [3], [13]. Kort sagt ble nylig dissekert ganglia hakket og vasket i kald, oksygenert Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Sigma), og ble deretter utsatt for kollagenase (3 mg /ml, type IA, Sigma) behandling i 45 minutter, fulgt av trypsin (2- mg /ml, type II-S, Sigma) i 15 minutter ved 37 ° C. Den enzymatiske reaksjon ble stanset ved vasking av cellene med DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum, og de resterende bitene av ganglier ble forsiktig triturert ved anvendelse av en flammebehandlet glass Pasteur pipette og ført gjennom en 40-mikrometer celle sil. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 800 opm i 3 minutter, og cellepelleten ble resuspendert i frisk DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum. De dissosierte celler ble plassert på poly-D-lysin (0,1 mg /ml, Sigma) behandlede dekkglass inneholdt i 4-brønners sterile vevskulturplater og holdt i 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C i 2 til 3 timer før opptak.
Hel-celle patch clamp opptak fra akutt dissosierte DRG nevroner ble utført ved hjelp av en EPC-10 forsterker og Patchmaster programvare (HEKA, Freiburg, Tyskland). Patch pipetter ble trukket fra borsilikatglass kapillærer med en spiss motstand på 5 til 8 Megohm når de er fylt med innvendig løsning som inneholdt følgende (i mM): 135 CsF, 10 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA og 2 Na
2ATP. PH ble justert til 7,3 ved hjelp av CsOH. Den eksterne oppløsning inneholdt følgende (i mM): 30 NaCl, 20 TEA-Cl, 90 kolin-Cl, 3 KCl, 1 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 HEPES, 10 glukose og 0,1 CDCh
2. PH ble justert til 7,3 ved bruk av Tris-basen. Membran strømmer ble målt med pipette og membran kapasitans kansellering, filtreres ved 2 kHz og digitalisert ved 10 kHz.
Under spennings-klemme innspillingsmodus, ble cellene festet ved -70 mV, og seriemotstand ble kompensert for 70 % -90%. Membranen kapasitans ble kjøpt fra forsterkeren ved Patchmaster programvare for bestemmelse av størrelsen på cellene og beregning av strømtettheten. Alle registreringer ble utført på små og middels diameter (20-35 um) DRG-neuroner, som er kjent for å uttrykke både TTX-S og TTX-R-natriumstrømmene [14], [15]. TTX-R strømninger ble fremkalt fra en driftsenhet potensial på -120 mV til test pulser varierer -80 til 45 mV i trinn på 5 mV med en frekvens på 0,2 Hz i nærvær av TTX (300 nM) for å blokkere all TTX -S kanaler. En Nav1.8-mediert natriumstrømmen ble utløst med en spennings klemme protokoll som brukes av Rush og Waxman [16] og Berta et al. [17] i nærvær av 300 nM TTX. Test pulser som varierer -80 til 40 mV i trinn på 5 mV ved en frekvens på 0,2 Hz, ble innledet av en 500 ms puls pre-trinnet ved -40 mV, for å inaktivere TTX-R Nav1.9 mediert strøm. Den maksimale toppstrøm ved forskjellige spenninger ble brukt for strømtetthet analyse. De normaliserte kurvene aktiverings (I /I
0) ble montert ved bruk av følgende Boltzmann-fordeling ligning: I /I
0 = 1-1 /{1 + exp [(V
1/2-V
m) /k]}, hvor i
0 er maksimal peak strøm på ulike testspenninger, V
m er testen potensial, V
1/2 er membranpotensialet ved halvmaksimalt i, og k er skråningen faktor. Den spenningsavhengige steady-state inaktivering ble beregnet ved å måle toppstrøm amplituden fremkalt ved en 100 ms testpuls til -10 mV etter en 500 ms pre-puls til potensial over området fra -80 til 10 mV med en 20-s inter-pulsperioden. De normaliserte inaktiveringskurvene (I /I
0) ble montert ved bruk av følgende Boltzmann-fordeling ligning: I /I
0 = 1 /{1 + exp [(V
1/2-V
m) /k]}, hvor i
0 er toppnatriumstrømmen i det testet puls målt fra den mest negative puls forkondisjonering potensial, V
m er forkondisjonering puls potensial, V
1/2 er membranpotensialet på halv-maksimal i, og k er skråningen faktor. Dataanalyse og montering ble utført ved anvendelse av Origin Software 8,5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).
Western blot
Rotter ble dypt bedøvet med 10% kloralhydrat (0,3 g /kg, ip) , og deretter L4 og L5 DRG ble fjernet og umiddelbart homogenisert i henhold til den protokoll som er beskrevet i vår tidligere rapport [18] for totalt protein ekstraksjon og analyse. For cytosol eller membran protein utvinning og separasjon, ble DRG vev dissekert og lysert ved homogenisering med Nucl-Cyto-Mem forberedelse kit (Applygen, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner, og deretter analysert ved hjelp av metoder beskrevet av Black et al. [19]. Ti mikrogram av totalt protein, ble blandet med 4 x ladningsbuffer og deretter underkastet SDS-PAGE. Etter blokkering med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann og Tween (TBST, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl og 0,05% Tween-20) i 60 minutter ved romtemperatur, ble PVDF-membraner ble inkubert med følgende primære antistoffer ved 4 ° C over natten: kanin anti-rotte Nav1.8 antistoff (1:1000, Alomone Labs), mus anti-β-aktin (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), eller mus anti-rotte transferrin reseptor (TfR) antistoff (1:2000, Invitrogen). Blottene ble vasket i TBST og deretter inkubert i pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin /mus IgG sekundært antistoff (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens deteksjon kit (Pierce) etterfulgt av autoradiografi hjelp av Hyperfilm MP (Santa Cruz Biotechnology). Blottene ble skannet med en kanon scanner (Cannon, Inc., Japan), og bandet tetthetene ble funnet med Kvantum en programvare (Bio-Rad, USA). Data fra fem rotter ble brukt for statistisk analyse.
Implantasjon av intratekal kateter og injeksjon av narkotika
For farmakologiske blokade av Nav1.8 kanaler, kateter ble implantert samtidig med MRMT- 1 tumorceller eller PBS inokulering. Under kloralhydrat (0,3 g /kg, i.p.) anestesi, ble implantering av intratekal kanyle utført som beskrevet i vår tidligere studie [20]. I korthet ble et PE-10 polyetylenkateter implantert mellom L5 og L6 ryggvirvler for å nå den trelast utvidelse av ryggmargen. Den ytre delen av kateteret ble plugget og fast på huden på lukking av såret. Alle kirurgiske prosedyrer ble utført under sterile betingelser. Rotter som viser nevrologiske utfall etter at kateteret implantering ble ekskludert.
For å undersøke effekten av farmakologisk blokade av Nav1.8 med en selektiv antagonist A-803467 (Tocris, UK) på bein kreft rotter A-803467 (50, 100 og 150 nmol) eller dens bærer (1% DMSO) ble intratekalt levert til MRMT-1 rotter på dag 14 etter inokulering av tumorceller når smerte overfølsomhet vises. Som en kontroll, høy dose av A-803 467 (150 nmol) eller dens bærer (1% DMSO) ble også administrert intratekalt for å PBS inokulert narre dyr på dag 14 etter inokulering PBS. Medikament eller vehikkel ble intratekalt injisert via implanterte kateteret i en 10 ul volum av løsningen etterfulgt av 10 pl av normalt saltvann (NS) for spyling. Hver injeksjon varte i minst 5 min. Etter en injeksjon, forble nålen in situ i 2 minutter før den ble trukket tilbake. Både smerte atferd og muskelfunksjon av dyr ble evaluert ved 15, 30, 60, 90 og 120 minutter etter narkotika søknad.
Vurdering av mekanisk allodyni
Mekanisk allodyni, som et atferds tegn på bein kreftsmerte, ble vurdert ved å måle 50% potetilbaketrekning terskel (PWT) som beskrevet i tidligere rapporter [3], [21]. Den 50% PWT som svar på en rekke von Frey filamenter (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) ble bestemt av opp og ned metoden [22]. Rotter ble plassert på et metallnett gulvet dekket med et invertert klar plast bur (18 x 8 x 8 cm) og fikk en 20-minutters periode for tilvenning. Åtte von Frey filamenter med tilnærmet like logaritmisk inkrementelle (0,224) bøyekrefter ble valgt (0,41, 0,70, 1,20, 2,00, 3,63, 5,50, 8,50 og 15,10 g). Hvert forsøk startet med et von Frey kraft av 2,00 g levert vinkelrett på plantar overflate av den venstre bakpote i ca 2-3 sekunder. En brå tilbaketrekking av foten i løpet av stimuleringen eller umiddelbart etter fjerning av håret ble angitt som en positiv reaksjon. Når det var en positiv eller negativ respons, den neste svakere eller sterkere filament var påført, respektivt. Denne fremgangsmåte ble utført inntil seks stimuli etter den første endringen i respons hadde blitt observert. Den 50% PWT ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: 50% PWT = 10
(X
f
+ kδ), hvor X
f er verdien av den endelige von Frey filament som brukes (i log-enheter), k er en verdi som er målt fra mønsteret av positive /negative responser, og δ = 0,224, som er den gjennomsnittlige intervallet (i log-enheter) mellom von Frey filamenter [23]. Dersom et dyr responderte på laveste von Frey filament, ble en verdi på 0,25 g tildelt. Hvis et dyr ikke svare på det høyeste von Frey filament, ble verdien registrert som 15,0 g. Testing økter ble utført på 0, 15, 30, 60, 90 og 120 minutter etter injeksjon av narkotika.
Vurdering av termisk hyperalgesi
Termisk hyperalgesi av bakpote ble testet som beskrevet av våre tidligere rapporten [20]. Rotter fikk lov til å akklimatisere seg i minst 30 minutter i løpet av akryl kabinetter på en klar glassplate holdt ved 30 ° C. En strålevarmekilde ble fokusert på plantar overflate av bakpoten. Måling av potetilbaketrekning latens (PWL) ble tatt med en timer som ble startet ved aktivering av varmekilden og stoppet når tilbaketrekking av pote ble påvist med en fotodetektor. En maksimal cut-off tid på 30 s ble anvendt for å hindre unødvendig skade på vev. Tre målinger av PWL ble tatt for hver bakpote, og ble beregnet som produktet av hver testsesjon. Den bakfot ble testet vekselvis med mer enn 5 min intervaller mellom etterfølgende tester.
Vurdering av muskelfunksjonen
Skrå-plate test ble utført for vurdering av bevegelsesfunksjonen til rotter fikk A-803467 (150 nmol). Rotten ble plassert på tvers av lengdeaksen av en skråstilt plate. Den innledende vinkelen av den skråstilte plate var 50 °. Vinkelen ble deretter justert i trinn på 5 grader. Den maksimale vinkel av platen på hvilken rotten beholdt sin kroppsstilling i 5 s, uten å falle ble bestemt i henhold til den metode som er rapportert tidligere [24].
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 5.0 pakke (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Én-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest eller to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc-test ble brukt for multiple sammenligninger. Forskjeller med P. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Økning i TTX-R natrium strøm i DRG nevroner av rotter med bein kreftsmerter
For å utforske hvorvidt TTX- R natriumkanaler bidra til utvikling av kreft-indusert skjelettsmerter, vi først målte TTX-R-natrium strømmer som tas opp på akutt isolert DRG-nevroner i en rottemodell av benkreft smerte, ved tilsetning av TTX (300 nM) til badet for oppløsning for å blokkere alle TTX-sensitive kanaler [25]. Den spenningsprotokoll vi benyttet er vist i fig. 1A. Vi har funnet at tettheten av TTX-R-natriumstrømmen økes gradvis etter inokulering av tumorceller i en tidsavhengig måte. På dag 7 etter inokulering, ble ingen signifikant forskjell ble observert på tettheten av TTX-R-natriumstrømmen mellom nerveceller fra rotter behandlet med MRMT-1 tumorceller (96,67 ± 8,2 pA /pF, n = 14) og de fra rotter behandlet med PBS (97,08 ± 5,8 pA /pF, n = 15) (P 0,05, to-veis ANOVA, figur 1C, D og G.), som er konsistent med våre tidligere atferds funn viser var det ingen mekanisk eller termisk smerte overfølsomhet ved at tid [3]. Imidlertid, på dag 14 etter inokulering, tettheten av TTX-R-natriumstrømmen økt betydelig i MRMT-1-behandlede rotter (181,34 ± 17,2 pA /pF, n = 19) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (P 0,001, to-veis ANOVA, fig 1E til G).. Representative spor av TTX-R-natriumstrømmen i naive, PBS-behandlede og MRMT-1-behandlede rotter, som tas opp på DRG-neuroner ved 7 og 14 dager etter inokulering av tumorceller eller PBS er vist i fig. 1B til F.
(A): Spenning protokoll som brukes for opptak av TTX-R-natriumstrømmen med 300 nM TTX i badoppløsningen. (B til F): Representative spor av TTX-R natriumstrømmen i naive (B), PBS-behandlet (C og E) og MRMT-en-behandlet (D og F) rotter, innspilt på DRG nevroner ved 7 (C og D) og 14 (E og F) dager etter inokulering av tumorceller eller PBS. (G): Statistisk analyse av toppstrømtettheten. Legg merke til at tettheten av TTX-R-natriumstrømmen er betydelig økt i den DRG-neuroner i ben- kreft rotter.
***
P
. 0,001, sammenlignet med PBS gruppe, to-veis ANOVA, n = 19 (MRMT-1) og 15 (PBS)
økning i Nav1.8 natrium strøm i DRG nevroner av rotter med bein kreftsmerter
for å isolere Nav1.8 natrium strøm fra total TTX-R natrium strøm, brukte vi en annen spenningsprotokoll med en 500-ms pre-puls på -40 mV å inaktivere Nav1.9 kanal som beskrevet i forrige rapport [17] (fig. 2G). Resultatene viste at tettheten av Nav1.8-mediert natriumomløps 14 dager etter inokulering økt betydelig i MRMT-1-behandlede rotter (136,11 ± 10,4 pA /pF, n = 17) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (74,09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (P 0,001, to-veis ANOVA, figur 2D til F).. I likhet med densiteten av TTX-R-natriumstrømmen forbli Nav1.8-mediert strømtetthet uforandret på dag 7 etter inokulering av tumorceller (P 0,05, sammenlignet med PBS, to-veis ANOVA, n = 11 MRMT- 1 og 12 PBS, fig. 2B, C og F). For å undersøke om de iboende egenskapene til Nav1.8 natriumkanalen ble endret etter vaksinasjonen av tumorceller, undersøkte vi både aktiverings og inaktive kurver av Nav1.8-mediert natrium strømninger i naive, PBS-behandlede og MRMT-en-behandlede rotter . Som vist i fig. 2H og I, ingen signifikant endring ble observert på enten aktivering (fig. 2H) eller inaktivering (fig. 2I) kurver hos de tre gruppene, noe som indikerer at de iboende egenskapene til Nav1.8 natriumkanal forble uendret etter inokulering av tumor celler. Representative spor av Nav1.8-mediert natriumstrømmen i naive, PBS og MRMT-1-behandlede rotter, som tas opp på DRG-neuroner ved 7 og 14 dager etter inokulering av tumorceller eller PBS er vist i fig. 2A til E.
(A til E): Representative spor av Nav1.8-mediert natriumstrømmen i naive (A), PBS (B og D) og MRMT-1-behandlede (C og E) rotter, tatt opp på DRG-neuroner ved 7 (B og C) og 14 (D og E) dager etter inokulering av tumorceller eller PBS. (F): Statistisk analyse av toppstrømtettheten. Legg merke til at tettheten av Nav1.8-mediert natriumstrømmen er betydelig økt i den DRG-neuroner i ben- kreft rotter.
***
P
0,001, sammenlignet med PBS gruppe, to-veis ANOVA, n = 17 (MRMT-1) og 16 (PBS). (G): Spenning protokoll som brukes for opptak Nav1.8-mediert natrium strømmer med 300 nM TTX i badoppløsningen. En 500-ms pre-puls på -40 mV ble brukt til å inaktivere Nav1.9 natriumkanaler. (H og I): Aktivisering og inaktive kurver av Nav1.8-mediert natriumstrømmen i naive, PBS-behandlede og MRMT-en-behandlede rotter ved 14 dager etter inokulering av tumorceller eller PBS. Legg merke til at ingen vesentlig forandring observeres enten på aktivering (H) eller på inaktivering (I) kurver mellom de tre gruppene. Aktiveringskurver ble tilpasset ved å bruke den samme protokollen som brukes for opptak av Nav1.8 natriumstrømmen. Merk at kurvene i Naive og PBS grupper overlapper nesten helt. Inaktive kurvene ble montert ved hjelp av protokollen beskrevet i metodene.
Økning i membran uttrykk for Nav1.8 protein i DRG av rotter med bein kreftsmerter
Videre har vi undersøkt ekspresjon av Nav1.8 protein i DRG av rotter med kreft-indusert skjelettsmerter, særlig kanalene på cellemembranen, som representerer funksjonelle kanaler. Ved hjelp av Western blot analysen, fant vi at uttrykket av Nav1.8 total protein i ipsilaterale L4 og L5 DRG uendret fra dag 7 til dag 14 i MRMT-en-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter (P 0,05, to- veis ANOVA, n = 4 /gruppe, fig. 3A). Dette var uventet, da elektrofysiologiske eksperimenter viste en øket strømtetthet på Nav1.8 i MRMT-1-behandlede rotter (se fig. 2). Vi spekulerer i at en slik økning av Nav1.8 natriumstrømmen er sannsynligvis på grunn av øket ekspresjon av Nav1.8 på cellemembranen, fordi de iboende egenskapene til Nav1.8 natriumkanal forble uendret etter inokulering av tumorceller (se fig. 2 H og JEG). For å klargjøre denne hypotesen, vi videre oppdaget at membranen ekspresjon av Nav1.8 ved anvendelse av en høyhastighets-sentrifugeringsmetoden for å isolere membranfraksjonen fra DRG-celler som beskrevet i foregående studie [19]. Som forventet, 14 dager etter inokulering av tumorceller, bandet tettheten av Nav1.8 protein som uttrykkes på cellemembranen økt markert MRMT-1-behandlede rotter (1,45 ± 0,06, n = 6) sammenlignet med PBS-behandlede rotter ( 0,87 ± 0,07, n = 6) (P 0,001, to-veis ANOVA, figur 3B).. I mellomtiden har båndet tettheten av Nav1.8 protein lokalisert i cytosolen avtatt betydelig i MRMT-1-behandlede rotter (0,57 ± 0,04, n = 3) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (1,09 ± 0,02, n = 3) (P . 0,001, to-veis ANOVA, figur 3C)
(A). Totalt Nav1.8 protein. Øvre: representant for Western blot band; Nedre: statistisk analyse av Nav1.8 total protein uttrykk. Ingen signifikant forskjell observeres på ekspresjon av Nav1.8 totalt protein blant de tre gruppene.
P
0,05, to-veis ANOVA, n = 4 /gruppe. (B): Nav1.8 membranprotein. Øvre: representant for Western blot band. Transferrin-reseptor (TfR) blir anvendt som intern kontroll. Nedre: statistisk analyse av Nav1.8 membran protein uttrykk. Legg merke til at uttrykket av Nav1.8 på cellemembranen er økt betydelig de DRG neuroner i MRMT-1-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter.
***
P
0,001, to-veis ANOVA, n = 6 /gruppe. (C): Nav1.8 protein i cytosol. Legg merke til at uttrykket av Nav1.8 i cytosol er betydelig redusert i den DRG-neuroner i MRMT-1-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter.
***
P
. 0,001, to-veis ANOVA, n = 3 /gruppe
A-803467 lindrer mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi av bein kreft rotter
til slutt, vi undersøkt om A-803 467, en selektiv blokkering av Nav1.8 [26] kunne lindre kreft-indusert skjelettsmerter hos rotter. Vi testet PWT og PWL på dag 14 etter inokulering av tumorceller eller PBS som basislinjen. Deretter, A-803 467 eller bærer DMSO ble intratekalt levert til MRMT-1 inokulerte kreftsmerte hos rotter, så vel som PBS inokulert sham-rotter, og både PWT og PWL ble målt ved 15, 30, 60, 90 og 120 minutter etter medikament påføring. Doseringen og injeksjon roten av A-803467 ble ifølge en tidligere rapport som viser at intratekal administrasjon av A-803467 (50-150 nmol) reduserer både fremkalt og spontane utslipp av bredt dynamisk område (WDR) nevroner i rygg dorsalhorn [27 ]. Som vist på fig. 4, kan intratekal administrering av A-803 467 (ved både 100 og 150 nmol) fremtredende gjenopprette reduksjonen benkreft-indusert både PWT (P 0,05 til 0,001, sammenlignet med kjøretøy /kreft rotter gruppe, to-veis ANOVA, n = 7-8 /gruppe, fig 4A) og PWL (P . 0,05 til 0,001, kontra kjøretøy /kreft rotter gruppe, to-veis ANOVA, n = 6-9 /gruppe, fig 4B) av kreft hos rotter.. I motsetning til dette, og med en høy dose av A-803 467 (150 nmol) hadde ingen signifikant effekt på PWL og PWT av PBS ble inokulert sham-rotter (P 0,05, sammenlignet med kjøretøy /narre rotter gruppe, to-veis ANOVA, n = 6 /gruppe, fig. 4A og B). For å utelukke eventuelle motorisk dysfunksjon indusert av A-803 467, vi undersøkte også effekten av A-803467 (til en maksimal dose på 150 nmol) på bevegelsesfunksjon rotter ved hjelp tilbøyelig-plate test. Som vår forventning ble det ingen signifikant motorisk dysfunksjon observert på noe tidspunkt etter sprøyte (p 0,05, en-veis ANOVA, n = 7 /gruppe, figur 4C.). Disse dataene tyder på at inhibering av Nav1.8 av A-803467 kan redde tumorindusert mekanisk allodyni og varme-hyperalgesi i beinkreft hos rotter
(A, B):. Effekter av A-803 467 (ved 50 , 100 og 150 nmol) på mekanisk (A) og termisk (B) smertestillende oppførsel i rotter evaluert på dag 14 etter inokulering av MRMT-1 tumorceller eller PBS. Legg merke til at A-803 467 gjenoppretter bemerkelsesverdig at kreftceller-indusert reduksjon av PWT og pwl i kreft modell rotter, men har ingen signifikant effekt på pwl og PWT i PBS vaksinert humbug rotter.
* /#
P
0,05,
** /##
P
0,01,
***
P
0,05, enveis ANOVA, n = 7 /gruppe
Diskusjoner
Funksjonell oppregulering av Nav1.8 natriumkanaler i DRG nevroner av. rotter med bein kreftsmerter
i samsvar med tidligere funn om at uttrykket av Nav1.8 mRNA og protein er økt innenfor korsrygg 4-5 DRG i en dyremodell av bein kreftsmerter [10], vår nåværende studie gir ekstra direkte bevis som viser en funksjonell oppregulering av de spenningsstyrte natriumkanalen subtype Nav1.8 på membranen av DRG nevroner i et rottekreftsmerter modell, som viste seg å være nødvendig for utvikling av kreft-indusert skjelettsmerter.
Biofysiske og farmakologiske studier har avdekket at fire perifer-spesifikke natriumkanaler inkludert TTX-S-kanaler NaV1.3 og NaV1.7 og TTX-R kanaler NaV1.8 og NaV1.9 er fortrinnsvis uttrykt på primære sensoriske DRG nevroner og spill en viktig rolle i patofysiologien av forskjellige smertesyndromer [18], [28], [29]. Blant dem har Nav1.8 natriumkanalen er vist å være nødvendig for mange typer av kronisk inflammatorisk og neuropatisk smerte [26], [30], [31]. Imidlertid er rollen til Nav1.8 natriumkanal i patogenesen av benet kreftsmerte fortsatt ukjent. Selv om Qiu et al. [10] har observert et økt uttrykk av Nav1.8 innenfor DRG i en rottemodell av bein kreft smerte, gjorde de ikke definitivt trekke en konklusjon om hvorvidt den økte Nav1.8 natriumkanalen bidrar til kreft-indusert skjelettsmerter. I en annen studie, Miao og kolleger [32] har rapportert en betydelig nedregulering av Nav1.8 uttrykk i DRG i et rottekreftsmerter modell. Likevel bruker antisense oligodeoksynukleotider (ODNs) mot Nav1.8, fant de at knock-down av Nav1.8 uttrykk i DRG nevroner kan lindre etablert kreft smerte atferd i tumorbærende rotter, noe som tyder på en mulig rolle Nav1.8 i utviklingen og vedlikehold av bein kreft smerte. Inkonsekvent, har en fersk studie ved hjelp av betinget knock-out mus vist at verken Nav1.7 eller Nav1.8 er nødvendig for kreft-indusert skjelettsmerter [33]. I vår nåværende studie presenterer vi elektrofysiologisk og biokjemiske bevis som viser at tettheten av Nav1.8-mediert natriumstrømmen er betydelig økt i DRG nevroner av rotter med bein kreft smerte, og at denne økningen skyldes trolig økt uttrykk for funksjonell NAV1 .8 natriumkanaler i cellemembranen i stedet for forandringer i indre egenskaper eller totalt protein ekspresjon av kanalene, fordi det, sammen med den forbedrede tetthet av både TTX-R- og Nav1.8-mediert natriumstrømmene, ekspresjon av membranprotein
