Abstract
Bakgrunn og formål
Undersøkelsen om B7-H1 uttrykk i kolorektal kreft celler er på et tidlig stadium. Det er uklart om B7-H1 uttrykk kan ha diagnostisk eller prognostisk verdi i kolorektal kreft. I tillegg hvordan B7-H1 er assosiert med kliniske kjennetegn kolorektal kreft er ikke kjent. For å undersøke sammenhengen mellom B7-H1 og tykktarmskreft, analyserte vi B7-H1 uttrykk og dens effekt i kliniske prøver og HCT116-celler.
Metoder
parafininnstøpte prøver fra 143 kvalifisert pasienter ble brukt for å undersøke uttrykk av CD274 ved immunhistokjemi. Vi undersøkte også om B7-H1 i seg selv kan være relatert til celleproliferasjon, apoptose, migrasjon og invasjon i tykktarm kreft HCT116 cellene.
Resultater
Våre resultater viser at B7-H1 ble sterkt uttrykt i tykktarmskreft og ble signifikant assosiert med celledifferensiering status og TNM (tumor metastaser) scenen. Pasienter med positiv B7-H1 uttrykk viste en trend med kortere overlevelse. Ved hjelp av multivariat analyse, viser vi at positive B7-H1 uttrykk er en uavhengig prediktor for tykktarmskreft prognose. Våre resultater tyder på at B7-H1 stanse med siRNA inhiberer celleproliferasjon, migrering og invasjon. Videre celle apoptose ble også økt med B7-H1 hemming.
Konklusjoner
Positiv B7-H1 uttrykk er en uavhengig prediktor for tykktarmskreft prognose. Videre kan knockdown av B7-H1 hemme celleproliferasjon, migrering og invasjon
relasjon:. Shi S-J, Wang L-J, Wang G-D, Guo Z-Y, Wei M, Meng Y-L, et al. (2013) B7-H1 Expression er assosiert med dårlig prognose i kolorektal karsinom og Regulerer spredning og invasjon av HCT116 tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (10): e76012. doi: 10,1371 /journal.pone.0076012
Redaktør: John Souglakos, Universitetet General Hospital i Heraklion og Laboratorium for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Hellas
mottatt: June 7, 2013; Godkjent: 19 august 2013; Publisert: 04.10.2013
Copyright: © 2013 shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No.30873004, 30973000 og 81171924) og Science Foundation Natural av Shan Xi provinsen (No.2011JM4006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje hyppigst diagnostisert kreft i verden, og den femte største dødsårsaken blant kreftpasienter i Kina [1]. På grunn av mangel på effektive diagnostiske markører, de fleste pasienter med kolorektal kreft har fjernmetastaser (stadium IV) ved diagnose. Den mest effektive kolorektal kreft behandling er kirurgi. Men mangelen på nøyaktig prognose markører gjør det vanskelig å forutse pasientens overlevelse etter kirurgi. Dermed er nye og effektive markører for diagnose og prognose kreves i klinikken.
Den co-stimulerende molekyl B7 homolog 1 (B7-H1 eller CD274) er en nylig identifisert ligand for co-hemmende reseptor programmert død -1 (PD-1 eller CD279) [2,3]. B7-H1 blir uttrykt på T-celler, B-celler, makrofager og dendrittiske celler. Den ekspresjon av B7-H1 kan videre oppreguleres ved aktivering eller tilstedeværelse av IFN-γ [2-4]. I tillegg til lymfocytter, og B7-H1 også blitt detektert i lave nivåer på hjertets endotel, mikrovaskulære endotelceller, pankreatiske øyer og syncytiotropho-blaster i placenta [5,6]. Tradisjonelt er funksjon av B7-H1 på antigenpresenterende celler oppnådd gjennom binding med PD-1 på T-celler, som er tenkt å ha en viktig rolle i induksjon og vedlikehold av immuntoleranse [7-9].
i tillegg til uttrykket i lymfocytter og normalt vev, aberrant B7-H1 ekspresjon er også blitt funnet i forskjellige humane maligniteter. Tumortyper, inkludert plateepitelkarsinom i lungene, spiserør, hode og nakke, og andre typer karsinomer som eggstokkreft, blære, brystkreft, melanom og gliom også uttrykke B7-H1 [10-16]. Ekspresjon av tumor-assosiert B7-H1 er korrelert med dårlig prognose og høy grad av malignitet. Blokaden av tumorassosiert B7-H1 er blitt vist å fremme tumorregresjon in vivo i flere murine tumortransplantasjon [10,12,17,18]. PD-1-ekspresjon blir oppregulert på tumor-infiltrerende lymfocytter, og det har blitt foreslått at B7-H1 uttrykt på kreftceller kan hemme funksjonen av infiltrerende lymfocytter [16]. Det er også blitt vist at tumorassosiert B7-H1 kan indusere apoptose av CTL, som senere resulterte i en flukt fra T-celle-mediert immunovervåkning [8,10]. Tidligere studie betalt spesiell oppmerksomhet mot den funksjon av tumor-assosiert B7-H1 som får virkning som en ligand for PD-1 eller CD80, men neglisjert effekten av tumorassosiert B7-H1 seg på tumorcelle. Undersøkelsen vedrørende virkningen av tumorassosiert B7-H1 på tumorcelle er fremdeles i sin barndom. Således kan tumor-assosiert B7-H1 virker i samspill med andre negative regulatorer av T-celleaktivering for å dempe verten antitumorimmunrespons [19], også med stor mulighet, kan tumorassosiert B7-H1 påvirke prosessen med kreft progresjon gjennom å forstyrre funksjonen av kreftcellen.
uttrykk for B7-H1 i kolorektal karsinom er inkonsekvent. Dong et al. ikke klarte å påvise B7-H1 ekspresjon i normale tykktarm vev, men ekspresjon av B7-H1 ble påvist i en relativt høy andel (10/19) av pasienter med kolorektal kreft [10]. Imidlertid, en annen gruppe identifisert ekspresjon av B7-H1 på mRNA-nivå, men også ikke klarte å påvise overflate ekspresjon av B7-H1in colonic epitelceller fra friske kontroller [20]. Undersøkelsen vedrørende B7-H1 ekspresjon i kolorektal kreftceller er på et tidlig stadium. Det er uklart om B7-H1 uttrykk kan ha diagnostisk eller prognostisk verdi i kolorektal kreft. I tillegg hvordan B7-H1 er assosiert med kliniske kjennetegn kolorektal kreft er ikke kjent. I denne studien undersøkte vi uttrykket profilen til B7-H1 i 5 normale tykktarm vev, 143 kolorektal kreft vev og 44 tilstøtende vev. Vi vurderte også prediktiv verdi av B7-H1 for prognosen i pasienter med kolorektal kreft og undersøkt om tumorassosiert B7-H1 selv kan direkte modulere kolorektal kreft progresjon i stedet for gjennom binding til PD-1 på T-celle.
materialer og metoder
2.1: pasienter og oppfølgings
Som vi har beskrevet tidligere, ble denne studien godkjent av etisk komité for fjerde Military Medical University og alle de deltakende pasienter har gitt sin skriftlige informert samtykke til orientering og vevsprøver som skal lagres i databasen av Xijing sykehus og brukes til forskning [21]. . Den retrospektive kohort vi investigatedincluded143 pasienter med potensielt resektabel kolorektal kreft diagnostisert fra februar 2006 til desember 2007. Pasientene ble hentet fra Institutt for Gastrointestinal kirurgi, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University. Eksklusjonskriteriene for rekruttering i denne undersøkelsen er følgende: mottar adjuvant kjemoterapi før operasjonen, diagnostisering av gastrointestinal stromal tumor eller lymfom, diagnose med flere kreftformer, og alle pasienter som nekter samtykke. De kliniske prøver ble hentet fra vevet arkivet ved Institutt for patologi, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University. Oppfølgingen informasjon om alle deltakerne ble oppdatert hver 3. måned via telefon. Den total overlevelse ble definert som tiden har gått fra kirurgi til døden. Informasjon om døden av pasientene ble konstatert fra sin familie
2,2. Immunhistokjemisk (IHC) farging og evaluering
Parafin-embedded deler av normale og tumorvev ble farget for B7-H1 uttrykk. Immunhistokjemisk farging for B7-H1 ble utført som tidligere er rapportert med små modifikasjoner [22]. Kort, lysbilder ble deparaffinized i xylen og rehydrert i graderte alkohol serien før endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2. All uspesifikk proteinbinding ble blokkert ved hjelp av pre-immune kaninserum. Det primære antistoff for B7-H1 (Abcam, ab58810) ble fortynnet i henhold til de anbefalte konsentrasjoner (5 Hg /ml), og seksjonene ble inkubert over natten i et fuktet kammer ved 4 ° C. Seksjonene ble vasket 3 ganger med PBS, og deretter en biotinylert sekundært antistoff ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Signalet visualiseringen ble utført ved hjelp av DAB kromogen for 2 til 3 min. Den negative fargings kontrollen ble gjort ved å erstatte det primære antistoff med pre-immun kaninserum. B7-H1 farging ble scoret uavhengig av to patologer blindet for de kliniske kjennetegn ved pasientene. Poengsystemet som brukes i gradering B7-H1 uttrykk ble beskrevet tidligere [23]. Svulster med sterk og moderat farging intensitet ble klassifisert som å ha positive (+) uttrykk, mens svulster med fraværende og svak farging ble klassifisert som å ha negativ (-) uttrykk
2,3. Cellekultur
menneske~~POS=TRUNC HCT116-celler ble oppnådd fra celle~~POS=TRUNC Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), hvor de ble preget av mycoplasma deteksjon, DNA -Fingerprinting, isoenzym deteksjon og celle vitalitet deteksjon. Denne cellelinje ble umiddelbart ekspandert og frosset, slik at cellekulturer kan startes på nytt hver 3 til 4 måneder fra den samme batch av frosne ampuller. De HCT116-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT) og dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2
2.4: siRNA transfeksjon og genet stanse
For å dempe B7-H1 i celler, en liten interfering RNA (siRNA) ble transfektert inn i cellene. De sirnas duplekser (5′-GGCUGCACUAAUUGUCUAUTT-3 «og 5′-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3′), rettet mot B7-H1-genet. Den negative kontroll dupleks (5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «) rettet mot en ikke-spesifikk sekvens. De sirnas ble syntetisert ved Sangon Biotech (Shanghai, Kina). SiRNA tomannsboliger (100 nmol /L) ble transfektert inn i HCT116 cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. De HCT116-celler ble høstet 48 timer etter transfeksjon for videre analyse. Hemming effektivitet ble identifisert av western blot (figur S1)
2,5. RT-qPCR (revers transkripsjon-kvantitativ PCR)
Totalt celle RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. RNA ble så revers transkribert med Revert Aid
TM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Sankt Leon-Rot, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. De reverstranskripsjons-kvantitativ polymerase kjedereaksjoner (RT-qPCR) ble utført ved hjelp av en CFX96
TM Real-Time PCR system (BioRad, Valencia, CA) med SYBR Grønn reagenser (# DRR041A, Takara Bio, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. RT-qPCR-analyse ble utført i et totalt volum på 20 pl med følgende forsterkertrinn: en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, noe som ble etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og forlengelse ved 55 ° C i 30 sek. RT-qPCR-genekspresjon ble normalisert til human β-aktin. Primere som brukes for real-time PCR i denne studien var følgende: 5’TCAATGCCCCATACAACAAA -3 «(fornuft) og 5′-TGCTTGTCCAGATGACTTCG -3′ (anti) for B7-H1; 5»-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 «(sense) og 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3» (antisense) for β-actin
2,6.: Western blot
Cellene ble høstet i lyseringsbuffer (50 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% Triton X-100) inneholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN, USA). Cellelysatene (30 ug) ble separert ved anvendelse av 10% SDS-PAGE-geler og deretter overført på nitrocellulosemembraner (Millipore, Bedford, MA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk fortynnet i PBS i 2 timer ved romtemperatur før tilsetning av det passende primære antistoff. Antistoffene som brukes i denne studien inkluderte anti-B7-H1 (1: 400; Abcam, ab58810) og anti-GAPDH (1: 2000, Abcam, mAbcam9484). Membranene ble deretter vasket med PBS inneholdende 0,05% Tween og inkubert med det passende HRP-konjugert sekundært antistoff (1: 10000; Abcam) i 1 time ved romtemperatur. Båndene ble visualisert ved anvendelse av en kjemiluminescens-reagens (New England Nuclear, Boston, MA)
2,7. MTT-analysen
Celleformering ble analysert in vitro med tetrazoliumsaltet 3- (4, 5 -dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) reagens. HCT116-celler ble transfektert med spesifikk siRNA (Si-krafse eller si-B7-H1) i 24 timer, og deretter proliferasjon ble undersøkt. I korthet ble 2000-celler fra hver gruppe (foreldre, Si-krafse eller si-B7-H1) sådd ut i hver brønn av fem 96-brønners plater i 200 ul medium. For å analysere celleformering, 20 ul av MTT substrat ved en konsentrasjon på 2,5 mg /ml i PBS ble tilsatt til hver brønn. Platene ble så returnert til en standard vev inkubator i ytterligere 4 timer. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble oppløst i 150 mL dimetylsulfoksyd for kolorimetrisk analyse (bølgelengde 490 nm). Én plate ble analysert umiddelbart etter at cellene holdt (omtrent 4 h etter plating). Deretter ble en plate per dag undersøkt for de neste 4 påfølgende dager
2,8. Flowcytometrisk analyse for å påvise celle apoptose
HCT116-celler ble transfektert med spesifikke siRNA (SI-scramble eller si- B7-H1) i 48 timer, og cellene ble deretter suspendert i inkubasjonsbuffer ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. Cellene ble inkubert med Annexin V-FITC og propidiumjodid (BD Bioscience, San Jose, CA) i 15 minutter i mørket ved romtemperatur. Cell apoptose ble deretter analysert ved hjelp av en strømningscytometer (BD FACS Aria)
2,9. Migrasjon og invasjon analysen
Cell migrasjon og invasjon kapasitet ble målt in vitro ved bruk av transwell migrasjonsanalyser (Millipore, Billerica , MA). De HCT116-celler ble transfektert med spesifikk siRNA (Si-krafse eller si-B7-H1) i 48 t og suspendert i DMEM med 10 g /l BSA ved en tetthet på 50 celler /ml. Deretter ble cellesuspensjoner (200 ul) sådd i øvre kammer med aporous membran belagt med (for transwell invasjon analyse) eller uten (for migrering analyse) Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA). Å tiltrekke celler, ble 500 ul av DMEM med 10% serum tilsatt til den nederste kammer. Etter at cellene til å migrere i 24 timer eller til å invadere i 48 timer ble cellene som gjennomtrenges på filtrene ble fiksert i metanol og farget tørket i 4 g /l krystallfiolett. Antallet migrert eller invasive celler ble bestemt fra fem tilfeldige felt ved hjelp av et mikroskop (Olympus) med 10x forstørrelse
2,10. Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistisk programvare ( versjon 20.0). Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og fordelinger ble evaluert av lang-rank test. Cox proporsjonal fare modeller av forhold knyttet til overlevelse ble brukt til å beregne timer og å identifisere faktorer som påvirker overlevelse. Forskjellene i karakteristika mellom de 2 gruppene ble undersøkt av χ
2 test og Fishers eksakte test. Alle
P
-verdier ble bestemt fra 2-sidige tester, og statistisk signifikans ble basert på en
P
-verdi på 0,05.
Resultater
3.1: klinisk betydning av positiv B7-H1 uttrykk i kolorektal kreft vev
for å fastslå utbredelsen og kliniske betydningen av B7-H1 uttrykk i kolorektal kreft, vurderte vi B7-H1 protein nivå ved immunhistokjemi i en retrospektiv kohort av 143 pasienter med kolorektal kreft etter tumorreseksjon. Blant 143 pasienter, 64 pasienter (44,8%) viste positive B7-H1 uttrykk i cytoplasma og membran (figur 1A). Det var 79 pasientprøver uten påviselig B7-H1 uttrykk (figur 1C). I tillegg er bare 5 (11,4%) av 44 tilstøtende vev viste positiv B7-H1 uttrykket (figur 1 B p = 0,006). Som vist i tabell 2, ble celledifferensiering og TNM trinn også i forbindelse med prognosen for kolorektal karsinom. I multivariat analyse, fant vi at positiv B7-H1 uttrykk var assosiert med en redusert total overlevelse. Den justerte HR var 2,771. (95% KI: 1,048 til 2,994; p = 0,003), noe som indikerer at B7-H1 uttrykk kan være en prognostisk faktor uavhengig av disse justert clinicopathologic egenskaper (Tabell 2)
Univariat
Multivariate
HR
95% KI
P Verdi
HR
95% KI
P Verdi
B7-H1 expression2.611(1.008-3.576)0.006
*2.771(1.048-2.994)0.003
*Age0.815(0.497-1.335)0.4160.888(0.520-1.516)0.663Sex1.225(0.757-1.983)0.4081.010(0.596-1.714)0.433Tumor location1.199 (0.463-3.104) 0.7090.904 (0.281-2.906) 0.865TNM stage2.345(1.153-2.778)0.010
*1.416(1.179-1.971)0.043
*Differentiation1.956(1.224-2.928)0.030
*3.192(1.126-3.679)0.004
*Table . 2. Cox regresjonsanalyse av prognostiske faktorer for total overlevelse i pasienter med kolorektal kreft (n = 143) 95% KI
indikerer 95% konfidensintervall * P ≤ 0,05 CSV ned CSV
3.3: Effektiv knockdown av B7-H1 ved siRNA i HCT116-celler
Det er blitt rapportert at tumorassosiert B7-H1 kunne fremme T-celle-apoptose [10], men det finnes ingen studier som indikerer en rolle for B7-H1 ekspresjon på tumorceller. Som et vanlig brukt human kolorektal kreft cellelinje, har HCT116-celler er vist å være invasiv og sterkt motile in vitro [24-26]. Derfor, for å undersøke funksjonen av B7-H1 i tykktarmskreft cellebiologi, brukte vi sirnas rettet mot B7-H1 til å hemme B7-H1 uttrykk. Vi undersøkte tumorcellekarakteristikker, inkludert celle proliferasjon, apoptose, migrering og invasjon. Den effektive knockdown av B7-H1 ble bekreftet ved QRT-PCR, western blot og strømningscytometri-analyse. Sammenlignet med celler transfektert med egge siRNA, celler transfektert med sirnas til B7-H1 viste signifikant redusert B7-H1 uttrykket (hvert forsøk ble utført tre ganger, og typisk resultat er til stede som figur 2A, 2B og 2C).
(A) RT-qPCR-analyse for å vise den B7-H1 mRNA-nivå. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble høstet og RT-qPCR ble utført; (B) Western blot-analyse for å påvise B7-H1 proteinnivå. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble høstet og cellelysatene ble fremstilt og anvendt for Western blot; (C) flowcytometrisk analyse og mener kanalen fluorescens for å vise B7-H1 uttrykk på cellemembranen. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble høstet og celleoverflaten farging ble utført før flowcytometrisk analyse. Data ble presentert som betyr ± SD, * P 0,05 versus si-scramble gruppe
3,4. Effekt av B7-H1 knockdown på celleproliferasjon
Etter å ha bekreftet knockdown effektivitet av de sirnas målrettet mot B7-H1, bestemt vi effekten av en redusert B7-H1 nivå på celleproliferasjon ved hjelp av et MTT-assay. HCT116-celler som ble transfektert med siRNA rettet mot B7-H1 viste signifikant mindre spredning enn foreldre eller egge siRNA-transfekterte celler (figur 3A). Dette resultatet viste B7-H1 hadde en direkte virkning på celleformering i HCT116-celler, og at en høy B7-H1 proteinnivå er korrelert med økt celleproliferasjon.
(A) MTT-analyse for å detektere celleproliferasjon. Sperre eller HCT116-celler ble transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 i 48 timer ble sådd ut i 96-brønners plater og celleproliferasjon ble detektert ved MTT. Data ble presentert som betyr ± SD, * P 0,05 versus si-scramble gruppe. (B) Strømningscytometrisk analyse for å detektere celle apoptose. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble samlet og farget med Annexin-V-FITC og PI før flowcytometrisk analyse. Data ble presentert som betyr ± SD, * P 0,05 versus si-scramble gruppe
3,5. Effekt av B7-H1 knockdown på celle apoptose
Vi har vist at B7-H1 ekspresjonsnivået er korrelert med celleformering. Derfor ble det undersøkt hvorvidt den inhiberte celleproliferasjon kan være forårsaket av økt celle apoptose i B7-H1 knockdown-celler. HCT116-celler transfektert med krafse siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 i 48 timer ble analysert for apoptose. Resultatene tyder på at sammenlignet med foreldre eller egge siRNA-transfekterte celler, celler transfektert med siRNA rettet mot B7-H1 hadde økt apoptose indeks som beregnes ved å legge til cellene i 1 og cellene i 2 (12,3 ± 5,9% og 17,2% ± 6,2 vs. 1,1 ± 0,4%, P 0,05, 12,3 ± 5,9% og 17,2% vs. 0,9 ± 0,5%, P 0,05; hvert forsøk ble utført tre ganger, og typisk resultat er til stede som figur 3B). Sammen er disse resultatene tyder på at ekspresjon av B7-H1 i HCT116-celler er viktig for både celleproliferasjon og apoptose
3,6.: Effekt av B7-H1 knockdown på cellemigrering og invasjon
B7 -H1 har tidligere blitt vist å regulere cellemigrering og invasjon i pankreas karsinom-celler [27]. Våre observasjoner som B7-H1 uttrykk spilte en viktig rolle i HCT116 celleproliferasjon og apoptose førte oss til å vurdere funksjon av B7-H1 på cellemigrering og invasjon i tykktarmskreftceller. For å teste migrasjon, brukte vi standard Matrigel-belagte eller ubelagte transwell kammer analyser. Vi har funnet at sammenlignet med de omkastede siRNA-transfekterte celler, HCT116-celler transfektert med sirnas målrettet mot B7-H1 hadde redusert migrering og invasjon evne (figur 4A-4D), og en redusert invasiv indeks (invasjon celle nummer /migrerings celle nummer, fig S2 ). Som konklusjon, våre resultater indikerer at B7-H1-ekspresjon i HCT116-celler er korrelert med celleproliferasjon, apoptose, migrering og invasjon.
(A) Boyden kammer analyse for å påvise cellemigrering. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble sådd i Boyden kamre uten Matrigel belagt membran, og etter ytterligere 48 timer, ble overført cellene farget og telles under et mikroskop (forstørrelse × 10). Representative bildene ble vist. (B) antall migrerte celler som er vist i A. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD fra fem felt. * P 0,05 versus si-scramble gruppe. (C) Boyden kammer analyse for å detektere celle invasjon. Foreldre eller HCT116-celler transfektert med egge siRNA eller siRNA rettet mot B7-H1 for 48 timer ble sådd i modifisert Boyden kamre med Matrigel belagt membran, og etter ytterligere 24 timer, ble invasive celler som flyttet gjennom Matrigel membranen farget og telles under et mikroskop (forstørrelse × 10). Representative bildene ble vist. (D) Antall invaderende celler er vist i C. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD fra fem felt. * P. 0,05 versus si-scramble gruppe
Diskusjoner
B7-H1 er sterkt uttrykt i ulike typer svulster. Men sammenhengen mellom B7-H1 uttrykk og kolorektal kreft progresjon er ikke godt studert [20,28]. I dette studiet bekreftet vi at ekspresjon av B7-H1 kunne påvises i både kolorektal kreft og tilstøtende vev, men på en forskjellig frekvens. Vi har også gitt bevis for at positive B7-H1 uttrykk ble korrelert med uønskede kliniske og patologiske funksjoner i kolorektal kreft. Videre har vi vist at den B7-H1 ekspresjonsnivået var også prediktive for sykdomsprogresjon og cancer-spesifikk død. Våre resultater viste pasienter med positiveB7-H1 uttrykk er vanligvis på et betydelig høyere risiko for kreft progresjon, kreftspesifikk død og kortere total overlevelse. Denne økte risikoen var uavhengig av kjønn, alder, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, differensiering status og TNM stadium. Disse resultatene gitt den første bevis som støtter B7-H1 som en prediktor for dårlig prognose i kolorektal kreft.
Den mest spennende og uventet funn var våre resultater viste at B7-H1 seg korrelert med celleproliferasjon, apoptose, migrasjon og invasjon. Selv om noen forskningsmiljøer har bekreftet at kreftceller som uttrykker B7-H1 hadde en høy proliferativ indeks [14,27], de fleste grupper en tendens til å tro B7-H1 hindre svulst ødeleggelse bare ved å danne «et molekylært skjold [18,29]», men ikke danner «en kraftigere spyd» [18,30]. Våre funn gir kraftig bevis på at B7-H1 kan ha onkogene funksjon under kolonkreftutvikling, som kaster et nytt lys på funksjonen til B7-H1 i kolorektal kreftutvikling.
tilbakefall av tykktarmskreft er relativt høy. En mulig årsak til tilbakefall er at resttumor kan unngå vert immunesurveillance. Tidligere studier har bekreftet at høy T-celle-infiltrasjon inn i kolorektal cancer vev er korrelert med en forbedret 5-års overlevelse. Et høyt nivå av T-celle-infiltrasjon kan tjene som en prediktor for bedre prognose enn konvensjonell oppsamling histopatologisk [31]. Imidlertid har det også blitt vist at pasienter med kolorektal kreft har en utvidet treg befolkning. Det økte antall Treg celler kan undertrykke CD4
+ T-celle-funksjon som respons på tumorassosierte antigener [32]. Det har også blitt rapportert at hyppigheten av Tregs i TDLNs ble korrelert med sykdommens stadium [33]. Kolorektal kreftpasienter med høy ekspresjon av Th1 eller cytotoksiske klase gener har en lengre sykdomsfri overlevelse. Omvendt, høy ekspresjon av de Th17 klynge genene resulterer i en dårlig prognose [34,35]. Forholdet mellom tumorassosiert B7-H1 og funksjonen av infiltrerte T-celler i tumoren mikromiljøet har blitt godt etablert. Det er også godt akseptert at tumor-assosiert B7-H1 kan bidra til tumorcellene unngå immunovervåkning ved å inhibere funksjonen av effektor-T-celler og forbedre funksjonen av Tregs i kolorektal cancer [36]. Og resultatene støtter denne oppfatningen for høy ekspresjon av B7-H1 som kan lamme verten immunesurveillance er assosiert med dårlig prognose ved kolorektalkreft.
Men undertrykkelse av svulst immunitet er fortsatt ikke funksjonen av B7-H1in fullt ut forstått. For eksempel, hvor B7-H1 regulerer T-cellefunksjonen og den antatte ikke-PD-1-reseptoren må identifiseres. Identifiseringen av B7-1 som en ny B7-H1 reseptor gjort problemet mer komplisert, og kompleksiteten av disse molekylære interaksjoner antyder at B7-H1 eller PD-1 blokade alene ikke kan være tilstrekkelig til å blokkere de inhiberende veier. Og våre resultater gjør dette spørsmålet selv bli mer komplisert. Våre resultater viste at cellene med redusert B7-H1 ekspresjon hadde nedsatt celleformering, migrering og invasjon. I tillegg reduserer B7-H1expression førte til økt celle apoptose (figur 3 4). Selv om en mer detaljert mekanisme må bli oppdaget å forklare våre resultater viser disse resultater gir bevis for at B7-H1 kan være ikke bare en ligand for PD-1 eller en antatt ikke-PD-1-reseptoren, men også fungere som et onkogen molekyl. Til sammen våre resultater og tidligere litteratur, kan vi få den konklusjon at B7-H1 kan fremskynde utviklingen av tykktarmskreft selv hemme funksjonen av T-celle og øke graden av malignitet av tykktarmskreft celle, og dermed gjør det forbundet med dårlig prognose i pasienter med kolorektal kreft.
Vi har også lagt merke til en nylig litteratur får en motstridende konklusjon med vår studie.
