Abstract
svulstens mikromiljø er fylt med proteinaser. Som en sensor av proteinaser, proteinase aktivert reseptor 2 (PAR
2) spiller viktige roller i tumorgenese. Vi viste at PAR
2 og dets aktivering proteinase ble koekspresjon i forskjellige tykktarmskreft cellelinjer, inkludert HT29. Inaktivere proteinase eller knockdown av PAR
2 vesentlig ikke bare redusert celleproliferasjon in vitro, men også inhibert av tumorgenisitet HT29 in vivo. I tillegg aktivering av PAR
2 fremmet DNA-syntese og oppregulert Cyclin D1 aktivitet på begge transkripsjons og post-transkripsjonsnivåer. Videre studier viste at miRNA-34a mediert PAR
2-indusert Cyclin D1 oppregulering. Hemming av MIR-34a delvis avskaffet undertrykkelse av Cyclin D1 indusert av PAR
2 mangel. I tillegg viste vi at TGF-β bidratt til regulering av MIR-34a ved PAR
2. Til slutt, i tykktarmskreft prøver, oppregulering av PAR
2 og nedregulering av MIR-34a var signifikant korrelert med klasse og lymphomatic metastasering. Våre funn gir den første bevis for at miRNA formidler autokrint proteinase signale-mediert kreftcelle spredning
Citation. Ma Y, Bao-Han W, Lv X, Su Y, Zhao X, Yin Y, et al. (2013) mikroRNA-34a formidler Autocrine signale av PAR
2-Aktivere proteinase og dens rolle i Kolon Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE åtte (8): e72383. doi: 10,1371 /journal.pone.0072383
Redaktør: Jun Sun, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 03.04.2013; Godkjent: 09.07.2013; Publisert: 26 august 2013
Copyright: © 2013 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra 973 National Key Fundamental Research Program of China (https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx) (2012CB967003) og Nature Science Foundation of China National (http: //www.nsfc .gov.cn /Portal0 /default152.htm) (81172034, 91129717 og 81201966). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med ferdigstillelsen av human genome Project, er hele 553 gener kommenterte være koding av proteinase [1]. Identifisering av proteinase-aktiverte reseptorer (Pars) avslører en nøkkelrolle for proteinaser, ikke bare som protein-nedbrytende enzymer, men også som potensielle reseptor-aktivatorer som overfører ekstracellulære stimuli til intracellulære signalhendelser. Pars er syv transmembran-dekkende domener G-protein koblede reseptorer (GPCR) som virker som mål for visse serinproteaser, slik som trombin og trypsin. Proteolytisk spaltning av deres ekstracellulære aminoenden oppretter det nye aminoenden som virker som et tjoret ligand og aktiverer reseptoren. Den unike aktiveringsmekanismen av Pars gir en ny mekanisme som mikromiljøet påvirker celle atferd. Hittil har fire par familiemedlemmer blitt identifisert, PAR
1 til PAR
4, som alle del likheter i deres struktur og aktiveringsmekanisme [2]. PAR
2 er den eneste medlem i familien som ikke kan aktiveres av trombin. Studiene i knockout mus viste at PAR
2 spiller flere viktige roller i svulstdannelse i forhold til andre Pars [3].
PAR
2 er allment uttrykt i kroppen og spiller viktige roller i ulike typer av kreft hos mennesker, som kolon- og lungekreft [4], [5]. PAR
2 fremmer tumorprogresjon gjennom en rekke mekanismer, slik som celleproliferasjon, invasjon og metastase. Det ble vist at PAR
2-stimulert celleproliferasjon i forskjellige kreftceller og dukket opp som et potent mitogen faktor i forskjellige krefttyper [6] – [10]. Videre studier har vist at transaktivering av EGFR [7], aktivering av MAPK [9] og integrin α
5β
1-avhengig adhesjon til fibronektin [10] kan mediere PAR
2-stimulert celleproliferasjon. Imidlertid, de molekylære mekanismer som PAR
2 regulerer cellesyklusen er fortsatt uklar.
Som en viktig komponent i mikromiljøet, proteinaser fremme tumorcelle-proliferasjon og føre til ukontrollert cellevekst. Noen av proteinaser er i stand til å opptre som endogene aktivatorer av PAR
2 in vivo. I tillegg til trypsin, kan urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) /plasmin, FXa, FVIIa, vev faktorer, matriptase og kallikreins (KLKs) alle aktivere PAR
2 [11]. Ekstra-pankreatisk ekspresjon av trypsin, er vist i mage- og kolon-kreft [12], [13]. Tvunget uttrykk for trypsinogen dramatisk øker tumorigenitet av magekreftceller i hårløse mus [13]. Direkte bevis viser at trypsin handler på PAR
2 er en meget potent vekstfaktor for mennesketykktarmskreftceller [9].
Med tanke på allestedsnærværende PAR
2, og produksjon av proteinaser av svulster , er eksistensen av en autokrin sløyfe ikke uventet, særlig i kolorektal karsinom. Unormal uttrykk for PAR
2 ble funnet i mage-tarmkanalen kreft og kreftcellelinjer [14] – [16]. Uttrykk for matriptase og trypsin ble oppdaget i DLD-1 [17] og HT29 colonic kreft cellelinjer [18]. Sist, KLK14 ble funnet å bli uttrykt og være i stand til å aktivere PAR
2 i tykktarmskreftceller [19]. Det er forventet at autokrint samspillet av serinproteinaser og PAR
2 deltar i kreftcelle sprer i tykktarmen.
I denne studien, viser vi at autokrint handlingen av trypsin og KLK14 fremmet tykktarmskreftcelle spredning gjennom aktivering av PAR
2. Forstyrrelse av autokrint løkke ved knockdown av PAR
2 redusert kreftcellevekst både in vitro og in vivo. Videre viste vi for første gang at MIR-34a, som retter seg mot Cyclin D1, var avgjørende for PAR
2-indusert celleproliferasjon.
Metoder og materialer
Cell Culture and Cell linjer
human colonic epithelial cellelinje HT-29, Caco-2, HCT-116, RKO og human lunge adenokarsinom A549-cellelinjen ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium /F12 (Hyclone) supplert med 10% FBS (Gibco).
Stabil transfektant cellelinjer med PAR
2 knockdown
shRNA vektor pRFP- C-RS som inneholder fire forskjellige PAR
2 bestemte forstyrrende sekvenser og egge sekvens ble kjøpt fra OriGene Technologies. HT29-celler ble transfektert med en av de shRNAs og valgt med puromycin (1 pg /ml). Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og Western blot ble utført for å kontrollere uttrykk for PAR
2.
Kjemikalier og reagenser
hemmere for trypsin (Cat. No. T6522 og T9128) og actinomycin D ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. (. Cat No. 04 693 159 001) inhibitor cocktail og TGF-β ble kjøpt fra Roche og R D hhv. E2F-drevet luciferase reporter ble sjenerøst gitt av professor Nathalie Rivard, University of Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada. Den PAR
2-selektiv aktivering peptid (SLIGRL-NH
2) og omvendt rekkefølge inaktiv peptid (LRGILS-NH
2) var forberedt på Shanghai Apeptide Co Ltd (Shanghai, Kina). SiRNA for beta-catenin og kontroll RNA ble beskrevet tidligere [20].
Etikk erklæringen og humane prøver
Vevsprøver fra tretti tilfeller av tykktarmskreft og matchende normal slimhinne ble analysert. Pasientene ble rekruttert ved Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. Alle pasientene fikk ingen anti-kreft behandling før kirurgi og signert informert samtykke former for prøvetaking. Alle prosedyrer som involverer humane prøver ble godkjent av Institutional Review Board av den kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Institute. CRC vev og sammenkoblede normale vev ble neddykket i RNAlater ™ (Ambion) i 24 timer og deretter lagret ved -70 ° C inntil bruk.
BrdU-merking-analysen
celle proliferasjonsanalyse ble utført med BrdU merking analysesett (Roche) i henhold til produsentens prosedyre. I korthet ble cellene inkubert med 10 pM 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) i 24 timer. Etter fiksering ble cellene inkubert med anti-BrdU-antistoff i 1 time. Kolorimetrisk analyse ble utført med en iMark ™ mikroplateleser (BioRad) etter tilsetning av substrat-løsning i ca. 20 min. Dataene ble beregnet i henhold til produsentens instruksjoner og vist som absorbansverdien ved 450 nm etter subtraksjon av verdiene for den tomme gruppe. Forsøkene for celle nummer ble gjennomført parallelt. Resultatene av BrdU merkingsassay ble normalisert med celletall.
Colony Forming
I kolonidannelsesbestemmelsen ble cellene sådd ut ved lav tetthet (500 celler /skål) og fikk vokse til synlige kolonier dukket opp. Cellene ble deretter farget med Giemsa, og kolonier ble tellet.
MTT analyse
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analysene ble utført for å måle det relative antall levedyktige celler. Ved de angitte tidspunkter, ble mediet erstattet med friskt medium supplert med MTT (0,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich). Absorbans ble målt ved anvendelse av iMark ™ mikroplateleser (BioRad) ved en bølgelengde på 490 nm. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Western Blot
Proteinekstrakter fra dyrkede celler ble fremstilt ved å suspendere cellene i lyseringsbuffer (0,01% EDTA, 0,1% Triton X-100 og 10% proteinase inhibitor cocktail). Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved anvendelse av et proteinanalysesett (Bio-Rad). I korthet, ble 50 mg av lysatene separeres på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Membranene ble probet over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot human Cyclin D1 (1:1,000; Cell Signaling Technology), PAR
2 (N-19, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) eller β-catenin (Cell Signaling Technology), fulgt av inkubering med peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling Technology) ved 1:10,000 fortynning i 1 time. Signalet ble visualisert med ECL (Millipore).
RNA Isolation, RT og PCR
Total RNA, isolert fra A549 celler, HT29 celler eller pasientprøver ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen), var behandlet med DNase og revers transkribert ved hjelp av en transkripsjon kit (Invitrogen) for å få total cDNA som maler for mRNA deteksjon, eller transkribert med Takara ™ mikroRNA transkripsjon kit for å få cDNA som maler for mikroRNA deteksjon.
Alle prime brukes for kvantitativ PCR ble kjøpt fra GeneCopoeia (Fulen Gen Co Ltd, Guangzhou, Kina). Kvantitativ real-time PCR ble normalisert til GAPDH (glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase) eller U6 uttrykk for henholdsvis mRNA og miRNA
Grunning for vanlig PCR trypsinogen, KLK14 og PAR
2 var som følger:. Trysinogen forstand, 5′-TACCTTTGTTGCAGCTGCTG-3 «, og anti-sense, 5′-CACCACCCACTGTTCGCTG-3′; KLK14 forstand, 5′-CACTGCGGCCGCCCGATC; og anti-sense, 5»-GGCAGGGCGCAGCGCTCC-3 «; PAR
2 forstand, 5′-TGAAGATTGCCTATCACATAC-3 «og anti-sense, 5’TGCATTATTTTCTGATTAAGAGCC-3». Actin ble brukt som en intern kontroll.
luciferaserapportørplasmid analysen
Transient transfeksjon ble utført med en E2F-drevet luciferase som reporter for transkripsjonen aktivitet. Transfeksjon middel Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble inkubert med DNA i serum-fritt medium i 30 minutter før den ble tilsatt til cellene. Cellene ble inkubert med transfeksjon komplekset i 2 timer. Cellelysater for luciferaseaktiviteten ble samlet 24 timer etter transfeksjon, og cellene ble behandlet med PAR
2-AP i 3 timer før høsting. Luciferase analysene ble utført med en Dual-luciferase assay kit (Promega) og data ble normalisert til pTK-RL.
tumorigenesis i hårløse mus
For in vivo studier, 10
6 cellene ble injisert inn i nakne mus subkutant og tumorvekst ble fulgt i 3 uker. Alle dyr omsorg var i samsvar med de institusjonelle retningslinjer. Tumorstørrelse (
V
) ble beregnet to ganger i uken fra den andre uken, ved hjelp av formelen,
V plakater (mm
3) = 0,52 x (bredde)
2 × (lengde).
Statistical Analysis
data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Sammenligning av 2 grupper ble gjort ved hjelp av ANOVA med enten en post hoc Tukey test eller en post hoc Dunnett test. Sammenligning av 2 grupper ble gjort ved hjelp av Students t-test for uparede data. Et tilknyttet verdien av
p.
0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
knockdown av PAR
2 Blokkert Cell Proliferation i HT29 celler
I denne studien, testet vi PAR
2 mRNA nivåer i ulike tykktarm kreft celler inkludert HT29, HCT116, Caco-2 og RKO celler. I samsvar med tidligere rapporter [18], alle cellene testet viste positivt uttrykk for PAR
2 (figur 1A). Ekspresjon av endogent PAR
2-aktiverende proteinaser trypsinogen og KLK14 ble også undersøkt ved hjelp av RT-PCR. KLK14 mRNA var tilstede i alle humane tarmkreftceller ble analysert, mens trypsinogen ekspresjon ble observert bare i Caco-2 og HT29-cellelinjer (figur 1A). Siden HT29 celler til stede høy uttrykk for både trypsinogen og KLK14, valgte vi dette tykktarmskreft-avledet cellelinje for videre studier.
A. mRNA uttrykk for PAR
2, trypsinogen ble KLK14 målt med vanlig PCR i tykktarm kreft cellelinjer. B. Colonic kreftceller ble forbehandlet med de inhibitorer av trypsin (T9128 og T6522) eller serinproteinaser (proteinase-inhibitor cocktail, PIC) og celleproliferasjon ble målt ved MTT-analyse. C. mRNA uttrykk for PAR
2 i stabile transfektant celler (PAR
2-1 og PAR
2-2) ble målt ved real time PCR. HT29 RS representerer kontrollcellene er stabilt transfektert med egge kontroll RNA. Protein nivået av PAR
2 ble målt ved Western Blot og vist som innsats. Effekten av PAR
2 knockdown på celleformering ble målt ved (D) MTT-analyse og (E) kolonidannelse i HT29-celler. F. Celler (10
6) ble injisert subkutant i nakne mus, ble tumorvolumer målt som indikert og tumorvekt ble bestemt ved offer. *
p
0,05, **
p
0,01 Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. N = 3-6. Alle forsøk har blitt gjentatt minst 3 ganger uavhengig av hverandre.
For å finne ut om PAR
2-proteinase autokrint sløyfe er avgjørende for celledeling, brukte vi to metoder for å bryte ned autokrin loop. Først ble forskjellige inhibitorer anvendes for å blokkere aktiviteten til protease. To trypsin hemmere (T6522 og T9128) og en proteinase-inhibitor cocktail (PIC) ble anvendt for å blokkere kjente og ukjente serinproteinase som kan aktivere PAR
2, og alle av dem vesentlig blokkert HT29-celleformering som målt ved hjelp av MTT-analysen ( Figur 1B). For det andre, PAR
2 uttrykk ble stabilt slått ned i HT29 celler (figur 1C). MTT og kolonidannelse analyse indikerte henholdsvis den knockdown av PAR
2 blokkert celleproliferering (figur 1D) og kolonidannende evne (figur 1E) in vitro. Viktigst, knockdown av PAR
2 i HT29-celler signifikant redusert tumorvekst i nakne mus (figur 1F). Disse data indikerte at autokrint aktivering av PAR
2 av sine aktive proteinase fremme tykktarmskreft celleproliferasjon både in vitro og in vivo.
Cyclin D1-E2F Pathway mediert PAR
2-mediert Cell Proliferation
for å bestemme de molekylære mekanismene bak effekten av PAR
2 aktivisering på spredning, vi brukte den menneskelige lungekreft-avledet A549 epiteliale cellelinje som uttrykker PAR
2, men ikke aktiverings proteinase. Den BrdU-merking-analysen viste at den selektive PAR
2-aktiverende peptid (PAR
2-AP), men ikke den reverse-sekvensen peptid (RP), induserte en signifikant økning i DNA-syntese (figur 2A). Videre PAR
2 aktiverings betydelig økt Cyclin D1 både på mRNA og proteinnivåer (Fig 2B og C). Disse resultatene tyder på at PAR
2-aktivering fremmer cellesyklus ved G1 /S sjekkpunkt.
A549-celler ble behandlet med PAR
2-aktiverende peptid (PAR
2-AP, 50 pM) eller omvendt peptid (PAR
2-RP) i 24 timer. A. DNA-syntese ble målt ved hjelp av BrdU-merking assay.B. Nivåene av Cyclin D1 og Cyclin E mRNA ble påvist med PCR etter behandling med eller uten PAR
2-AP. C. Protein nivå av Cyclin D1 ble bestemt ved Western blot. D. A549-celler ble behandlet med PAR
2-AP (50 uM) 24 timer etter transient transfeksjon med E2F-luciferase (1 pg /brønn). Dataene ble normalisert med tk-RL og vist som prosent av kontrollgruppen. E. HT29-celler ble behandlet med PIC (proteinase-inhibitor cocktail) eller T9128 (trypsin-inhibitor). DNA-syntese ble målt ved BrdU-merking assay. F. Protein (til venstre) og mRNA (høyre) nivåer av cyclin D1 i PAR
2 knockout celler ble målt. *
p
0,05, ***
p
0.001 Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. N = 3-6. Alle forsøk har blitt gjentatt minst 3 ganger uavhengig av hverandre.
Generelt kan aktivering av Cyclin /CDK kompleks forårsake hyperfosforylering av pRb som fører til E2F transkripsjonen aktivering og slå på nedstrøms målgener, slik som Cyclin E. luciferase reporter-analysen viste at PAR
2-AP aktivering av PAR
2 forhøyet E2F transkripsjonen aktivitet (figur 2D), sammen med en samtidig økning av Cyclin E mRNA ekspresjon (figur 2B). Disse resultatene indikerer at PAR
2 aktivering fremmet celleproliferasjon gjennom Cyclin D1 /E2F signalering.
I tillegg testet vi hvorvidt Cyclin D1 spiller en rolle i PAR
2 auto-aktivering i HT29 celler. Behandling med PIC eller trypsin-inhibitor vesentlig oppheves DNA-syntese i HT29-celler (figur 2E). Uttrykket nivået av cyclin D1 i PAR
2 knockdown celler ble også downregulated på både protein og mRNA nivåer (Figur 2F). Disse funnene tyder på at cyclin D1 mediert PAR
2-indusert celleproliferasjon.
PAR
2 Regulerer Cyclin D1 Expression på Transkripsjonell og Post-transcriptional nivåer
For å forstå mekanismen som PAR
2 aktiverings regulerer Cyclin D1 uttrykk, vi brukte A549-celler som ikke har noen autokrin sløyfe. Først ble A549-celler forbehandlet med aktinomycin D for å hemme transkripsjon. Inhibering av transkripsjon fullstendig blokkert PAR
2-indusert Cyclin D1 på mRNA-nivå (figur 3A), men ikke på proteinnivå (figur 3B). På den annen side, knockdown av β-catenin, noe som er en nøkkel transkripsjonsfaktor for induksjon av Cyclin D1, også fullstendig blokkert Cyclin D1 mRNA ekspresjon (figur 3C). Disse resultatene antydet at β-catenin mediert PAR
2-indusert oppregulering av Cyclin D1 på transkripsjonsnivået. Men knockdown av β-catenin bare beskjedent redusert Cyclin D1 på proteinnivå (figur 3D), noe som indikerer at cyclin D1 ble også oppregulert ved PAR
2 på post-transkripsjonsnivået.
A549 celler ble forbehandlet med actinomycin D (2 ug /ml) 30 min før utfordringen med PAR
2-AP (50 uM) i 24 timer. (A) mRNA og (B) proteinnivåer av Cyclin D1 ble påvist ved sanntids-PCR og Western Blot. siRNA rettet mot beta-catenin ble transfektert inn i A549 celler 24 timer før behandling med PAR
2-AP. (C) mRNA og (D) proteinnivåer av Cyclin D1 ble påvist ved sanntids-PCR og Western Blot, respektivt.
Det er blitt rapportert at fosforylering av Cyclin D1 er involvert i dens degradering. Det var imidlertid ingen signifikant endring i fosfor-cyclin D1 etter PAR
2 aktivering (data ikke vist).
mirnas Mediate PAR
2-indusert Cyclin D1 Expression
I tillegg til protein modifikasjon, microRNAs (mirnas) er fremstår som viktige regulatorer av genuttrykk ved å spalte target mRNA eller ved å hemme deres oversettelse. Faktisk er flere microRNAs hadde blitt vist å regulere Cyclin D1 uttrykk direkte [21]. For å avgjøre om mirnas ble regulert av PAR
2, vi har oppdaget nivåene av MIR-15a, MIR-16, og MIR-34a i PAR
2 knockdown celler og PAR
2 aktiverte cellene. Real time PCR viste at nivået av MIR-34a, men ikke mir-15a og MIR-16, ble dramatisk forhøyet i PAR
2 knockdown HT29 celler (PAR
2-1 og PAR
2-2 ) sammenlignet med egge RNA kontrollceller (RS) (Figur 4A). Videre PAR
2 aktivering betydelig redusert Mir-34a uttrykk i A549 celler (figur 4B). For å teste hvorvidt MIR-34a kan reguleres ved HT29-avledet proteinaser, sulte vi HT29-celler i 3 timer, 24 timer og 48 timer for å akkumulere den PAR
2-aktiverende proteinaser (trypsin og KLK14) i mediet. Kvantitativ PCR viste at Mir-34a uttrykk nivået ble nedregulert med tiden (figur 4C). Hemmer av MIR-34a som reduserte nivået av MIR-34a (figur 4D, øvre panel) delvis restaurert nedregulering av Cyclin D1 i PAR
2 knockdown celler (figur 4D, nedre panel). Samlet utgjør disse data tyder på at Mir-34a mediert PAR
2-indusert oppregulering av cyclin D1.
(A) Total RNA av HT29, HT29 RS (kryptert kontroll RNA) og to forskjellige kloner av stabil transfektant celler med PAR
2 knockdown (PAR
2-1 og PAR
2-2) ble samlet. Nivåene av målrettede mirnas ble målt med real time PCR. (B) A549-celler ble behandlet med PAR
2-AP i 24 timer. (C) HT29-celler ble inkubert med DMEM /F-12 medium uten FBS for annen gang som angitt. (D) Transfeksjon av MIR-34a-hemmer eller kontroll RNA (c-RNA) med Lipofectamin2000 i HT-29-RS eller HT-29-PAR-2. Tre dager senere ble cellene samlet opp for analyse. Nivåene av miRNA ble målt med real time PCR og normalisert med U6. *
p
0,05, **
p
0,01 Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. N = 3-6.
TGF-β mediert PAR
2 relaterte miRNA-34a Expression
Det neste spørsmålet er hvordan PAR
2 aktivering regulerer uttrykket av MIR-34a. Behandlingen med betinget medium fra kontroll HT29 celler (HT-29-RS) betydelig redusert uttrykk nivået av MIR-34a som ble oppregulert ved knockdown av PAR
2 i HT29 celler (HT-29-PAR-2) (Figur 5A). Siden TGF-β er blitt rapportert å redusere ekspresjonen av MIR-34a nylig (39), er rollen til TGF-β i PAR-2-relaterte miR34a ekspresjon ble testet. For det første har vi funnet at TGF-β (5 ng /ml) var i stand til å redusere MIR-34a uttrykk både i PAR
2-manglende HT29 celler (HT-29-PAR2) (figur 5B) og i A549-celler (Figur 5C). Viktigst, uttømming av TGF-β fra betingelsesmediet av HT-29-RS ved hjelp av anti-TGFp-antistoff opphevet inhiberende virkning av betinget medium på MIR-34a uttrykket (figur 5D). Alle disse sterkt antydet at TGF-β mediert regulering av MIR-34a indusert av PAR
2 aktivering.
(A) HT-29-RS eller HT-29-par-2-celler ble behandlet med betinget medium fra HT-29-RS-celler (CM-RS) i 3 dager. (B) HT-29-PAR-2-celler ble behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 12 timer. (C) A549-celler ble behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 6 timer. (D) betinget medium fra HT-29-RS (CM-RS) ble inkubert med anti-TGF β antistoff og protein A /G-agarose ved 4 ° C i 2 timer. Etter sentrifugering ble supernatanten (CM-RS-anti-TGF β) brukes til behandling av HT-29-PAR-2 celle i 3 dager. Etter at de forskjellige behandlingene som er nevnt ovenfor, ble cellene samlet opp for analyse av MIR-34a med sanntids-PCR. *
p
0,05, **
p
0,01 Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. N = 4-8.
Korrelasjonen av PAR
2, trypsinogen, KLK14, cyclin D1 og MIR-34a i tykktarm kreft Prøver
For å få innsikt i biologiske rolle av PAR
2 autokrint signalisering i menneskelige kolorektal kreftutvikling, uttrykk nivåer av PAR
2 og dens aktive proteinase ble målt i 30 parede human T3 kolorektal kreft (CRC) prøver. Regelmessig RT-PCR ble ansatt for å påvise mRNA uttrykk for trypsinogen og KLK14 i CRC prøver og viste at nesten alle prøvene uttrykke PAR
2-aktivering proteinase (Figur 6A). Sytti prosent (21/30) av menneskelige CRC prøvene viste forhøyet trypsinogen uttrykk i tumorvev sammenlignet med sammenkoblede normale kolon vev, mens normalt vev viste nesten ingen trypsinogen uttrykk. Real time PCR viste at PAR
2 ble allment uttrykt i normal slimhinne og primær CRC prøver. Som vist i figur 6B, PAR
2 ble funnet å være i gjennomsnitt signifikant (
p
0,05) overexpressed i CRC prøver med høyere utvikling klasse, mens CyclinD1 og MIR-34a viste ingen signifikant endringer (figur 6B). Interessant, høyere nivåer av PAR
2, cyclin D1 og lavere nivå av MIR-34a var signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser i CRC prøver (figur 6C). Samlet utgjør disse dataene validert at autokrint løkken PAR
2 og dens aktive proteinase kan fremme tumorutvikling og kreft invasjon i menneskelige CRC prøver.
(A) uttrykk for trypsinogen og KLK14 i menneskelig CRC tumorprøver (T) og sammenkoblet normalt vev (N) ble målt med PCR. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. MRNA-ekspresjon av PAR
2, CCND1 og nivået av MIR-34a i humane CRC-prøver ble testet med sanntids-PCR. De ble sammenlignet i henhold til (B) karakteren eller (C) status for lymfeknutemetastase. Dataene er vist som fold endring av tumorprøve (T) til paret normalt vev (N).
Diskusjoner
microRNAs (mirnas) er endogent uttrykt 17-25 nucleotide, ikke-kodende RNA og regulere genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå. Siden den første miRNA, lin-4, ble oppdaget i 1993 [22], [23], omtrent 1000 mirnas er blitt identifisert i mennesker [24] og kan målrette over 30% av alle gener og et flertall av genetiske trasé [25] [26]. I det siste tiåret, mirnas har dukket opp som viktige regulatorer i kreft [27] og er involvert i utviklingen av en rekke kreftformer, inkludert tykktarmskreft [28]. Økende bevis indikerer at bestemte mirnas er korrelert med sykdom stadium, metastaser og overlevelse i CRC. Til dags dato er det 118 mirnas som alle har blitt verifisert og er forbundet med CRC utvikling [29]. Noen av miRNAs funksjon som tumor suppressor, slik som let7a, MIR-34 a /b /c, MIR-126, MIR-143, MIR-145, og MIR-200-familien, mens noen av dem antas å være onkogene, slik som MIR-17-92 cluster, MIR-21, og MIR-135.
Ukontrollert celledeling er en funksjon av kreft. Et antall mirnas har blitt identifisert som regulerer cellesyklusen. Noen av de mirnas fremme celleproliferasjon, så som MIR-125b [30], mens noen av dem induserer cellesyklus-stans. For eksempel, la-7 har blitt funnet å være en kraftig vekst suppressor i forskjellige kreftceller [31], [32]. To relatert mirnas MIR-143 og MIR-145 er funnet å undertrykke vekst blant annet gjennom målretting ERK5 [33]. Trombin er blitt vist å stimulere celleproliferasjon gjennom økningen av MIR-222 som kan inhibere p27 ekspresjonen [34]. Den aktuelle studien viste at serinproteinase aktivert PAR
2 og var også i stand til å påvirke nivået av miRNAs, som funksjonelt mediert cellevekst i kreftceller (figur 7).
Som en viktig regulator av G1 /S sjekkpunkt, kan Cyclin D1 bli målrettet av ulike miRNAs. MiR-15a og MIR-16 blir ofte slettet eller nedregulert og disse hendelsene omvendt korrelert med uttrykk for cyclin D1 i kreft. Videre studier viste at cyclin D1 er direkte regulert av MIR-15a og MIR-16 [35]. I tillegg kan Cyclin D1 ekspresjon reguleres ved MIR-200B og la-7b ved å målrette Rho familie GTPase 3 (RND3) [36], [37]. I denne studien ble MIR-15a og MIR-16 oppdaget. Det var imidlertid ingen signifikant endring i sine uttrykk nivåer etter PAR
2 aktivering i A549 celler (figur 3F) eller etter PAR
2 knowdown i HT29 celler. Videre var det ingen signifikant endring av MIR-200B og la-7b (data ikke vist), og heller ikke var det noen konsekvent forandring i ekspresjon av målgenet, RND3, som bestemt ved Western blot og luciferase reporter assay med 3 «UTR av RND3 (data ikke vist). Det er underforstått at MIR-15a, MIR-16 og MIR-200b er ikke de mediatorer av PAR
2-indusert oppregulering av cyclin D1.
MiR-34a tilhører MIR-34 familien som også inkluderer MIR-34b og MIR-34C. Lave nivåer av MIR-34 har ofte blitt observert i ulike tumorer, inkludert CRC [38]. Inaktivering av endogent MIR-34a stimulerer celleproliferasjon og hemmer p53-avhengig apoptose gjennom målretting Cyclin E2, cyclin-avhengige kinaser 4/6 (CDK4 /6) [38]. Våre forsøk har vist, for første gang, at MIR-34a mediert autokrin løkke av PAR
2 og dens aktivering proteinase, som er nødvendig for å opprettholde tykktarmkreftcelleformering.
Aktivering av ERK og transaktivering av EGFR har vist seg å være involvert i den proliferative virkning av PAR
2 [7], [9]. Men i denne studien, hverken hemmer av ERK (PD98059 og U0126) eller inhibitor av EGFR-tyrosinkinase-(AG1478) var i stand til å blokkere den celleproliferasjon eller endringen i MIR-34a-ekspresjon i HT29 og A549-celler (data ikke vist). Det underforstått at reguleringen av MIR-34a ikke var avhengig av EGFR og ERK-reaksjonsveien etter PAR
2-aktivering i kreftceller.
Nylig har det blitt rapportert at forhøyet TGF-β aktivitet undertrykket ekspresjon av mikroRNA-34a i levervev [39]. I tillegg har PAR
2-aktivering blitt vist å forsterke TGFp produksjon hos mus [40]. Derfor er det ikke overrasket over at TGFp medierer undertrykkelsen av MIR-34a indusert ved PAR
2-aktivering i denne studien. Videre er konstitutiv aktivering av PAR
2 på grunn av den autokrine løkke av PAR
2 og dens aktivering av proteinase delvis kan bidra til det lave nivået på MIR-34a, noe som er vanlig i en rekke kreftformer, så som kreft i tykktarmen.
Gitt de nye rollene PAR
2 i kreft, PAR
2 har blitt attraktivt mål for kreftbehandling. PAR
2 var bredt uttrykt i kreft og positivt korrelert med tumorprogresjon hos CRC. Enda viktigere, PAR
2 ble aktivert, ikke bare av proteinaser fra mikromiljøet av kreft, men også, som vår studie viser, ved proteinaser produsert av cancerceller selv. Videre vurderer regulering av miRNA av PAR
2 aktivisering at vi nå har beskrevet, et mer omfattende effekt på spredningen vil bli forventet etter målgruppe PAR
2 aktivering i kreftceller. Med forbedring av PAR
2 antagonister for tiden under utvikling, PAR
2 vil være et godt mål for kreftbehandling i fremtiden.
Takk
Vi takker professor Nathalie Rivard,
