Abstract
Bakgrunn
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen og den tredje vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Sorafenib er det eneste legemiddel for pasienter med fremskreden fase hepatocellulært karsinom (HCC) som har vist seg å gi en overlevelsesfordel for pasienter med HCC; Men, den har mange bivirkninger. Derfor bør alternative behandlingsstrategier med forbedret sikkerhet og terapeutisk effekt for forvaltningen av HCC utvikles.
Metoder og funn
Vi viser at et ekstrakt av
Graptopetalum paraguayense product: ( GP) nedregulert uttrykket nivåer av flere Onco-proteiner, inkludert AURKA, AURKB, og FLJ10540, i HCC celler. For å isolere de aktive komponentene i GP ekstrakter, vi forberedt ekstrakter fraksjoner og vurdert deres virkninger på uttrykk for Onco-proteiner i HCC celler. Fraksjonen betegnet HH-F3 var anriket på aktive ingredienser, oppviste cytotoksiske effekter, og undertrykket ekspresjon av onco-proteiner i HCC celler. Strukturen av de viktigste aktive forbindelse i HH-F3 ble funnet å være lik den for den mengde av de frie forbindelser avledet fra
Rosenrot
. I tillegg ble en distinkt nytt sammensatt rik på 3, 4, 5-Trihydroxy benzyliske delene identifisert i HH-F3 forberedelser. Mekanistiske undersøkelser indikerte at HH-F3 indusert apoptose i HCC celler ved å fremme tap av mitokondriemembranpotensialet og produksjon av reaktive oksygenarter. HH-F3 også forbedret PTEN ekspresjon og redusert AKT-fosforylering ved Ser473 på en konsentrasjonsavhengig måte i HCC celler. Videre kombinasjon av GP eller HH-F3 og sorafenib synergi hemmer spredning av Huh7 celler. Behandlingen av en rottemodell med diethylnitrosamine (DEN) indusert leverkreft med ekstrakter av GP og HH-F3 nedsatt leverkollageninnhold og hemmet tumorvekst.
Konklusjoner
Disse resultatene indikerer at GP ekstrakter og HH-F3 kan beskytte leveren ved å undertrykke tumorvekst; Følgelig kan disse forbindelsene bli vurdert for behandlingen av HCC
relasjon:. Hsu W-H, Chang C-C, Huang K-W, Chen Y-C, Hsu S-L, Wu L-C, et al. (2015) Evaluering av medisinsk urt
Graptopetalum paraguayense
som en behandling for leverkreft. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10,1371 /journal.pone.0121298
Academic Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, TAIWAN
mottatt: 19 august 2014; Godkjent: 29 januar 2015; Publisert: 07.04.2015
Copyright: © 2015 Hsu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Taiwan National Science Council etter tilskudds tall NSC102-2627-B-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001, og MOST103-2627-B-030-001-; Taiwan Ministry of Economic Affairs gi tall 99-EC-17-A-S1-152, 100-EC-17-A-S1-152, og 101-EC-17-A-S1-152); og av en bevilgning fra Kunnskapsdepartementet, Sikt på toppen Universitetet Plan (103AC-T503). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Alkoholisme, viral hepatitt og alkoholisk steatohepatitis er de tre viktigste årsakene til kronisk leverbetennelse og skader. Kronisk leverinflammasjon kan lede til leverfibrose, cirrhose og hepatocellulært karsinom (HCC), som er den vanligste form for leverkreft og utgjør 70% til 85% av primære lever maligniteter hos voksne. Mer enn 80% av pasienter med HCC blir diagnostisert på et avansert stadium av sykdom ved hvilken kirurgisk behandling ikke lenger er indikert. Generelt er pasienter med inoperabel HCC har en dårlig prognose og sjelden benytte seg av ikke-kirurgiske behandlinger som systematisk kjemoterapi eller chemoembolization [1, 2].
Unormal signalering i PI3K /PTEN /AKT sti bidrar til utvikling av en rekke leversykdommer, inkludert ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD), alkoholfrie steatohepatitis (NASH), alkoholisk leversykdom (ALD), viral hepatitt og HCC [3]. Den PI3K /PTEN /AKT-reaksjonsveien aktiveres ved epigenetisk undertrykkelse av PTEN og /eller mutasjoner i eller forsterkning av de enkelte komponenter i reaksjonsveien i omtrent 40-50% av pasienter med HCC [4-6]. Eksperimentelt, sletting av PTEN eller overekspresjon av AKT i leveren hos mus resulterer i steatose og tumorutvikling [7, 8]. Disse eksperimentelle observasjonene tyder sterkt på at den PI3K /PTEN /AKT pathway spiller en viktig rolle i hepatotumorigenesis.
Sorafenib, en multi-target kinase inhibitor som ble godkjent for behandling av HCC i 2007 [9], er det bare standard kjemoterapeutiske legemiddel for pasienter med fremskredet stadium HCC [10]. Dette stoffet har blitt vist å hemme tumorcelleformering ved å blokkere Ras /Raf /MAPK-reaksjonsveien og angiogenese ved å blokkere både VEGFR og PDGFR signalering, og dermed bremse veksten av nye blodkar i tumoren [11]. I en dobbeltblind, randomisert, kontrollert klinisk studie (RCT) med et primært endepunkt total overlevelse [12], sorafenib økt overlevelse av HCC pasienter fra 7,9 til 10,7 måneder [13]. Sorafenib er det eneste stoff som har vist seg å gi en overlevelsesfordel for pasienter med HCC; Men, den har mange bivirkninger. Foreløpig behandlingstilbud for pasienter med avansert HCC er begrenset. Derfor bør alternative behandlingsstrategier med forbedret sikkerhet og terapeutisk effekt for forvaltningen av HCC utvikles.
Herbal medisiner har vært brukt i tusenvis av år å behandle en rekke sykdommer, inkludert inflammatoriske sykdommer og kroniske leversykdommer (inkludert hepatitt, leverfibrose og HCC). I denne studien har vi fokusert på
Graptopetalum paraguayense plakater (GP), en tradisjonell kinesisk urt som besitter flere helsemessige fordeler. Ifølge sin arkaiske kinesisk resept, er GP i stand til å lindre leversykdom, lavere blodtrykk, bleke hud, lindrer smerte, behandling av infeksjoner, hemmer betennelser og forbedre hjernens funksjon [14-16].
In vitro
studier har vist at ekstrakter fra bladene av GP hemmer tyrosinase og angiotensin converting enzyme og bekjemper frie radikaler [14-16]. Ekstrakter fra stammen av GP dyrket med celler fra den humane HCC HepG2-cellelinje er også blitt vist å utvise antioksidant og anti-proliferative egenskapene [17]. Vannbaserte ekstrakter av GP har også vist seg å ha antioksidative og anti-inflammatoriske egenskaper som beskytter celler fra CCl
4-indusert oksidative skader på leveren [18]. Data fra vår forrige microarray profilering studie viste at uttrykket av ulike gener relatert til metabolisme, cellevekst og /eller vedlikehold ble restaurert til nær normale nivåer i DMN-behandlede rotter behandlet med GP [19]. Vår tidligere studie viste også at administrasjonen av GP reduseres kjemisk indusert leverskade og fibrose
in vivo Hotell og undertrykte leverstel celle (HSC) og Kupffer celle aktivering
in vitro
.
De ovennevnte funnene tyder på at GP kan representere et terapeutisk alternativ for behandling av leverbetennelse og fibrose [20]. I denne studien viser vi at GP og dens HH-F3 fraksjon har anti-kreft effekt i rottemodellen av diethylnitrosamine (DEN) indusert leverkreft. Vi senere viser at ekstrakter av GP og HH-F3 indusere apoptotisk celledød i HCC celler, noe som tyder på at GP og HH-F3 kan anvendes for forebygging eller behandling av HCC.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Huh7 og PLC5 cellelinjer ble oppnådd fra Dr. Zhong-Zhe Lin, National Taiwan University Hospital, Taiwan. HepG2-cellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, https://www.atcc.org/en.aspx). Mahlavu cellelinjer ble gitt av Dr. Muh-Hwa Yang, Institutt for klinisk medisin, National Yang Ming University, Taiwan. Menneskelig hepatocytter ble kjøpt fra ScienCell Research Laboratories (https://www.sciencellonline.com/~~number=plural).
GP og
Rhodiola rosea
ekstraksjon, rensing og karakterisering
GP blader ble malt og lyofilisert til et pulver ved -20 ° C og lagret i en fuktighets buster ved 25 ° C før ekstraksjon. Først ble 1,5 g av GP pulver vortex-blandet med 10 ml 100% metanol (MeOH) i 5 minutter og sentrifugert ved 1500
g
i 5 min. Supernatanten ble fjernet og forskjellige ekstrakter ble fremstilt ved å re-suspendering av pelletene i 10 ml H
2O, 100% aceton, 100% metanol, 100% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 100% DMSO eller 30 % DMSO. Suspensjonen ble vortex-blandet i 5 minutter, sentrifugert to ganger ved 1500
g
i 5 minutter, sentrifugert igjen ved 9300
g
i 5 minutter og filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter i en laminær strømningshette ved romtemperatur. Den 30% DMSO supernatant ble enten lagret ved -20 ° C som en 150 mg /ml stamoppløsning (referert til som 30% DMSO GP ekstrakter) eller fraksjonert i fire fraksjoner (F1-F4) ved hjelp av en Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige) kolonne (metode I). For å forenkle utarbeidelsen protokoller, ble direkte dialyse av 30% DMSO GP ekstrakter mot vann også gjennomført (metode II). Kolorimetriske analyser på 30% DMSO GP ekstrakter for identifisering av hydro og kondensert tanniner ble utført [21]. HCC celler ble behandlet med ekstrakter og AURKA, AURKB og FLJ10540 proteinnivåer ble analysert ved Western blot; aktive molekyler i F3 fraksjonen (referert til som HH-F3 fraksjon) ble identifisert. HH-F3-fraksjonen ble ytterligere analysert ved HPLC med en UV-detektor (Shimadzu SPD-M10A), en normalfase-HPLC-kolonne (Phenomenex Luna 5u Silica (2) 100A, 4,6 x 250 mm) og
1H og
13C-NMR-spektra for å identifisere strukturen av de aktive molekyler. GP ekstrakter og den HH-F3 fraksjon ble også underkastet dialyse mot vann ved anvendelse av en dialysemembran (MWCO 12-14,000) (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) for å oppnå aktive forbindelser.
Rosenrot
Plantene ble frysetørket til et pulver og lagret i en fuktighets buster ved 25 ° C før ekstraksjon. En 1,5 g prøve av
Rosenrot
pulver ble oppløst i 10 ml H
2o, sentrifugert ved 1500
g
i 5 minutter og filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter i den laminære strømningshette ved romtemperatur. Prøvene ble lagret ved -20 ° C mens 150 mg /ml stamløsninger.
Western blot
lysater av HCC celler ble underkastet SDS-PAGE for å løse de uttrykte proteiner og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner ved anvendelse av en Bio-Rad overføringssystem. Etter overføring ble membranene farget med Ponceau S for å bekrefte effektiviteten og jevnheten av proteinet overføringen. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig skummetmelk ved romtemperatur i 30 minutter og inkubert med det primære antistoff ved 4 ° C over natten. Deretter ble membranene vasket tre ganger (10 min hver) med 1 x Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween-20 (TBST) og inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 2 timer. HRP-substrat peroksydløsning /luminol reagenser (Immobilon vestlige Chemiluminescent Substrate, Millipore, blandet i 1: 1 forhold) ble tilsatt, og det sekundære antistoff signalene på membranene ble gjort synlige med en Fujifilm LAS4000 luminescerende bildeanalysesystem. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-PTEN, anti-AKT, anti-P70S6K, anti-caspase 3 og anti-PARP (Cell Signaling); anti-BCL2, anti-BCL-XL og anti-caspase 9 (GeneTex); anti-AURKA og anti-AURKB (BD Biosciences); og anti-FLJ10540 (Abnova). Alle antistoffer ble anvendt ved en fortynning på 1:. 1000
Levedyktighet assay
Cellene ble sådd ut i 24-brønners plater (4,000-5,000 celler /brønn) over natten og deretter behandlet med den 30% DMSO GP ekstrakter eller HH-F3 brøkdel for 0, 24, 48 eller 72 timer. Etter behandling ble cellene forsiktig vasket 3 ganger med 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4, 2 mM KH
2PO
4) og deretter inkubert med 0,5 ug /ml 3- (4,5-cimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma-Aldrich) i 2 timer. Mediet ble fjernet, og den dyp-blå krystaller ble oppløst i 100% DMSO ved romtemperatur i 10 minutter. OD-verdier ble målt ved 570 nm med en ELISA-leser.
Cell telle
Cellene ble sådd ut i 12-brønners plater (10.000-20.000 celler /brønn) og inkubert over natten. Neste dag ble cellene behandlet med HH-F3 brøkdel for 0, 24, 48 eller 72 timer. Cellene ble så trypsinert, behandlet med 0,4% trypanblått og tellet.
cellesyklusanalyse og flowcytometri
Etter at cellene var blitt trypsinisert og vasket tre ganger med PBS, ble de sentrifugert ved 800
g
i 5 min. Cellene ble deretter resuspendert i 70% etanol i PBS og oppbevart ved -20 ° C i mer enn 16 timer. Cellene ble sentrifugert ved 800
g
i 5 min, og cellepelletene ble resuspendert i kald PBS inneholdende 100 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) i 20 minutter. Cellene ble deretter farget med 20 ug /ml propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich) i 20-30 min, og DNA-innhold ble målt og analysert ved hjelp av en BD FACSCanto og Flow Jo analyseprogramvare, respektivt.
mitokondriell membranpotensialet analysen
mitokondriemembranpotensiale ble analysert ved hjelp av 5, 5 «, 6, 6′-tetraklor-l, 1′, 3, 3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1) som er kjøpt fra Cayman Chemical Co. de dyrkede celler ble sådd i 96-brønners sorte plater ved en densitet på 7000 celler /brønn, inkubert over natten og ble behandlet med eller uten HH-F3 fraksjon i 48 timer. JC-1-farging oppløsning ble tilsatt til hver brønn og blandet forsiktig ved 37 ° C i 15-30 min i mørket. Platene ble sentrifugert ved 400
g
ved værelsestemperatur i 5 min, og supernatanten ble fjernet fra hver brønn. JC-1 analysebuffer ble tilsatt til hver brønn, ble platene sentrifugert i 5 minutter ved 400
g
ved romtemperatur og supernatanten ble fjernet fra hver brønn. Til slutt ble JC-1 analysebuffer tilsatt til hver brønn, og platene ble analysert ved bruk av en fluorescerende plateleser.
Måling av ROS-nivåer
intracellulære generering av superoksidradikaler (O
2
-) ble vurdert ved hydroethidine fluorescens (AAT Bioquest, Inc.). Cellene ble behandlet med eller uten HH-F3 fraksjon i 48 timer. Hydroethidine (10 uM) ble tilsatt til hver brønn og blandet forsiktig i 30-60 min ved 37 ° C i mørket. Cellulær fluorescens ble overvåket ved en eksitasjonsbølgelengde på 520 nm og en emisjonsbølgelengde på 610 nm. Intracellulære peroxide nivåene ble målt ved hjelp dichlorofluorescein (DCFH) diacetate (markørgenet Technologies, Inc.). Etter at cellene var blitt behandlet med den HH-F3 fraksjon i 48 timer, ble mediet aspirert og cellene ble vasket to ganger med PBS. Cellene ble deretter inkubert med DCFH ved en sluttkonsentrasjon på 20 uM i serumfritt medium i 30-60 minutter ved 37 ° C i mørke, vasket på ny med PBS og opprettholdt i 200 ul kulturmedium. Cellular fluorescens ble overvåket på en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en emisjon bølgelengde på 528 nm.
Dyr, den eksperimentelle miljøet, og protokoll
Animal Care og bruk komité College of Medicine , National Taiwan University, godkjent alle eksperimentelle protokoller. Alle forsøkene ble gjennomført i henhold til retningslinjene fra universitetet dyr omsorg.
Ett hundre og tjue seks uker gamle Wistar hannalbinorotter (150-180 g) ble brukt. Alle dyr fikk akklimatiseres i syv dager, og gitt standard Chow og vann
ad libitum
i løpet av forsøksperioden.
Rottene ble tilfeldig inndelt i normalgruppen (n = 10), den diethylnitrosamine (dEN) gruppe (N = 30), lav-dose GP gruppe (N = 30) eller høy-dose GP gruppe (N = 30). ytterligere fem rotter ble inkludert i HH-F3-behandlede gruppen. For alle grupper bortsett fra den normale gruppen, den eneste kilden til drikkevann for 63 dager ble en vandig løsning av 100 ppm (volum /volum) DEN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) som ble endret daglig; med start på dag 64 ble rottene forsynt med vann fra springen i ytterligere 14 dager. Den DEN oppløsning ble fremstilt hver uke, og besto av en individuell dose beregnes ut fra vektøkningen /tapet opplevd av dyret som svar på den tidligere dose. Leversvulster ble observert med start på dag 42, og leverfibrose ble observert fra og med dag 63. I løpet av forsøksperioden ble dyrene veiet ukentlig for å beregne vektøkningen; I tillegg ble mengden av vann som forbrukes av rottene målt hver uke. Rottene i lavdose gruppe fikk 0,6 g /rotte av frysetørket pulver GP; rottene i høydose gruppen fikk 1,8 g /rotte av frysetørket GP pulver; rottene i HH-F3 gruppen fikk 0,036 g /rotte av frysetørket HH-F3 pulver hver dag i tre uker begynner på dag 42.
Innhøsting prosedyre og morfologiske evaluering av leveren
All dyrene ble avlivet på dag 84. dyrene ble fastet over natten og avlivet ved CO
2 innånding. Etter rottene hadde blitt ofret, ble deres organer, lever og milt veies; en midtlinjen laparotomi ble utført og betingelsene for organene ble registrert ved obduksjon. Alle fliker av leveren ble umiddelbart høstet og grundig undersøkt for å beskrive den overflate av leveren og for å karakterisere utviklingen av lever foci, vedvarende knuter (PNS) eller kreft ved hvert tidspunkt. Deretter ble leveren kuttet i 5 mm seksjoner. Alle makroskopisk synlige knuter på leveren overflaten og i 5 mm seksjoner ble talt opp og måles.
Tumor byrde vurdering
Å etablere løpet av tumorutvikling i dyrene utsettes for DEN, alle fliker av leveren ble straks høstet, og alle makroskopisk synlige knuter på leveren overflaten og i 5 mm seksjoner ble talt opp og måles. Levertumorbelastninger ble bestemt ved å beregne summen av volumene av alle tumorknuter som er større enn 3 mm i diameter for hvert dyr; tumor byrder ble så sammenlignet blant gruppene.
Bile strømningshastighet
før avlivning, ble dyrene bedøvet med 80 mg /kg ketamin og gallen Strømningshastigheten ble målt med et PE10 silisium-rør som er lagt inn i den felles gallegang og koblet til en beregnet polyetylenrør. Galle flyte inn i røret ble målt ved 5-minutters intervaller.
Histopatologisk evaluering
Etter at blodet var blitt drenert, 5 mm tykke skiver som inneholdt vev tumorer ble dissekert fra hver flik av lever. Seksjoner (5 mikrometer) ble kuttet og farget med hematoxylin og eosin for histopatologisk analyse ved hjelp av publisert diagnostiske kriterier.
Immunhistokjemisk farging for α-glatt muskel aktin (α-SMA)
prøver Leveren var fast med formalin, innstøpt i parafin og delt inn i 5-mikrometer seksjoner. Seksjonene ble deparaffinized, rehydrert og behandlet med 0,03% hydrogenperoksyd i 10 min for å slukke endogen peroksidaseaktivitet. Etter to vaskinger med PBS, ble seksjonene inkubert i 1 time ved romtemperatur med et muse-anti-human α-SMA-monoklonalt antistoff (1:50 fortynning, Dako Cytomation, Danmark). For α-SMA-farging, ble seksjonene vasket og inkubert med et sekundært kanin anti-mus IgG-antistoff (1: 200 fortynning) ved romtemperatur i 1 time. Seksjonene ble deretter fremkalt på samme måte. Etter farging ble seksjonene kontra med hematoksylin for mikroskopi analyser. Prosentandelen av α-SMA-positive områder (mm
2 /cm
2 av leveren avsnitt) ble bestemt ved hjelp av en HC-2500 digitalkamerasystem (Fuji Photo Film), Adobe Photoshop versjon 5.0J og bilde-Pro pluss versjon 3.0.1J
analyse for hydroksyprolininnhold i leveren
lever~~POS=TRUNC prøver ble veiet, og 20 mg av de frosne prøvene ble hydrolysert i 20 ml 6 N HCl og nøye bakken.; 6 N HCl ble deretter tilsatt for å oppnå et samlet volum på 30 ml /mg vev. Bakken vev ble hydrolysert ved 120 ° C i 16 timer. Etter en kort periode med avkjøling på is og sentrifugering ved 8000
g
i 10 minutter, supernatanten ble fjernet og plassert i et nytt rør; volumet tapt til fordampning ble etterfylles med vann. Et like stort volum av 6 N NaOH ble tilsatt og blandet, og pH i løsningen ble justert til pH 4-9 ved hjelp av lakmuspapir. Førti mikroliter av det nøytraliserte prøveoppløsning ble tilsatt til brønnene i en 96-brønns ELISA-plate og oksydert ved anvendelse av en oppløsning inneholdende 5 ml 7% kloramin T (Sigma-Aldrich) og 20 ml acetat /citratbuffer. Ett hundre og femti milliliter Ehrlich «s oppløsning ble tilsatt. Den endelige blandingen ble inkubert ved 60 ° C i 35 min og ved romtemperatur i 10 min; absorbansen ble deretter bestemt ved 560 nm. Standardoppløsninger inneholdende 100, 80, 60, 40, 20, 0 mg /ml av autentisk 4-hydroksy-L-prolin (Sigma-Aldrich) ble behandlet på en lignende måte. Standardkurven var lineær i dette område av konsentrasjoner (
r
= 0,99). Den hepatiske hydroksyprolin nivået ble uttrykt som mg av hydroksyprolin /g våt levervekt. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Statistisk analyse
Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. Nivåer av betydning ble evaluert av to-tailed paret Student
t
-test eller enveis variansanalyse (ANOVA).
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
De anti-proliferative effekter av ulike GP forberedelser på Huh7 og Mahlavu celler
For å teste potensialet biologiske effekter av GP, ulike GP ekstraktene ble fremstilt ved anvendelse av vann, butanol, aceton, metanol, 100% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 100% DMSO eller 30% DMSO, og brukes til å behandle humane HCC celler. Veksthemmingen induseres av de forskjellige GP ekstraktene ble undersøkt. Data fra MTT-analyser viste at 30% DMSO ekstrakter betydelig redusert levedyktighet Huh7 og Mahlavu celler (fig 1A); mer spesifikt, konsentrasjoner på 500 og 250 ug /ml resulterte i 50% inhibering av cellelevedyktighet (IC
50) 72 timer etter behandling for Huh7 og Mahlavu celler, respektivt (figur 1B).
Huh7 og Mahlavu celler ble behandlet med GP ekstrakter fremstilt i vann, butanol, aceton, metanol, 100% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 100% DMSO, eller 30% DMSO ved konsentrasjoner på 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 og 1500 ug /ml i 72 timer. Levedyktigheten av de behandlede celler ble bestemt ved hjelp av MTT-analyser. De 30% DMSO GP ekstrakter ble forbundet med størst hemming av vekst av Huh7 og Mahlavu celler etter 72 timer. (B) Huh7 og Mahlavu celler ble behandlet med konsentrasjoner på 0, 250, 500, 750 og 1000 ug /ml av 30% DMSO GP ekstrakter for 24, 48 og 72 timer, og MTT-analyser ble utført. IC
50 konsentrasjoner av 30% DMSO GP ekstrakter for veksthemming av Huh7 og Mahlavu celler var omtrent 500 og 250 ug /ml, henholdsvis, etter 72 timers behandling. (C) HepG2 og Huh7-celler ble behandlet med GP ekstrakter fremstilt i 30% DMSO, vann eller butanol (BuOH) i 48 timer. Nivåene av AURKA, AURKB og FLJ10540 ble målt ved Western blot analyse. Uttrykket nivåer av AURKA, AURKB og FLJ10540 i HepG2 og Huh7-celler ble undertrykt ved 30% DMSO GP ekstrakter, men ikke av fraksjonene fremstilt i vann eller butanol. (D) HepG2-celler ble behandlet med 75 ng /ml av det synkroniserende middel nocodazol (NOC) i 18 timer; Cellene ble deretter behandlet med 750 ug /ml av 30% DMSO GP ekstrakter eller bærerkontroll (30% DMSO) i ytterligere 3 timer. Western blotting ble utført ved anvendelse av anti-FLJ10540, anti-AURKA og anti-AURKB antistoffer. (E) HepG2 celler ble behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter og dens fraksjoner (HH-F1, HH-F2, HH-F3 og HH-F4) i 3 timer. AURKA og AURKB uttrykk nivåer i HepG2-celler ble undertrykkes av HH-F3 fraksjon, men ikke av de andre fraksjoner. (F) Huh7, Mahlavu og PLC5 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av HH-F3 i 48 timer. Ekspresjonen av AURKA og FLJ10540-proteiner ble bestemt ved immunblotanalyse. HH-F3 redusert AURKA og FLJ10540 proteinnivåer i en konsentrasjonsavhengig måte.
GP reduserer AURKA, AURKB og FLJ10540 protein uttrykk nivåer under både inter og mitose i aktiverte leverstel celler og HCC cellelinjer
AURKA, AURKB og FLJ10540 er onkogener som ofte overuttrykt i HCC [22-24]. Tilfeldigvis fant vi at 30% DMSO GP ekstrakter hemmet protein uttrykk nivåer av FLJ10540, AURKA og AURKB i HCC cellelinjer (HepG2 og Huh7) i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1C, S1 Fig). I kontrast, gjorde GP ekstrakter fremstilt i enten vann eller butanol ikke hemmer protein uttrykk nivåer av AURKA eller AURKB i HepG2 celler etter 72 timers behandling (fig 1c). Det er vel kjent at uttrykket nivåer av AURKA, AURKB og FLJ10540 er høyere i metafase enn i mellomfase [25-27]. Vi har derfor undersøkt om 30% DMSO GP ekstrakter kunne hemme ekspresjon av disse proteinene i løpet av mitose i HCC celler. HepG2-celler ble først behandlet med 75 ng /ml nocodazol i 18 timer; Disse celler ble deretter behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter i 3 timer (uten å vaske ut den nocodazol). AURKA, AURKB og FLJ10540 uttrykk nivåer var høy under mitose. I celler behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter ble protein uttrykk nivåer av AURKA, AURKB og FLJ10540 redusert i inter og metafase (figur 1D); i kontrast, ble det ikke observert noen signifikante endringer i uttrykket nivåer av andre mitotiske proteiner (PIN1, HURP og Plk) (data ikke vist).
HH-F3 undertrykker AURKA protein uttrykk i HCC cellelinjer
Deretter bruker en Sephadex LH-20-kolonne, fikk vi fire fraksjoner fra 30% DMSO GP ekstrakter (S2A Fig). Western blot analyse utført 3 timer post-behandling viste at bare den tredje fraksjon (HH-F3) undertrykket ekspresjon av AURKA og AURKB i HepG2-celler (figur 1E). Deretter Huh7, Mahlavu og PLC5 celler ble behandlet uten eller med 25, 50 og 75 mikrogram /ml av HH-F3 brøkdel i 48 timer. Ekspresjonen av AURKA og FLJ10540 i alle tre HCC cellelinjer ble signifikant undertrykt av HH-F3 (figur 1F). For å undersøke om de hemmende effekter av HH-F3 skjedde på transkripsjonsnivået, undersøkte vi variasjonen i genuttrykk nivåer av
FLJ10540 Hotell og
AURKA
,
AURKB Hotell og
AURKC plakater (medlemmer av Aurora kinase familien av gener). HepG2-celler ble behandlet med 50 ug /ml av den HH-F3 fraksjon i 6 timer, og genekspresjon og proteinnivåer ble målt ved hjelp av microarray (U133A chip, Affymetrix) og Western blot, respektivt. Det var nesten ingen endring i genuttrykk nivå av en av de ovennevnte gener etter behandling med HH-F3; imidlertid, ble det observert reduksjon i proteinnivåer (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at HH-F3 brøkdel regulert uttrykk for FLJ10540 og Aurora kinase familien molekyler på translasjonsforskning nivå snarere enn på transkripsjonsnivået.
Identifikasjon av de aktive komponentene i GP
for å forenkle fremstillings protokoller, ble en annen fremgangsmåte (metode II) ved direkte dialyse av 30% DMSO GP ekstraktene mot vann som brukes. De fysiokjemiske egenskapene til forbindelsene oppnådd ved anvendelse av metode II er oppført i tabell S1, og disse dataene indikerte at fraksjonene som ble oppnådd med metode I (metoden opprinnelig brukt for å fremstille HH-F3) og Metode II var identiske. Etter frysetørking, karakteristiske rosa farge og delvis metallisk sølv-lignende glans av HH-F3 fraksjon ble observert. Ifølge den utvidede aromatiske signaler i
1 H og
13C NMR-spektra ble de viktigste komponentene i HH-F3 fraksjonen identifisert som polyfenoliske forbindelser; mer spesifikt, tanniner. En kolorimetrisk analyse (OD
500) for kvantifisering av kondensert tannin ved hjelp av catechin som standard viste at det totale innholdet av tannin HH-F3 fraksjonen var omtrent 68% (data ikke vist). HPLC-fingeravtrykk av HH-F3 fraksjon (S2 figur 2B) viste at denne fraksjon inneholdt to grupper av forbindelser (gruppe A og B) med distinkte områder av molekylvekter; Gruppe B inneholdt en større og en mindre del. Disse resultatene viste at den HH-F3 fraksjon var rikt på kondenserte tanniner og inneholdt forbindelser med høye molekylvekter.
(A), human hepatocytt ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 30% DMSO GP ekstraktene /HH-F3 for 72 t. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter. Huh7, Mahlavu og PLC5 celler ble behandlet med 5, 25, 50 og 75 ug /ml av HH-F3 fraksjon på for 24, 48 og 72 timer deretter underkastet MTT-assayet (B) og trypanblått-assay (C). IC
50 konsentrasjoner av HH-F3 for vekstinhibering av Huh7, Mahlavu og PLC5 celler var tilnærmet 50, 37,5 og 75 ug /ml, henholdsvis, etter 72 timers behandling.
fordi ingen polymere forbindelser har ennå ikke blitt isolert fra GP, de polyphenolic forbindelser fra
Rhodiola rosea plakater (rosenrot), en annen urt av Crassulaceae familien, ble brukt som referanseforbindelser for strukturell identifikasjon av forbindelser i HH F3 fraksjon.
R
.
rosea
har blitt rapportert å inneholde kondensert tanniner (CTS). De kjemiske egenskaper av de viktigste forbindelsene i HH-F3A sub-fraksjon, begge fra Metode I og II, var svært lik de CTS i
R
.
rosea plakater (rosenrot). I tillegg, fordi CT forbindelser er ofte funnet i mange vanlige drue arter,
Vitis vinifera
CT ble også brukt som referanseforbindelser. S1 Tabell sammendrag fysio egenskapene til polymer proantocyanidin fra
R
.
rosea Hotell og
Vitis vinifera
. Den høye forholdet i 3, 4, 5-trihydroksy benzyliske substituenter av HH-F3A (identifiseres av de
13C kjemiske skift ved 105 ppm og 109 ppm for C-2 «/6» og C-2 «/6» EGCG enhet, henholdsvis spektrene ikke vist) som var svært lik den til det stoff som finnes i
R
.
rosea
, men mye høyere enn stoff som finnes i drueskall og frø (se S1 tabell). Følgelig, CT presentert i HH-F3A ble foreslått som et polymert proantocyanidin med et herredømme prodelphinidin gjentagende enhet, og (4 → 8) -linkages (se fig S2C). Kjemisk karakterisering av HH-F3A og strukturoppklaring av repeterende enhet etter kjemisk nedbrytning av tiolyse vil bli publisert separat.
HH-F3 brøkdel reduserer levedyktigheten til HCC celler
For å undersøke effektene * P * P
