Abstract
Nyere studier har fremhevet overekspresjon av mucin 1 (MUC1) i ulike epitel karsinomer og dens rolle i tumorigenesis. Disse slimstoffer presentere en ny målgruppe mulighet for nanopartikkel-mediert fototermiske kreft behandlinger på grunn av deres unike antenne-lignende ekstracellulære forlengelse. I denne studien ble MUC1 antistoffer og albumin immobilisert på overflaten av gull nanostaver ved hjelp av en «primer» for polydopamine (PD), en molekyletterligner av catechol- og amin-rike musling adhesive proteiner. PD danner et klebemiddel plattform for avsetning av albumin og MUC1 antistoffer, å oppnå en overflate som er stabil, bioinert og biofunksjonell. To-foton luminescens confocal og mørkefelt spredning avbildning avslørte målretting av MUC1-BSA-PD-NR’er å MUC1
+ MCF-7 brystkreft og SCC-15 plateepitelkarsinom cellelinjer. Behandlede celler ble eksponert for en laser som omfatter det nær-infrarøde AuNR langsgående overflate plasmon og vurdert for fototermiske ablasjon. MUC1-BSA-PD-NR’er vesentlig redusert celleviabilitet i photoirradiated MCF-7 cellelinjer vs. MUC1- MDA-MB-231 brystkreftceller (p 0,005). Agents viste ingen cytotoksisitet i fravær av fototermiske behandling. Den lettvinte natur belegg metoden, kombinert med målretting og photoablation effekt, er attraktive trekk ved disse kandidat kreft nanotherapeutics
Citation. Zelasko-Leon DC, Fuentes CM, Messer PB (2015) MUC1-Målrettet Cancer Cell Photothermal Ablation Bruke Bioinspired Gold nanorods. PLoS ONE 10 (7): e0128756. doi: 10,1371 /journal.pone.0128756
Redaktør: Bing Xu, Brandeis University, USA
mottatt: 25 mars 2015; Godkjent: 01.05.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Zelasko-Leon et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Imaging arbeidet ble utført ved Northwestern University Center for Advanced Molecular Imaging (CAMI), generøst støttet av NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H. Lurie Omfattende Cancer Center. Deler av denne forskningen ble utført ved Keck-II og EPIC kjerner av Northwestern University Atomic og nanoskala karakterisering Experimental (NUANCE) Center. NUANCE senter støttes av MRSEC program (NSF DMR-1121262) på Material Research Center, International Institute for nanoteknologi (IIN), Keck Foundation, og staten Illinois. Andre vesentlige karakterisering eksperimenter ble carrieed ut med støtte fra Northwestern University High throughput analyser Laboratory (HTAL) og Keck biofysikk Facility. Dette arbeidet ble ytterligere støttet av Northwestern University flowcytometrisystemer Facility og en Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). DCZL ble støttet av en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-0824162, https://www.fastlane.nsf.gov/grfp) og en Malkin Scholar Award fra Robert H. Lurie Omfattende Cancer Center (RHLCC) fra Northwestern University (https://cancer.northwestern.edu/research/research_programs/funding/). CMF ble støttet av en McCormick Summer Research Award (https://www.mccormick.northwestern.edu/students/undergraduate/research-opportunities/). Ekstra støtte ble gitt av NIH tilskudd R01 EB005772 og R37 DE014193 (PBM, https://report.nih.gov/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Au nanorods (AuNRs) er svært attraktive konstruksjoner for tumorbehandling på grunn av deres enkle syntese, fleksibel nær-infrarødt (NIR) lokalisert overflate plasmon resonans (LSPR), og store, functionalizable flater [1, 2 ]. Den LSPR forbedrer optiske egenskaper, noe som gir opphav til høy absorbans, spredning, og to-foton luminescens fenomener som kan utnyttes for fototermiske cancerterapi og diagnostisk avbildning [1, 2, 3]. Pasienter med dårlig tumoravgrensninger eller mikroskopisk sykdom kan være dårlige kandidater for invasive kirurgiske prosedyrer og stå å dra nytte av forbedrede multimodale tilnærminger [1]. Den ikke-invasive penetrering av NIR energi til AuNR-behandlede vev tillater lokalisert hypertermi som resulterer i tumor ablasjon. Som en ekstra fordel, kan denne varme forbedre vev perfusjon, økende påfølgende nanopartikkel lasting og effekten av adjuvant kjemoterapi eller stråling [4, 5].
En hovedutfordring i AuNR-basert terapi knyttet til å endre eller erstatte initial CTAB bilags med et overflatebelegg som er både bioinert og biofunksjonell [6]. En rekke av passive strategier er blitt utviklet for å overvinne dette problemet. Disse strategiene omfatter modifisering med amphiphillic syntetiske polymerer slik som poly (etylenglykol) -thiols (PEG-SH) [7], lipider [8], elektrostatiske lag av polyanioniske og polykationiske polymerer [9], og sist, proteiner [10, 11]. Den observerte utvikling av et protein corona følgende nanopartikkel kontakt i serum-inneholdende biologisk media har støttet interesse i albumin som en potensiell nanopartikkel passiveringsmiddel [11].
trans-membrane slimstoffer som er rike på prolin glykosylert, treonin, og serin-domener span epiteliale cellemembranen og gi en barrierefunksjon gjennom ectodomains som stikker over 100 nm fra celleoverflaten [12]. Autoproteolysis genererer C-terminale (MUC1-C) og N-terminal (MUC1-N) underenheter, er det sistnevnte som er forankret til celleoverflaten via en stabil, men ikke-kovalent kompleks med MUC1-C. Mens slimstoffer er vanligvis uttrykt på den apikale overflaten av cellene for å beskytte mot miljøgifter, induserer kronisk stress et tap i celle polaritet fører til interaksjoner av slimstoffer med basolateral overflatesignalmolekyler som reseptor tyrosin kinaser, utløser nedstrøms aktivering av spredning og overlevelse gener . MUC1 oppreguleres som respons på tilførsel av inflammatoriske cytokiner i løpet av betennelser og infeksjoner, som fører til tap av polaritet og styrke den beskyttende funksjon av slimhinnebarrieren.
Selv om forbigående MUC1 aktivitetsfunksjoner for å redusere betennelse og langsiktig overekspresjon fremmer aggressiv fenotyper i kreft hos mennesker. MUC1-N inneholder tungt glycoslyated tandem gjentakelser av 20 aminosyrer og er abnormt underglycosylated i epitelceller karsinom, utsette rester innblandet i immunosurveillance av kreft [13]. MUC1-N er i stand til å blokkere interaksjoner overflate, og kan også gjennomgå sekresjon fra cellemembranen, noe som tillater den reseptor-lignende aktivering av MUC1-C i forskjellige tumorsignalveier [12]. Betydningen av MUC1 som en relevant terapeutisk mål er markert med sin atypisk uttrykk i 64% av karsinomer diagnostiseres hvert år, og i over 90% av brystcarsinomer uavhengig av hormonet eller vekstfaktor-reseptor status [14].
funksjon og utnyttelse av MUC1 som en tumor antigen fortsetter å bli belyst [15] . Til tross for sin antenne-lignende fysisk manifestasjon som i prinsippet gir godt for terapeutisk målretting av mucin-uttrykke svulster [12, 16], har MUC1 blitt underutnyttet i målrettet kreftbehandling [17, 18, 19, 20]. Studier har vist at MUC1 overekspresjon direkte fremmer
in vivo
transformasjon av brystkjertelen og dens avvikende uttrykk i transformerte celler kan indusere sterisk blokkering eller aktivering av reseptorer på celleoverflaten, som fungerer som en pådriver for invasjonen [21] og kjemoterapi motstand [22, 23]. Klinisk påvisning av sirkulerende serumslimstoffnivået er en FDA-godkjent prognostisk faktor i behandling av brystkreft [12] og fase III kliniske studier evaluere MUC1 basert immunterapi er i gang [24].
Her demonstrerer vi polydopamine-mediert (PD) konjugering av gull nanorods (AuNRs) med bovint serum albumin (BSA) og slimstoff 1 monoklonale antistoffer (anti-MUC1) for passivisering og målretting, henholdsvis (fig 1). De viktigste målene for dette arbeidet var å identifisere optimale forhold for nanopartikkel funksjon og å demonstrere gjennomførbarheten av fototermiske ablasjon av MUC1 positive kreftceller via biofunctionalized AuNRs. Resultatene etablere optimale forhold for overflatemodifisering av AuNRs med BSA og MUC1 antistoff og fysiologiske stabilitet. Vellykket målretting og photoablation av MUC1 positive kreftceller tyder disse konstruksjonene kan være nyttige kreftbehandling i fremtiden.
MUC1 antistoffer tjene som nye målretting konstruksjoner i anvendelsen av plasmonic fototermiske terapi (A). Sondering MUC1 målretting på underglycosylated N- og C-terminale områder i ulike epithelial karsinom vil utvide vår kreft målretting repertoar med potensial for synergi terapeutiske effekter (B, tilpasset fra [12]).
Material og metoder
Material
Dopamin hydrochloride, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB, 99%), natrium tetrachloroaurate (III) dihydrat (NaAuCl
4 · 2H
2o, 99%), natriumborhydrid (NaBH
4, 98%), ascorbinsyre, glycin, og sølvnitrat (AGNO
3, 99%) ble benyttet for AuNR syntese. PH-verdien av den glycin-oppløsning (0,2 M) ble justert til 8,0 med 2 M natriumhydroksyd før bruk. Alle reagenser ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) med mindre annet er angitt. AlexaFluor 633 geit-anti-mus-immunoglobulin (IgG) ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Anti-MUC1-N (VU4H5), anti-MUC1-N-PE (VU4H5 PE), muse-anti-MUC1-C (H-6), geite-anti-muse-HRP-IgG, geit-anti-kanin-HRP-IgG, og kanin-anti-BSA (B-140) primære antistoffer ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Geit-anti-mus-IgG og geite-anti-kanin-IgG-antistoff konjugert til PE og /eller HRP ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ultrarent, deionisert vann (18.2MΩ · cm) ble anvendt for å fremstille alle vandige oppløsninger. SCC15, MCF-7 og MDA-MB-231 kreftcellelinjer var generøse gaver fra laboratorier av Dr. David Crowe ved University of Illinois-Chicago og Dr. Dean Ho ved Northwestern University.
Metoder
syntese av gull NR’er.
syntesen av CTAB-belagte AuNRs (CTAB-NRS) er godt etablert i litteraturen, og ble utført i henhold til en litt modifisert metode benyttes av Huang og kollegaer [2] . Alle reagenser ble anskaffet fra Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri) med mindre annet er angitt. En 0,2 M CTAB vandig oppløsning (5,0 ml) ble oppvarmet til 30 ° C og blandet med 0,5 mM NaAuCl
4 (5,0 ml). Iskald 0,01 M NaBH
4 (0,6 ml) ble tilsatt til denne blandingen og sonikert i 5 minutter inntil en gul-brun frø løsning utviklet. Deretter 50,0 ml av 0,2 M CTAB ble forsiktig blandet med 50,0 mL 1,0 mM NaAuCl
4 og 0,1 ml 0,1 M AGNO
3 for å danne en løsning vekst. Askorbinsyre (78,8 mM, 0,7 ml) ble tilsatt til vekst oppløsningen som et mildt reduksjonsmiddel, etterfulgt av tilsetning av 120 ul av frø løsning. Etter 45 minutter ble 100 ml av denne AuNR løsning blandet med 100 ml 0,2 M glycin (pH 8,0). Denne løsningen ble tillatt å reagere over natten uten omrøring ved omgivelsestemperatur.
Biofunctionalization av gull NR’er.
For syntese av BSA-PD-NR’er, 1 ml alikvoter av CTAB-NR’er ble sentrifugert ved 10360
xg
i 10 min for å danne en pellet. Supernatanten ble kastet og pelleten ble redispergert i 1,0 ml 10 mM Bicine-buffer (pH 8,5) supplert med 0,1 mg /mL, dopamin hydroklorid. En polydopamine belegg ble utviklet med sonikering ved 37 ° C i 30 minutter. En 1,0 ml løsning av 20 mg /ml BSA fremstilt i PBS (Ca
2 + og Mg
2 + fri) ble tilsatt til dette PD-NR blanding og fikk reagere i ytterligere 30 minutter med ultralydbehandling. Etter reaksjon over natten med forsiktig omrøring, ble prøvene sentrifugert, redispergeres i vann eller PBS, og lagret ved romtemperatur inntil videre bruk. For antistoff bøyning, 0,25 til 5,0 mikrogram antistoff var enten reagert direkte med CTAB- eller PD-NR’er før BSA tillegg eller ferdigblandet med BSA eller bufferløsninger før tillegg.
Antistoff bindende og kvantifisering.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
: Geit-anti-mus-IgG-belagte 96-brønners ELISA-mikroplater (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL) ble skylt med PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). Mus anti-MUC1-N /C-antistoff-standarder og AuNR supernatantprøver som inneholder ukjente mengder av MUC1-N eller -C (100 ul /brønn) ble lastet og tillatt å fange opp i 1 time ved romtemperatur med forsiktig omrøring. Platene ble vasket 3X i 200 mL PBST. Sekundært geite-anti-muse-IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, 100 ul /brønn, 1: 6000 fortynning) ble inkubert i en time ved 37 ° C med blanding. Platen ble vasket 3 ganger med PBST og en 1 mg /ml 2,2′-azino-bis (3-ethylbenz-tiazolin-6-svovelsyre) (ABTS) løsning ble fremstilt i 50 mM sitronsyre og 100 mM dibasisk natriumfosfat . Umiddelbart før anvendelse ble den ABTS-løsning blandet med 10 ul 30% H
2o
2 og tilsatt til brønnene (100 ul). ABTS fargeutvikling basert på tilstedeværelse av HRP-merket sekundært antistoff ble målt ved 405 nm i løpet av 15 minutter på en synergi H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Mengden av AuNR-bundet MUC1-N og MUC1-C-antistoffer ble bestemt ved å trekke konsentrasjonene påvist i prøve supernatantene fra de kjente belastningsforhold under forberedelse. Konsentrasjoner ble beregnet fra punkt-til-punkt-lineær regresjon standardkurver
Optisk spektroskopi
UV-Vis-NIR spektrofotometri product::.. UV-Vis-NIR spektra av varierende modifiserte AuNRs ble registrert i et Hitachi U-2010 spektrofotometer (Hitachi City, Japan). Langsgående LSPR topp-posisjoner ble bestemt og brukes som en indikator på overflatemodifisering og aggregering
sirkulærdikroismeanalyse
. Sirkulærdikroismeanalyse (CD) spektra ble tatt opp med en J-815 CD spektrofotometer (Jasco, Easton, MD) i det fjerne UV-området (190-300 nm, en oppløsning nm) i 1 mm veilengde quartz kyvetter ved omgivelsestemperatur. AuNR pellets (30 ul) ble fortynnet i 900 pl ultrarent vann for alle målinger. BSA (0,25 mg /ml) tjente som protein referanse mens ultrarent vann ble anvendt for bakgrunns subtraksjon. Den romlige anordning og ryggrad konformasjon av protein amider gir opphav til den karakteristiske CD-spektra av spesifikke sekundære strukturer. Minima ved 222 og 208 nm resultat av a-heliks protein amider og lys polarisert i retning av a-helikser, henholdsvis [25]. Mens metoder for beregning av% spiralformethet er allment tilgjengelig, [26], krever de proteinkonsentrasjoner som ikke kunne være nøyaktig bestemt i våre eksperimenter på grunn av katekolamin interferens [27]. Derfor, for å kvantifisere graden av sekundær struktur bevaring i BSA, den α-heliks tilbøyelighet [26], (1) kan brukes som et grovt, men praktisk estimat av α-heliks innhold, hvor
θ
representerer rå elliptisitet i millidegrees ved 208 og 222 nm, respektivt. Forhold mellom 0,80 og 0,95 representere enkeltkjede a-helikser og øke med økende α-heliks innhold [26].
Cellekultur.
MCF-7 brystkreftceller ble dyrket i høy glukose DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 10% FBS (Invitrogen), 1% gentamicinsulfat (Invitrogen), og 10 mikrogram /ml rekombinant humant insulin (Santa Cruz Biotechnology). MDA-MB-231-celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% FBS og 1% gentamicin sulfat. SCC15 muntlig plateepitelkarsinom ble dyrket i høy glukose DMEM supplert med 10% FBS og 1% gentamicin sulfate. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i fuktede inkubatorer med 5% CO
2.
Cell bildebehandling.
For fluorescens og to-foton luminescens (TPL) confocal bildebehandling, suspensjoner av celler (1×10
5) i 0,2 ml medium ble podet inn i hver av de 8 brønnene av en Lab-Tek kammer dekkglass glider (Nunc, Rochester, NY). Celler ble dyrket til konfluens og inkubert med friskt medium inneholdende AuNRs (15:00). Celler ble inkubert med AuNRs i 24 timer, skylles to ganger med PBS, og avbildes direkte for TPL-utslipp i friskt medium. Confocal bilder ble kjøpt med en invertert Axio Observer. Z1 mikroskop utstyrt med et 20X objektiv og oppvarmet trinn (37 ° C) satt til 5% CO
2 inkubasjon (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). For TPL bildebehandling, ble AuNRs opphisset av en Mai Tai femtosecond (fs) Ti: Sapphire laser (Mai Tai, Spectra-fysikk, Santa Clara, CA) med en puls på 130 fs og en gjentakelse hastighet på 80 MHz. TPL eksitasjonsbølgelengde ble justert til LSPR toppen av AuNR prøven (780 nm). En intern spektral detektor justert for utslipp mellom 500-615 nm oppdaget TPL fra AuNRs. En 543 nm HeNe laser ble brukt for lysfelt imaging. I mørkefelt (DF) spredningsforsøk ble cellene sådd (1×10
4 celler /brønn) på 16 brønn kammer lysbilder (Lab-Tek, Nunc), vokst til samløpet, og behandlet med 3,75 pM AuNRs i media for en time. Individuelle brønner ble skylt 3 ganger med PBS. Brønnene og kammer pakninger ble forsiktig fjernet og lysbildet ble coverslipped for umiddelbar avbildning på 40X forstørrelse med en oppreist Leica DM2500 (Wetzlar, Tyskland) mørkefelt mikroskop. Bilder ble kjøpt til en konstant eksponering (f-stopp 1/15) via en EOS Rebel T2i kamera.
elektronmikroskopi.
elektronmikroskopi (EM) nett (Ted Pella) ble lastet med pelle AuNRs (5 pl, 1 nM), motfarget med phosphotungstinic syre, og tørket over natten ved omgivende betingelser. Rister ble fotografert med en Hitachi HD-2300 Ultra High Resolution feltet utslipp scanning transmisjonselektronmikroskop (FE-STEM) (Hitachi City, Japan) i overføring EM (TEM) og sekundære elektron (SE) modus.
ζ-potensial analyse.
endrede og uendrede AuNRs (15 pM) ble injisert inn i standard foldet kapillær celler for f-potensial målinger. Målinger ble utført på en Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, Storbritannia) ved romtemperatur og beregnet som gjennomsnittet av sju skanninger.
Photothermal behandling med MUC1-modifisert AuNRs.
MCF- 7, MDA-MB-231, og SCC15 (5,0 x 10
5) kreftceller ble dyrket i 12 vel TCP-plater og dyrket til sammenflytning i løpet av 2-3 dager. Brønnene ble vasket med PBS og behandles med 0-3 pM anti-MUC1-N, anti-MUC1-C, eller BSA-only-modifisert AuNRs fortynnet i cellekulturmedier. Etter 1 time inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2, brønnene ble skylt 3 ganger med PBS for å fjerne ubundne AuNRs og markert ved to brennpunkter med tilsvarende Confluence nivåer. En av hver av disse punktene ble utsatt for en SuperK Versa bredbåndslaserkilde (NKT Photonics, 480-850 nm, 1 mm base) i 3,5 minutter ved en strømtetthet på 0,18 W /nm ved plasmon sentrum bølgelengde (780 nm). Etter en 24 timers inkubasjon ble cellene vasket med PBS, og farget med calcein AM (2 UM) og propidiumjodid (4 UM) for live /dead bildebehandling. Fluorescens mikroskopi ble utført med en Leica DMIRB mikroskop (Wetzlar, Tyskland) utstyrt med en 250 W Hg buelampe og en QIClick kamera (QImaging, Surrey, BC Canada). Punkter bestråling og ikke-bestråling ble fanget i hver brønn for sammenligning. Bilder ble behandlet med GNU Image Manipulation Program (GIMP, v. 2.8.0). ImageJ ble brukt til å konvertere levende /døde bilder til svart (bakgrunn) og hvite (celler) terskel masker. Området andel av bakgrunnselementer med (Area%
+ NIR) eller uten lasereksponering (Area%
-NIR) ble beregnet med
Mål
funksjon i ImageJ. Den følgende ligning ble benyttet for å kvantifisere behandlingseffekt: (2) Resultater ble normalisert til ubehandlede brønner ± NIR eksponering. Forsøkene ble gjentatt med SCC15 muntlige og MDA-MB-231 brystkreftcellelinjer.
Statistisk analyse.
t-test ble brukt til å analysere prosent antistoff lasting via ELISA. To-veis variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni post-tester ble benyttet for å bestemme hvorvidt de midlere% levedyktige områder blant MUC1
+ og MUC1
– cellelinjer var av vesentlig betydning for dosering og behandlingsforhold. Forskjellene ble vurdert som statistisk signifikant når
P
verdien var 0,05 (n = 3-6). Alle analyser ble utført av GraphPad Prism versjon 5.0a for Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Diskusjon
Resultater og Albumin som en overflate passiveringsmiddel
minimal ikke-spesifikk begroing på overflater er ofte en ønskelig mål i biomedisinsk forskning og medisinsk anordning utforming [28, 29], hvor podingen av biomolekyler og syntetiske polymerer til en overflate har blitt foreslått som en løsning [30, 31]. Graden og arten av ikke-spesifikk protein adsorpsjon på en overflate er avhengig av mange faktorer, inkludert proteinsammensetning (størrelse, konsentrasjon, ladning, og intern stabilitet), miljøbetingelser (pH, temperatur og ionestyrke), og overflateegenskaper (morfologi, lade og fri energi) [32]. Bruken av adsorberte BSA som en tilnærming til overflatepassivering har lenge vært en interessant strategi for biomedisinske forskere. En av de tidligste bruk av denne strategien var observasjon av Packham og andre som blodplater motstår adsorpsjon til albumin-belagte glass rør [33]. Passivisering med albumin ble foreslått for plasmaferese kretser, arterielle protetikk og andre blod-kontakter enheter for å hindre trombogenese, men denne tilnærmingen viste begrenset effekt på grunn av lav overflatedekning eller forskyvning av physisorbed albumin av proteiner med høyere bindingsaffiniteter [34].
En rekke forsøk ble gjort for å kryss-link absorbert albuminer med glutaraldehyd eller gammastråling behandlinger; imidlertid, ble det resulterende tap i protein fleksibilitet begrenser deres evne til å bidra til sterisk repulsjon [35]. Siden disse første observasjonene har albumin blitt brukt til å modifisere jernoksyd [36], polystyren [37], Ag og Au [38, 39], quantum dot [40], og liposomale nanopartikler [41]. Studier har ikke bare vist at BSA-konjugerte nanopartikler redusere aggregatdannelse, men de har også avdekket forbedring av quantum yield, som er av relevans for Photothermal programmer utforsket i denne studien [42].
Polydopamine for funksjonnanopartikler med biomolekyler
i denne studien beskriver vi en musling lim protein inspirert strategi for forankring BSA og antistoff på overflaten av gull nanorods. Den marine blåskjell er promiskuøse begroing av organiske og uorganiske overflater har blitt tilskrevet av Waite og andre til de uvanlige proteiner som finnes i de terminale selvklebende plaketter av sine byssal tråder [43, 44]. Nærmere bestemt, høye nivåer av katekol-inneholdende aminosyre 3-4-dihydroksyfenylalanin (DOPA) og den aminholdige aminosyren lysin forekomme i byssal plakker, og denne observasjonen har stor betydning for utformingen av fleksible molekylære klebemidler, ankere for syntetiske polymerer, og generelle strategier for overflatebelegg [44, 45].
motivert av det høye innholdet av katekolamin musling adhesive proteiner, dopamin ble identifisert som en enkelt strukturell etterligner av den musling fot protein 5 (MFP-5) og vist til spontant sette tynne melanin-lignende filmer på nesten alle bulk materialet overflaten [46]. Polydopamine (PD) film blir dannet gjennom spontan polymerisasjon av dopamin-molekyler under svakt alkaliske vandige betingelser som etterligner det marine miljø. Selv om mekanismen for dannelse og endelig sammensetning av PD er fremdeles under undersøkelse [47, 48, 49, 50, 51, 52], under de betingelser som normalt anvendes for å danne PD belegg dopamin oksyderes til dannelse av dopamin-kinon som etter at intramolekylær omleiring , videre oksidasjon og inter kobling, gir en eumelanin-lignende heterogen polymer [44]. Det er sannsynlig at en rekke av strukturelt underenheter og bindingstyper er funnet i PD filmen så vel som på PD-substrat og PD-proteingrenseflater, herunder kovalente bindinger, elektrostatisk og sterke ikke-kovalente interaksjoner som ladningsoverførings, hydrogenbinding, og π-stabling. Limet og reaktiv natur polydopamine tynne filmer ble utnyttet som en praktisk plattform eller «primer» på noe som kan bli satt flere sekundære belegg via en rekke potensielle mekanismer, inkludert kovalent binding med organiske tiol, amin, og histidinrester [53]. Med denne to-trinns nærme seg en lang rekke funksjonelle anvendelser av polydopamine har blitt utviklet for biomedisinske anvendelser [54], som for eksempel poding av PEG-tioler for å undertrykke begroing [46, 55] eller den spesifikke fremme celleadhesjon til overflater [ ,,,0],46].
Fremstilling og karakterisering av BSA modifisert AuNRs
Modifikasjon av AuNRs med PD ble utført som beskrevet tidligere [56, 57], hvilket ga AuNRs omgitt av et tynt belegg PD. Tilstedeværelsen av PD ble bekreftet ved hjelp av UV-vis rød skift (Fig A i S1-fil). PD-NR’er ble funnet å aggregere i buffer, men redispergering i BSA-oppløsning og isolering ved sentrifugering førte til stabile dispersjoner av BSA-PD-NR’er. Ved hjelp av løsningen AuNR LSPR intensitet og toppskift (figur B i S1 File) analysert via UV-Vis-NIR-spektrofotometri som et mål på stabilitet NR, screening av et utvalg av BSA-konsentrasjoner (0-30 mg /ml) brukt i de to -trinns belegg metode førte til identifisering av en optimal protokoll bestående av 0,1 mg /ml dopamin for PD belegg av CTAB-NR’er etterfulgt av stabilisering i ≥10 mg /ml BSA. Under disse optimale forhold, aggregering av BSA-PD-NR’er var sju ganger mindre enn PD-NRS (Fig B i S1 File). Alle etterfølgende eksperimenter ble utført på PD-NR’er modifisert ved 20 mg /ml BSA, for å sikre full passivering av PD barrierelaget som ellers kan tjene til å fremme AuNR aggregering. AuNRs (20 x 60 nm) modifisert med PD og BSA (20 mg /ml) ble avbildes via TEM følgende kontra med fosfowolframsyre for å gi kontrast til det organiske sjiktet BSA. Et lag måle ~ 15 nm i tykkelse ble visualisert på godt separerte BSA-PD-NR’er i SE-modus (Fig 2A). Dempningen av XPS Au4f signal av en gulloverflate observert ved eksponering overfor dopamin og BSA er forenlig med avsetningen av et belegg, fulgt av PD poding av BSA (Fig C i S1-fil).
(A) Elektronmikroskopi av BSA-PD-NR’er i sekundærelektron modus. Scale bar = 600 nm; Inset = 50 nm; (B) sirkulærdikroismeanalyse av modifisert vs. umodifisert gull NR’er. BSA-modifiserte NR’er ble modifisert med 10 eller 20 mg /ml BSA, som angitt. Konsentrasjonen av BSA kontroll var 0,25 mg /ml. Proteindenaturering inn i β-arkdannelse er angitt på PD-behandlet NR’er modifisert med en sub-optimal konsentrasjon av BSA. Ellers er BSA sekundær struktur bevart, som kvantifiseres ved de respektive α-heliks tilbøyelighet for hver endring.
AuNRs ble evaluert videre via UV-Vis-NIR-spektroskopi for å analysere endringer i lengde LSPR topp-posisjon (fig B i S1 File). BSA-DP-NR’er demonstrerte en plasmon røde forskyvning av 10 nm på grunn av endringer i den lokale dielektriske miljøet som følge av overflateadsorpsjon arrangementer. Denne endringen i maksimale LSPR bølgelengde, Δλ
max, tilsvarer en adsorbert tykkelse
d
av 15 nm basert på ligningen [57, 58], (3) Dersom
m
er bulk brytningsindeks respons av nanopartikler, Δ
n
er brytningsindeksendring indusert av adsorbere arter, og
l
d
er forfallet lengde av det elektromagnetiske feltet. Dette beregnes tykkelse er i tråd med våre TEM observasjoner (Fig 2A). I tillegg ble f-potensial målinger tatt opp for å spore AuNR biofunctionalization og er rapportert i tabell 1. Den trinnvise endringen i ζ-potensial med PD og BSA modifikasjon kulminerte i et negativt ladet BSA belegg.
BSA binding til PD-NR’er oppstått mest sannsynlig via ikke-kovalente mekanismene som er beskrevet ovenfor, eller ved kovalent binding til en hvilken som helst av 60 tilgjengelige overflate lysinrester [38]. Parallelle eksperimenter utført på ubehandlede CTAB-NR’er dispergert i 10 mg /ml BSA ga ikke en stabil suspensjon, noe som indikerer viktigheten av PD i styrke BSA passivisering. Selv om høyere konsentrasjoner av BSA ble funnet å stabilisere CTAB-AuNRs i fravær av PD som antydet ved sedimenteringsforsøk (figur B i S1-fil) og ELISA (data ikke vist), har disse konstruksjoner ikke klarte å lette optimal antistoff immobilisering i senere eksperimenter.
tertiære strukturen av serum albumin er sammensatt av tre domener (i-III), som er videre organisert i ni sløyfer ved 17 disulfidbindinger [59]. Spesielt, opprettholder BSA én gratis sulfhydryl rest på Cys-34, hvis tilstedeværelse er innblandet i både metall chelation og frie radikaler, dvs aktivitet [60]. I fysiologiske forhold, opprettholder BSA 67% α-heliks-innhold, 10% p-svinger, og 23% utvidet kjeder [59, 61]. Ved fysiologisk pH BSA opprettholder en netto negativ ladning (pl = 4,7), bidrar til dens utmerket vannløselighet, selv om en reduksjon i effektiv ladning er forventet som en funksjon av økende oppløsningens pH [59, 62], belyse den potensielle betydning av elektrostatiske interaksjoner på albuminbinding til CTAB eller polydopamine modifiserte overflater. Viktigere var det elektrostatisk drevet adsorpsjon av negativt ladet BSA ved pH 8,5 til AuNR flater dekorert av kationiske CTAB ammonium hode grupper funnet å indusere noen denaturering av α-heliks sekundær struktur som observert via CD (figur 2B).
Vi foreslo polydopamine-mediert adsorpsjon av BSA som en enkel strategi for å forbedre den kolloidale stabiliteten til gull nanorod suspensjoner mens virkningen til den sekundære strukturen til proteinet belegget minimaliseres. Vi fant at BSA-PD-NR’er var i stand til å opprettholde en høyere α-heliks tilbøyelighet (p (α) = 0,899) sammenlignet med BSA-bare modifiserte motstykker (p (α) = 0,824), og at dette forholdet nærmere nærmet kontroll BSA-standard (0,25 mg /ml, p (α) = 0,917). Den høye alfa-heliks tilbøyelighet anses fordelaktig, da denaturering kan føre til uønsket eksponering av immunstimulerende domener i BSA [42, 63]. Videre er en elektrostatisk drevet modifikasjon som ville være tilfelle i fravær av PD, kan være ustabil i fysiologiske miljøer [11], som tillater forskyvning av passiviserende BSA ved høyere affinitet proteiner som kan drive eliminering av nanopartikler via det retikuloendoteliale system [64 ]. Delvis BSA denaturering kan avsløre og forurolige interiør disulfidbindinger, som har vist seg å bidra til binding gjennom au-tiol interaksjoner [65].
Påfallende, BSA-PD-NR’er forberedt på sub-optimale 10 mg /ml BSA konsentrasjoner aggregeres som denaturert beta ark (fig 2B).
