Abstract
melkekjertlene utvikling og brystkreft vekst krever flere faktorer både av endokrine og parakrint opprinnelse. Vi analyserte rollene som epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og hepatocytter Growth Factor Receptor (Met) i bryst epitelceller og brystsvulstceller avledet fra en mutert-ErbB2 transgene mus. Ved å bruke svært spesifikke tyrosinkinaseinhibitorer fant vi at MCF-10A og NMuMG mammary epiteliale cellelinjer som er helt avhengig av EGFR aktivering for deres vekst og overlevelse. Spredning og 3D-morphogenesis analyser viste at HGF hadde ingen rolle i å opprettholde melke celle levedyktighet, men var den eneste cytokin stand til å redde EGFR-hemmet mammary celler. Insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I), grunnleggende fibroblastvekstfaktor-(b-FGF) og neuregulin, som er vel kjent mammary morphogenic faktorer, ikke redde spredning eller morfogenese i disse cellelinjene, som følge EGFR hemming. Tilsvarende ErbB2-drevet tumorceller er EGFR-avhengige og også vise HGF-medierte redning. Western-blot-analyse av de signalveier som er involvert i rednings etter EGFR inhibering antydet at samtidig ERK1 /2 og AKT-aktivering var utelukkende drevet av Met, men ikke av IGF-I eller b-FGF. Disse resultatene beskriver en unik rolle for EGFR og Met i mammary epitelceller ved å vise at tilsvarende trasé kan brukes av tumorigene celler til å opprettholde vekst og motstå til EGFR-rettede anti-tumorigen medikamenter
relasjon:. Accornero P, Miretti S, Bersani F, Quaglino E, Martignani E, Baratta M (2012) Met Receptor Apg Unikt for overlevelse og morphogenesis av EGFR-Dependent Normal melke Epithelial og kreftceller. PLoS ONE 7 (9): e44982. doi: 10,1371 /journal.pone.0044982
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 4 mai 2012; Godkjent: 16 august 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Accornero et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale bevilgninger fra departementet for Undervisning, universitet og forskning, PRIN 2009 og av lokale tilskudd fra Università di Torino og Compagnia di San Paolo. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sirkulasjons hormoner som østrogen, progesteron, veksthormon og prolaktin var blant de første endokrine faktorer som ble identifisert til å være nødvendig for melkekjertlene morphogenesis og differensiering under vekst, reproduktiv syklisitet og graviditet [1]. Selv om en direkte rolle for disse hormonene er kjent, nyere bevis viser at deres viktigste biologiske aktiviteter oppnås gjennom utgivelsen av lokale vekstfaktorer av mammary epitelceller og stromale celler. Disse faktorene senere diffuse og aktivere deres respektive reseptorer i stromal eller epitelceller avdelinger fremme en epitelial-mesenchymale interaksjon. Begge cellulære avdelinger av pakkboksen er således nødvendig for riktig utvikling av dette organ [2] – [4]. Disse indirekte signalmekanismer sikrer at den systemiske stimulus forsterkes innenfor målet orgel og at ulike celletyper delta i morphogenic hendelser på en koordinert måte og finjustert i henhold til lokale krav.
De fleste av disse lokalt utgitt molekyler virker via spesifikke reseptorer tyrosinkinase (RTK) fremme flere biologiske responser, for eksempel proliferasjon, remodellering av den ekstracellulære matriks og motilitet av målcellene. Selv om noen av disse faktorene har en nøyaktig og unik rolle i løpet av morfogenese eller ombygging av kjertelen, flere signalveier aktivert nedstrøms for forskjellige RTK’er er identiske. Således kan disse banene virke som overflødige når den aktiveres samtidig i den samme celletype, eventuelt forsterkende fosforylering kaskade og dens endelige biologiske virkning.
En av de best beskrives RTK som fungerer som en fundamental morphogenic modulator i melke kjertel er epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Innenfor gnager melkekjertlene, lokalt frigjort amfiregulin, hvis eneste kjente reseptor er EGFR, ble funnet å mediere østrogensignalisering i løpet av pubertets mammary utvikling. Steroid hormon virker ved å stimulere amfiregulin utgivelsen av østrogen reseptor positiv epitel rommet av kjertelen. Amfiregulin fremmer deretter EGFR-aktivering i stromal rommet i kjertel å drive den riktige forgrening av dette organ [5], [6]. Selv om de viktigste målene for amfiregulin er stromale celler, betyr ikke utelukke at EGFR signale har også en rolle i epitel. EGFR er uttrykt i både stromale og epiteliale kamrene [7], [8], og andre EGFR-ligander, spesielt EGF, er sterkt uttrykt i kjertlene under graviditet [9]. Dermed vår første mål var å vurdere om EGFR spiller en rolle i mammary epithelial cellevekst og omsetning. Vi gjorde dette ved å målrette denne reseptoren med svært spesifikke hemmere. Vanskeligheten med å avklare rollen til EGFR i den voksne melke epithelial rommet er muligens på grunn av det faktum at andre reseptorer, med et lignende uttrykk mønster, kan erstatte fraværet av EGFR eller dets ligander
in vivo
. Faktisk stromale fibroblaster produsere mange signaler til nabo epitelceller. Flere vekstfaktorer, slik som insulinlignende vekstfaktor (IGF), fibroblast vekstfaktor (FGF), neuregulin og hepatocytt-vekstfaktor (HGF) er uttrykt i melke stroma, mens deres respektive reseptorer finnes i epitelet [1]. Nærmere bestemt, har IGF-I en viktig rolle i duktalt morfogenese, og kan være nødvendig for senere stadier av mammary utvikling [10]. FGFR2 er involvert i mammary utvikling, spesielt i proliferasjon og invasjon av terminale ende knopper, men virker unnværlig i den modne kjertel [11], [12]. Neuregulin opererer under lobulo-alveolar utvikling ved graviditet [13], [14]. Til slutt, tyrosin-kinase-reseptor for HGF, Met, ble funnet å spille en rolle i bryst forgrening morfogenese i
ex vivo
og
in vitro eksperimenter
[15], [16]. Met kan være en god kandidat for EGFR erstatning siden siste bevis har vist at denne reseptoren og EGFR kan opptre i fellesskap i løpet av nyre utvikling for å regulere ureter knopp forgrening og megle vedlikehold av normal voksen samlekanal [17].
I denne studien evalueres in mammary epitel-cellelinjer om andre reseptorer, som vanligvis er tilstede i melkekjertlene, kunne opprettholde tilsvarende EGFR-lignende aktiviteter og signaltransduksjonsveiene når EGFR-signalisering ble ablateres ved administrering av sterkt spesifikke inhibitorer. Til slutt, vi testet dersom slike kompenserende mekanismer var også til stede i tumorceller isolert fra en godt beskrevet transgen musemodell for ErbB2 melke tumorigenesis.
Resultater
melke Epitelceller Express EGFR og møtte reseptorer og Svar til HGF eller EGF Behandling med Fosforylering av deres respektive reseptorer og Aktivering av ERK1 /2 og AKT Pathways
Vi først analysert uttrykket av EGFR og Met-reseptorer og biokjemisk respons på sine respektive ligander i tre mammary epitelceller linjer av ulik opprinnelse. Alle cellene uttrykte Met og EGFR (Fig. 1a). MCF-10A og NMuMG stimulert med HGF eller EGF i 10 min, viste 30 minutter eller 60 minutter til en økning i fosfo-EGFR, fosfo-Met, fosfo-ERK1 /2 og fosfo-AKT nivåer som gradvis tilbake i nærheten av basalnivåer (Fig . 1B). Lignende data er allerede beskrevet for BME-UV cellelinje [18].
Western-blot analyse av EGFR og Met uttrykk i menneskelig MCF-10A, murine NMuMG og storfe BME-UV mammary epitelceller. Muselever ekstrakt ble anvendt som en positiv kontroll for både Met og EGFR. B. Western-blot-analyse av EGFR, Met, ERK1 /2 og AKT-fosforylering i MCF-10A og NMuMG celler dyrket i serum-sultet medium og behandlet med EGF eller HGF (20 ng /ml) i 10, 30 og 60 min. EGFR, Met, ble ERK1 /2 og AKT brukes til å vise sammenlignbare belastninger mellom banene.
EGFR er nødvendig for levedyktigheten til et delsett med melke epitelceller Lines, mens Met Aktivering er unnværlig
for å teste om EGFR eller Met aktivitet modulere levedyktighet i melkecellelinjer vi brukte svært spesifikke reseptor tyrosin kinase hemmere (RTKi, AG1478 for EGFR og PHA-665 752 for Met) på nanomolare konsentrasjoner. Vi testet først spesifisiteten av disse hemmere ved å stimulere serum-sultet MCF-10A celler med HGF eller EGF sammen med AG1478 eller PHA-665 752 250 nM (Fig. S1). Western blot analyse viste at AG1478 og PHA-665752 inhiberte kun fosforyleringen av henholdsvis EGFR og Met.
Disse inhibitorene ble deretter anvendt i en analyse for å teste levedyktigheten avhengighet av forskjellige brystcellelinjer for Met eller EGFR-signalisering ( fig. 2A). Celler, dyrket i deres respektive vekstmedium, ble behandlet med AG1478 og PHA-665752 (250 nM) og overvåket ved MTT ved 24 og 48 timer. Alle mammary epiteliale cellelinjer var upåvirket av Met inhibitor PHA-665752. EGFR-hemming AG1478, ikke endre BME-UV levedyktighet, mens MCF-10A og NMuMG celleviabiliteten ble sterkt svekket.
MTT analyse av MCF-10A, NMuMG og BME-UV celler ved 0 h, 24 h og 48 timer. Cellene ble dyrket i deres vekst medium (se materialer og metoder) og enten stå ubehandlet (Ctrl) eller behandlet med PHA-665752 (PHA) eller AG1478 (begge 250 nM). MTT verdi på 0 h ble satt til 100%. Kolonner, mener (n = 6); barer, S.E.M. * P 0,01. B. Western-blot-analyse av ERK1 /2 og AKT-fosforylering i brystceller dyrket i sine respektive vekstmedium uten (Ctrl) eller med RTK-inhibitorer (250 nM, 1 h) PHA-665752 (PHA) eller AG1478 (AG). EGFR, Met, ERK1 /2 og AKT ble brukt til å vise sammenlignbare belastninger mellom banene.
For å bestemme mekanismen av levedyktighet blokade mediert av EGFR hemming vi analysert aktiveringstilstand ERK1 /2 og AKT følgende AG1478 eller PHA-665752 behandling i celler dyrket i medium proliferasjon (fig. 2B). I respons til behandling med AG1478, men ikke PHA-665 752, MCF-10A og NMuMG celler viste en reduksjon i både ERK1 /2 og AKT-fosforylering. Etter avtale med manglende evne til hemmere for å redusere levedyktighet, ERK1 /2 og AKT aktiverings statene var uendret under alle forhold i BME-UV celler.
Den HGF-Met Axis Gjenoppretter spredning, overlevelse og morphogenesis i NMuMG og MCF-10A Cells fratatt EGFR aktivitet
Vi neste undersøkt om Met aktiveringen kan redde celler fra veksthemming følgende EGFR hemming. HGF fungerte som en recovery agent i MCF-10A og NMuMG celler behandlet med AG1478 (Fig. 3A). Siden IGF-I, har b-FGF og neuregulin blitt beskrevet som viktige formidlere av mammary utvikling [10], [11], [14] vi testet deres virkning som mulig alternativ utvinning agenter på de samme cellelinjer. Både ikke økte proliferasjon i respons til disse vekstfaktorene følgende AG1478 behandling (Fig. 3A). HGF mediert utvinning i celler behandlet med AG1478 var tydelig som økt sammenløpet i MCF-10A (som vokser som kompakte øyer, Fig. 3B venstre panel) og økt celletetthet i NMuMG celler (som vokser som spredte celler, Fig. 3B høyre panel) .
levedyktig celletall ved trypan-blå eksklusjon flekker på 48 timer av MCF-10A (venstre panel) og NMuMG (høyre panel) celler dyrket i sine respektive vekst medium og behandlet med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), neuregulin 20 ng /ml (N), AG1478 250 nm (A)). Ubehandlet kontroll (Ctrl) ble satt til 100%. Kolonner, mener (n = 6); barer, S.E.M. * P 0,05. B. MCF-10A-celler (venstre paneler; kompositt av 9 felt) og NMuMG celler (høyre paneler) dyrket i sine respektive vekstmedium i 24 timer med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM). Bar = 1000 mikrometer. C. Utvidet død av felt sammensatt bilde oppnådd fra flere Z-stabling bilder av MCF-10A-celler (venstre paneler) og NMuMG celler (høyre paneler) dyrket i kollagen for 4 dager med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml; 250 AG1478 nM). Bar = 500 mikrometer. D. Cell syklus fordelings undersøkt ved propidiumjodidfarging og FACS-analyse av MCF-10A-celler (venstre paneler, 8 h) og NMuMG celler (høyre panel; 16 h) dyrket i vekstmedium og behandlet med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM).
NMuMG og MCF-10A cellelinjer besitte morphogenic evner når resuspendert og dyrket i et 3-D matrise som kollagen [16], [19]. AG1478 hatt en dramatisk effekt på 3D-morfogenese av begge cellelinjer, indusere død av alle celler (Fig. 3C, AG og video S1). HGF var den eneste testet vekstfaktor i stand til å gjenopprette celler fra EGFR inhibering (fig. 3C, AG + HGF og video S2). EGF, IGF-I, b-FGF og neuregulin ikke var i stand til å gjenopprette celledød følgende AG1478 behandling (ikke vist). Møtte spesifisitet til HGF utvinning i MCF-10A og NMuMG celler ble bekreftet ved hjelp av svært spesifikk Met hemmer PHA-665 752 ved 250 nM sammen med AG og HGF. I nærvær av denne RTKi, HGF mistet sin evne til å gjenopprette celler fra bryst EGFR inhibering (fig. S2, A + P + H).
cellesyklus analyse ved FACS viste at EGFR inhibering førte til en økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 fase (figur 3D;. AG). HGF behandling reversert prosentandelen av celler i G0 /G1 fase for å styre verdier (Fig 3D;. AG + HGF).
HGF er en overlevelsesfaktor i brysttumor celler avledet fra et konstitutivt aktiverte ErbB2-transgene mus
Vi testet hvorvidt effektene oppdaget i normale brystceller kan anvendes på celler isolert fra et godt beskrevet modell av mutert-ErbB2-transgene mus (MMTV-neu, [20]). Vi først visualisert, ved western-blot-analyse, tilstedeværelsen av ErbB2, EGFR og Met i brysttumorlysatene oppnådd fra forskjellige mus (Fig. 4A). Primære celler oppnådd fra disse tumorene gikk celledød etter 72 timer behandling med AG1478 (250 nM) mens PHA-665752 (250 nM) hadde ingen effekt (Fig. 4B). For å teste hvorvidt AG1478-indusert celledød kunne utvinnes ved Met-aktivering ble cellene behandlet med AG1478 supplert med HGF. Celleviabilitet tilbakestilt til kontrollverdiene, mens tilskudd av IGF-I, b-FGF og neuregulin hadde ingen effekt (Fig. 4C). Cellesyklusanalyse av propidium-jodid-farging og flyte viste cytometri en økning av celler i G0 /G1 fase etter tilsetning AG1478 (fig. 4D, AG). Etter HGF behandling celler falt til verdier tilsvarende ubehandlede celler (figur 4D,. AG + HGF). For å bekrefte Met bidrag til utvinning mekanisme vi brukte PHA-665752 sammen med AG og HGF. Vi har funnet at i nærvær av Met TKI, HGF mistet sin evne til å gjenopprette ErbB2 tumorceller fra EGFR inaktivering (fig S3A;. A + P + H). For ytterligere å bekrefte spesifisiteten av AG1478, behandlet vi disse cellene med to andre EGFR-hemmere brukes i kliniske protokoller (Iressa og Tarceva, 1 mm). HGF beholdt muligheten til å gjenopprette ErbB2 tumorceller behandlet med Iressa og Tarceva (fig. 4E og S3b fig.). Derfor ErbB2 kreftceller hentet fra denne transgen modell er avhengig aktivert EGFR for vekst og overlevelse, og kan bli reddet av Met aktivering.
Western-blot analyse av ErbB2, EGFR og Met uttrykk i brystsvulster hentet fra tre separate transgene ErbB2-muterte mus (se materialer og metoder). Tubulin ble anvendt som en intern kontroll lasting. B. fasekontrast bilder av primære celler fra ErbB2 brystsvulster (bar = 500 mikrometer). Celler ble dyrket i proliferasjon medium og enten ubehandlet (Ctrl) eller behandlet med AG1478 (250 nM) eller PHA-665752 (250 nM) i 96 timer. C. Levedyktig celletall ved trypan-blå eksklusjon farging etter 48 timer, av udødeliggjorte ErbB2-tumorceller behandlet med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), neuregulin 20 ng /ml (N); AG1478 250 nM (A)). Ubehandlet kontroll (Ctrl) ble satt til 100%. Kolonner, mener (n = 6); barer, S.E.M. * P 0,05. D. Cell syklus fordeling undersøkt ved propidiumjodidfarging og FACS-analyse av ErbB2 mammatumorceller dyrket i vekstmedium og behandlet med de indikerte faktorene for 16 h (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM). E. udødeliggjorte ErbB2-tumorceller dyrket i sine respektive vekstmedium i 48 timer med de angitte faktorer (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM; IRESSA 1 uM; TARCEVA 1 uM). Bar = 500 mikrometer
Met Fosforylering Samtidig Aktiverer ERK1 /2 og AKT når EGFR Signa hemmes. Relative betydningen av de ERK1 /2 og AKT Pathways for spredning og 3D morphogenesis
for å forstå mekanismen av utvinning mediert av HGF, utførte vi western-blot analyse av fosforylert EGFR, Met og deres nedstrøms effektorer ERK1 /2 og AKT (fig. 5A). For dette formål serum-sultet MCF-10A og NMuMG celler ble behandlet med EGF (10 ng /ml), HGF (20 ng /ml) eller IGF-I (100 ng /ml) i fravær eller nærvær av AG1478.
Western-blot-analyse av EGFR, Met, ERK1 /2 og AKT-fosforylering status i MCF-10A og NMuMG celler og ErbB2-tumorceller dyrket i sultende medium i 16 timer og deretter behandlet med RTK-hemmere AG1478 (250 nM , 1 time) før tilsetning av de angitte cytokiner (10 min; EGF 10 ng /ml HGF 10 ng /ml IGF-i 100 ng /ml). B. levedyktig celletall ved trypan-blå eksklusjon flekker på 48 timer av NMuMG celler dyrket i vekstmedium og de indikerte hemmere (AG /A = AG1478 250 nM, UO /U = UO126 15 mikrometer; vørter /W = Wortmannin 100 nM) i nærvær eller fravær av HGF 10 ng /ml (H). Ubehandlet kontroll (Ctrl) ble satt til 100%. %. Kolonner, mener (n = 6); barer, S.E.M. * P 0,05. C. Representative bilder av NMuMG celler dyrket i kollagen gels for 4 dager i vekstmedium med de angitte faktorer (konsentrasjoner som i B, bar = 250 mikrometer).
Alle vekstfaktorer aktivert både ERK1 /2 og AKT baner i fravær av EGFR inhibering (fig. 5A, sporene 3, 5, 7). Etter AG1478 behandlingen, forble HGF det eneste cytokinet i stand til å opprettholde begge veier aktive samtidig, i overensstemmelse med det faktum at fosfo-Met er fortsatt til stede i inhiberte celler EGFR (fig. 5A, spor 6). Selv om IGF-I-aktiverte fosfo-AKT nivåene var upåvirket av AG1478, ble fosfor-ERK1 /2 plan avskaffet av EGFR hemming (Fig 5A, lane 8, jf. Omtale). Derfor HGF-mediert redning av spredning og morphogenesis i brystceller muligens trenger samtidig reaktivering av både ERK1 /2 og AKT veier.
I likhet western blot analyser utført på serum sultet ErbB2 tumorceller viste basal fosfor-EGFR, fosfo-ERK1 /2 og fosfo-AKT nivåer som ble opphevet ved behandling AG1478. Analogt med normale brystceller, HGF bare hadde evnen til å gjenopprette samtidig ERK1 /2 og AKT-fosforylering i nærvær av EGFR-inhibering. Således ErbB2-drevet tumorceller muligens bruke en mekanisme for utvinning sammenlignbar med den som finnes i ikke ondartet NMuMG og MCF-10A-celler (Fig. 5A, ErbB2). For ytterligere å bekrefte spesifisiteten av AG1478, ble western-blot eksperimenter gjentas med Iressa (1 mm) i NMuMG og ErbB2-drevet celler, med sammenlignbare resultater (Fig. S4A).
Siden EGFR og Met synes å handle gjennom lignende nedstrøms effektorer, testet vi om EGF og HGF samtidig behandling kan øke melkeceller vekst, scatter og morphogenesis. Celler behandlet samtidig med de to cytokiner vises en økning i samløpet prosent (MCF-10A legemer, Video S3 og S4B fig.), Scatter og morphogenesis (NMuMG celler, figur S4C). Forhold til EGF bare eller HGF bare behandlede celler
Vi endelig analysert den relative betydningen av de ERK1 /2 og AKT trasé under spredning og morphogenesis i EGFR hemmet brystceller (fig. 5B). For dette formålet vi selektivt hemmet ERK1 /2 og /eller AKT trasé med UO126 15 mikrometer og Wortmannin 100 nM hhv. Slike inhibitorer ble koblet med AG1478 behandling for å forstå hvorvidt HGF beholdt evnen til å gjenopprette vekst i bryst celler som mangler disse banene. Inhibering av ERK1 /2 og PI3K-AKT veier, hver for seg og sammen med EGFR blokade, føre til en reduksjon i celleviabilitet. Interessant nok under alle hemmende forhold, økt HGF celletall, om enn med forskjellige virkningsgrader i henhold til behandling. Denne oppførsel indikerer at i fravær av en hvilken som helst kombinasjon av EGFR /ERK1-2 /AKT signalering, Met fortsatt øker proliferasjon i 2D dyrkede celler (Fig. 5B øvre panel og fig. S5) sannsynligvis aktivering av alternative signalveier.
En analyse utført på NMuMG celler dyrket i 3D-kollagen suspensjoner ga oss forskjellige resultater, og viste at ERK1 /2 signal var alltid nødvendig for å opprettholde levedyktighet (figur 5B nedre panel.): HGF tilskudd kan ikke gjenopprette levedyktighet i UO126 behandlede celler (UO ; UO + HGF; AG + UO; AG + UO + HGF). På den annen side, inhibering av PI3K-AKT-signalveien stoppet ductal forlengelse, men ikke dreper-celler (vørter). HGF tillegg restaurert vekst og morphogenesis (Surt + HGF) i Wortmannin behandlede celler. Interessant, når EGFR hemmet celler ble samtidig behandlet med Wortmannin, HGF kan ikke opptre som en gjenopprettingsagent (AG + Wort og A + W + HGF). Disse data indikerer at i fravær av EGFR signalerer ERK1 /2 og PI3K-AKT banene er begge uavhengig er nødvendig for vekst i en tre-dimensjonal matrise, men ikke i en 2D-proliferasjonsanalyse.
diskusjon
Organ vekst, homeostase av normalt vev og kreftutvikling kan dele felles biologiske veier. I denne studien har vi adressert forholdet mellom EGFR og Met signalveier i normale bryst epitelceller samt i celler avledet fra et godt beskrevet transgen modell av mammary tumorigenesis. Vi har funnet at to av tre testet mammary epiteliale cellelinjer, det murine NMuMG og de humane MCF-10A cellelinjer, er avhengig av EGFR-aktivitet for å vokse i et 2D-proliferasjonsanalyse og å overleve i et 3D-morfogenese analysen. En grunnleggende rolle for EGF-reseptoren i brystkjertelen morfogenese er blitt funnet i løpet av prepubertale vekst i stromal rommet av dette organ [5], [21], men, som nå, er det ingen kjent funksjon for denne reseptoren i epiteliale rommet av den voksne melkekjertler. Her beskrev vi at EGFR er fundamental for vekst og levedyktighet i spesifikke ikke-tumorigene brystcellelinjer som er innhentet fra voksne brystvevet. Nedskrivning av EGFR, men ikke møtt signalering i disse cellelinjene forstyrret morphogenesis og indusert komplett celledød. MCF-10A avhengighet av EGFR kan skyldes at disse cellene blir dyrket i et medium inneholdende EGF. En mulig forklaring for EGFR avhengighet i NMuMG celler er at denne cellelinjen produserer sin egen EGFR-ligander. Faktisk fant vi høye nivåer av amfiregulin mRNA uttrykk i NMuMG celler (data ikke vist) muligens kjører spredning av en autokrin loop. Andre mammary epitelceller har vist seg å produsere og frigjøre EGFR-ligander [22], derfor er denne mekanisme av veksten kan være felles for epitelceller, selv i den voksne melkekjertler. Det faktum at BME-UV bovine melke celler ikke svare på EGFR-inhibering er sannsynligvis på grunn av det faktum at denne cellelinjen opprettholder ERK1 /2 og AKT trasé aktive henhold AG1478 behandling. En mulig forklaring er at under prosessen med immortalisering, inaktivering av viktige tumorbeskyttelse (liker PTEN) har brakt BME-UV-celler til konstitutivt aktivere disse grunnleggende signalveier. En annen spekulativ hypotese er at i storfe, som ikke er utsatt for å utvikle melke kreft, disse banene har konstitutivt høyere fosforylering nivåer selv i ikke-tumorigene cellelinjer. Forskjellen i EGFR følsomhet funnet i cellelinjer, stiller spørsmålet om noen melke celler som tilhører ulike avdelinger av kjertelen (f.eks basal eller luminal) kan ha ulike krav til vekst. Utvide vår forskning med andre brystcellelinjer av ulik opprinnelse kan avklare denne tvilen. Dette faktum er også viktig fordi tumorer som oppstår fra celler av en spesiell avdeling kan vise forskjellige responser til spesifikke inhibitorer.
Selv Met var unnværlig for vekst i alle testede cellelinjer, HGF var det eneste cytokinet stand til å gjenopprette proliferasjon og morphogenesis i EGFR hemmet celler. Noen forfattere har beskrevet en direkte rolle for HGF i melkekjertlene [23], [24], men komplett data som avklare rollen som møtte reseptor spiller
in vivo
er fortsatt mangelfull. Vårt laboratorium vurderer for tiden rollen Met av genet målretting med melke spesifikke arrangører (MMTV-Grobunn og Wap-Grobunn), men sammenhengende med
in vitro
data her er presentert, har vi ennå ikke funnet en rolle for HGF-reseptoren i disse transgene modeller (manuskript under forberedelse). Interessant, andre vekstfaktorer (IGF-I, b-FGF og neuregulin), som har blitt beskrevet som viktige formidlere av melke morfogenese [10] – [14], [25], ikke var i stand til å fungere som gjenopprettingsmidler i disse cellene. Vi kan ikke utelukke at disse faktorene kan spille en viktig rolle i celler avledet fra forskjellige melkekjertlene subpopulasjoner eller brystkreft. Nyere funn viser at EGFR kan spille en betydelig rolle i noen HGF /Met medierte biologiske reaksjoner fra brysttumor og epitelceller. I dette system inhibering av EGFR kinase med gefitinib eller erlotinib opphevet HGF indusert proliferasjon og motilitet av enkelte carcinoma celler [26]. Tvert imot i våre eksperimentelle innstillinger Met var i stand til å opptre som en bedring middel i inhiberte celler EGFR og fosfo-Met og fosfo-EGFR så ut til å bli aktivert, i det minste delvis, separat. Selv om vi ikke kan utelukke en viss grad av Met-EGFR trans i systemet vårt, er det meste av nedstrøms signal fremkalt av en uavhengig, EGFR-drevet eller Met-drevet mekanisme. Forskjellen i resultatene kan avhenge av de forskjellige cellelinjer som der anvendes eller deres kultur tilstand (vi alltid brukt komplett vekstmedium med serum og vekstfaktorer for de fleste av forsøkene). Dette resultatet indikerer hvor to konkrete stier som stammer fra forskjellige reseptorer kan drive tilsvarende cellulære responser (f.eks levedyktighet eller spredning) uavhengig av hverandre.
Vi har også funnet at synkron aktivering av EGFR og Met økt vekst, scatter og morphogenesis i NMuMG og MCF-10A celler. Denne effekten, hvor to separate tyrosine kinase reseptorer kan opptre i en overflødig og additiv måte å fremme cellevekst, er ikke unikt for brystceller.
In vivo
under nyre morphogenesis, Met vev spesifikke knock-outs har redusert endelige nevronet nummer. Kryssing disse musene med viftet-2 spontane mutanter, bærer et enkelt punkt mutasjon som reduserer EGFR kinase aktivitet, påvirker ureter knopp forgrening samt endelig glomerulær nummer [17]. Vi har nylig viste at en lignende mekanisme av EGFR /Met redundans skjer også i melkekjertlene [27].
ErbB2 er en viktig initiativtaker til melke tumorigenesis med mer enn 30% menneskelig brystkreft utstilling ErbB2 forsterkning og overekspresjon [ ,,,0],28]. EGFR er ofte en dimerisering partner for ErbB2 både fysiologisk, under brystkjertel utvikling [13], [29], og patologisk i ErbB2 drevet tumorer [30]. Vi evaluerte således virkningene av EGFR inaktivering i en brønn er beskrevet transgen modell av mammary tumorigenesis. Dette transgen linje uttrykker en MMTV-promoter-drevet rotte-ErbB2 som bærer en mutasjon som tvinger konstitutiv aktivering av reseptoren [20]. Alle svulster hentet fra ErbB2 muterte musene viste EGFR, ErbB2 og Met uttrykk. EGFR inhibering forårsaket død av primære og udødeliggjorte celler isolert fra denne tumor. Siden inhibering av EGFR AG1478 ved den konsentrasjon som brukes i våre analyser er selektiv (IC50 3 nM; ErbB2 IC50 er 100 uM) ErbB2-mutasjonen muligens aktiverer EGFR gjennom hetero-dimerisering. Faktisk ble det observert en reduksjon av både fosfo-EGFR og fosfo-ErbB2 (ikke vist) i ErbB2-tumorceller ved behandling med AG1478. Derfor har vi funnet at i denne transgene modell, er ErbB2 aktivering som driver tumorvekst koplet til EGFR kinase-aktivitet, som er grunnleggende for cellenes levedyktighet. HGF behandling reddet EGFR hemmet tumorceller, noe som indikerer at trasé som ligner de som er tilstede i NMuMG og MCF-10A mammary celler kan også brukes av kreftceller til å opprettholde sin vekst. Det faktum at tumorceller svare på HGF med økt proliferasjon og overlevelse etter EGFR-inhibering er også blitt omtalt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). En undergruppe av NSCLC pasienter som utvikler resistens mot EGFR-hemmere viser økt HGF nivåer støtter en rolle for stromal avledet HGF i å fremme resistens [31], [32]. Denne type motstand, der normale reseptor nivåer er ledsaget av en høyere ekspresjon av dens respektive vekstfaktor i det omkringliggende stroma, kan således representere en mekanisme som brukes av tumorceller å unnslippe RTKi behandling. Våre funn på HGF-mediert utvinning, utvide tidligere publiserte resultatene til mammary epitelceller og ErbB2 brystsvulstceller, understreker det faktum at molekylære hendelser stede i ikke tumorigene celler kan beholdes under tumorvekst og bli grunnlag for legemiddelresistens.
en av de mulige mekanismene bak brystcelle utvinning av HGF behandling etter EGFR inaktivering ble evnen til dette cytokinet for å aktivere både de ERK1 /2 og den AKT veier. Dermed har vi undersøkt den relative betydning av disse to baner i å drive motstanden mot EGFR inhibering. Våre resultater viser at HGF var det eneste cytokinet med kapasitet til å aktivere ERK1 /2, og de AKT veier uavhengig av EGFR-signalisering. Bekrefter de observasjoner gjort av andre forfattere [33] – [35], som viste at knockdown eller blokade av EGFR blokkerte IGF-I-indusert MAPK (noe som tyder på at IGF-I-reseptor kan opptre oppstrøms for EGFR) har vi funnet at IGF-I ikke kunne redde ERK1 /2 pathway, men kunne redde AKT-reaksjonsveien i alle EGFR hemmet cellelinjer. I tråd med sin manglende evne til å redde EGFR hemmet celler, basic-FGF var ute av stand til å aktivere verken ERK1 /2 heller PI3K-AKT sti i NMuMG og MCF-10A cellelinjer (data ikke vist). Videre har begge disse cellelinjene ikke økte proliferasjon følgende b-FGF eller neuregulin behandling.
