Abstract
Eggstokkreft er en betennelse-assosiert malignitet med høy dødelighet. CXCR2 uttrykke eggstokkreft er aggressive med dårligere resultater. Vi undersøkte derfor molekylære mekanismene som er involvert i CXCR2-drevet kreft progresjon ved å sammenligne CXCR2 positive og negative eggstokkreft cellelinjer. Stabilt transfektert CXCR2 SKOV-3-celler som hadde en hurtigere vekst sammenlignet med kontroll celler transfektert med tom vektor. Spesielt, tumor nekrose faktor (TNF), rikelig uttrykt i eggstokk-kreft, forsterket celleproliferasjon ved å redusere G0-G1 fase i CXCR2 transfekterte celler. TNF øket nukleær faktor-kB (NF-kB) aktivitet i en større grad i CXCR2-transfekterte celler enn kontrollcellene samt gitt en større aktivering av IicB. CXCR2 transfekterte celler uttrykte høye nivåer av proinflammatoriske dets ligander, CXCL1 /2 og forbedret mer proliferasjon, migrering og invasjon kolonidannelse. CXCR2 positive celler aktiveres også mer EGFR, noe som førte til høyere Akt aktivering. Forbedret NF-kB aktivitet i CXCR2-positive celler ble redusert med et PI3K /akt-hemmer i stedet en Erk inhibitor. CXCL1 tilsatt til CXCR2-positive celler førte til en øket aktivering av IicB. CXCL1 også ført til et betydelig større antall invasive celler i CXCR2 transfekterte celler, som ble blokkert av NF-kB inhibitor, Bay 11-7082. I tillegg forsterkes celle-proliferasjon i CXCR2-positive celler var mer følsom for CXCL1 antistoff eller et NF-kB-inhibitor. Endelig CXCR2 transfeksjon av foreldre celler økt CXCL1 promoter aktivitet via en NF-kB stedet. Dermed styrking av proinflammatoriske kjemokiner CXCL1 /2, av poten NF-kB aktivering gjennom EGFR-transactivated Akt, bidrar til CXCR2 drevet eggstokkreft progresjon
Citation. Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Son DS ( 2013) CXCR2-Driven Ovarian Cancer Progresjon innebærer oppregulering av Proinflammatoriske Kjemokiner av poten NF-kB aktivering via EGFR-Transactivated Akt signale. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10,1371 /journal.pone.0083789
Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan
mottatt: 5 juni 2013; Godkjent: 08.11.2013; Publisert: 20.12.2013
Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) SC1 089630 (EL) og National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) SC1AI089073 (DS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft, en av flere betennelse-assosiert kreft, er den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner. Det er en snikende sykdom fordi det er vanligvis asymptomatiske inntil svulstene har spredd seg langt utover eggstokkene [1]. Den proinflammatory svulstens mikromiljø for eggstokkreft er klinisk assosiert med peritoneal tumor spredning og massive ascites, etterfulgt av en høy dødelighet. Eggstokkreft celler uttrykker høye nivåer av tumornekrosefaktor (TNF), noe som indikerer den potensielle betydning av TNF som en regulator av den proinflammatoriske tumor mikromiljøet i dette malignitet [2] – [4]. Spesielt TNF er blitt vist å regulere kjemokin nettverk i eggstokkreft celler gjennom nukleær faktor-kB (NF-kB) signalveien [5] – [6]. Kjemokiner kan være kritiske mediatorer i en svulst mikromiljøet ved å bidra til kreftutvikling og metastase [7] – [8]. Blant kjemokinreseptorer, eggstokkreft celler ofte uttrykker CXCR2, som har bedt eggstokkreft progresjon [9]. CXCR2 er også sterkt til uttrykk i enkelte andre kreftcelletyper som for eksempel lunge adenokarsinom [10], laryngeal plateepitelkarsinom [11], livmorkreft [12], endetarmskreft [13], leverkreft [14] og magekreft [15] . På grunn av dette krets, kan det være i stand til å tjene som en selvstendig prognostisk markør. Således CXCR2 knockout mus har en betydelig redusert tumorbyrde på prostatakreft [16], murin Lewis lungekreft [17] og nyretumormodeller [18] i forhold til CXCR2 villtype-mus. I tillegg er en CXCR2 mangel dypt trykkes betennelse drevet tumorgenese i hud og tarm [19]. Fraværet av CXCR2 i svulsten mikromiljøet også forhindret tykktarmskreft cellevekst [20]. Endelig CXCL1, en CXCR2 ligand, ble omvendt assosiert med tilbakefall overlevelse i pasienter med kolorektal kreft [21].
Disse fakta indikerer at en CXCR2-mediert signalveien er nært forbundet med kreft progresjon. Selv om flere reaksjonsveier slik som apoptose, EGFR-aktivering og angiogenese er involvert i CXCR2-mediert signalisering [9], [16] – [20], er det fortsatt et stort gap på molekylære mekanismer som forbinder mellom CXCR2 og dens multiple veier. I vår tidligere studie, ovarie cancer cellelinjer sterkt uttrykt CXCL1-3 og CXCL8 [5] – [6], som alle har en høy affinitet for CXCR2 [22]. Selv om disse CXCR2 ligander er strengt regulert av NF-kB signale [5], [23], er det uklart hvordan CXCR2 og NF-kB er mekanisk involvert i kreft i eggstokkene progresjon. Her har vi brukt sperre ovarie cancer-cellelinjer ble generert og stabil CXCR2 transfekterte celler, så vel som kontrollceller transfektert med tom vektor. Vi definerte virkningen av NF-kB signalering, en hoved proinflammatoriske vei, på den potensielle bidrag CXCR2 til kreft progresjon eggstokkene.
Materialer og metoder
Reagenser
Rekombinant human TNF, ble CXCL1 og en CXCL1 /2/3 pan spesifikt antistoff for nøytralisering fås fra R trekkende eller invaderende celler på filteret ble fiksert med 3,7% formaldehyd og beiset med 0,1% krystallfiolett, etterfulgt av vasking av cellene med PBS. Antallet trekkende eller invaderende celler, ble tellet under mikroskop (X400) under anvendelse av 5 tilfeldig valgte felt.
kolonidannelse
Celler ble suspendert i RPMI-medium inneholdende 0,4% agarose i konsentrasjoner på 2 x 10
3 celler per brønn i en seks-brønns plate. De suspenderte celler ble lagt over et bunnlag av størknet 0,8% agarose i RPMI-medium med 5% FBS og inkubert i 14 dager. Koloniene ble farget med 0,05% krystallfiolett, fotografert, og kvantifisert.
knockdown av CXCR2 av CXCR2 shRNA
eggstokkreft celler på ca 50% sammenflyt i 24- eller seks-brønns plater ble vasket en gang med 1% FBS friskt medium uten tilsetningsstoffer og deretter transient transfektert med kontroll eller CXCR2 shRNA (sluttkonsentrasjon: 1 pg /ml) i 72 timer ved 37 ° C ved anvendelse av Lipofectamine løsning. Transfekterte celler ble bekreftet knockdown av CXCR2 protein og behandlet som beskrevet i resultater i henhold til ulike eksperimenter.
Statistical Analysis
Data ble analysert av paret Student
t
-test og en-veis analyse av varians (ANOVA) som passer. Hvis en statistisk signifikans (p≤0.05) ble bestemt ved ANOVA, ble dataene videre analysert ved Tukey er parvise sammenligninger å påvise spesifikke forskjeller mellom behandlingene.
Resultater
CXCR2 positive celler har en raskere vekst hastighet og er mer mottakelig for TNF-stimulert Cell Proliferation Sammenlignet CXCR2 negative celler
Vi ga CXCR2 positive (SKCXCR2) og negative (SKA) cellelinjer av stabilt trans CXCR2 eller tomme vektorer i foreldre Skov-3 eggstokkreft celler (figurene 1A og 1B). Vekstratene i SKCXCR2 og SKA cellene var lik for de første 24 av kultur, men etter 48 og 72 timer, SKCXCR2 cellevekstrater var omtrent dobbelt i forhold til SKA celler (figur 1C). Siden TNF er godt kjent for å være et proinflammatorisk cytokin rikelig uttrykt i eggstokk-kreft [2] – [4], testet vi effektene av TNF på celleformering i SKA og SKCXCR2 celler. Resultatene viste at TNF signifikant økt celleproliferasjon i SKCXCR2 celler, men hadde ingen virkning på proliferasjonen av SKA-celler (figur 1D). Basert på FACS-analyse, SKCXCR2 celler hadde en redusert G0-G1 fase og en økning i S-fasen (med en svak økning i G2-M-fase) i forhold til SKA celler (figur 1E). TNF i seg selv, derimot, tydelig redusert SKCXCR2 G0-G1 fase (med en svak økning i S og G2-M-faser), mens det ikke hadde noen effekt på SKA-celler (figur 1E).
(A) CXCR2 protein uttrykk i SKA versus SKCXCR2 celler. Helcellelysater ble fremstilt og western blot utført under anvendelse av antistoffer som er spesifikke for CXCR2 og β-actin som en lasting kontroll. (B) Representant immunfluorescens farging av SKA versus SKCXCR2 celler, noe som indikerer CXCR2 protein uttrykk nivåer (i grønt). (C) Sammenligning av vekstrater i SKA versus SKCXCR2 celler. Cellene ble inkubert i 0, 24, 48 og 72 timer og vekstrater normalisert til 0 h tettheter i hver cellelinje. Forsøk ble utført in triplo og alle data er vist som gjennomsnitt ± S.E. * Og ** (p≤0.05) i hver gruppe av ANOVA og Tukey er parvise sammenligninger. # (P≤0.05) mellom SKA og SKCXCR2 celler av paret Student
t
-test. (D) Virkning av TNF på celleformering i SKA versus SKCXCR2 celler. Celler ble inkubert med bærer (kontroll) eller TNF (10 ng /ml) i 48 timer. En celle proliferasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av MTT og verdiene normalisert til ubehandlede kontroller. Forsøk ble utført in triplo og alle data er vist som gjennomsnitt ± S.E. * (P≤0.05) av Student
t
-test. (E) TNF effekter på cellesyklusfaser G0-G1, S og G2-M i SKA versus SKCXCR2 celler. Celler ble behandlet med bærer (kontroll) eller TNF (10 ng /ml) i 48 timer. Flowcytometri analyser ble utført for å bestemme% av celler i hver fase. Representative histogrammer vises. Forsøkene ble utført 5 ganger, og uavhengige data i hver innsatsen er vist som gjennomsnitt ± S.E. Blå og røde bokstaver indikerer signifikant (p≤0.05) sammenlignet med SKA kontroll og TNF behandling, henholdsvis ved Student
t
-test.
I tillegg har vi testet effekten av TNF på cellesyklus relaterte gener i SKA versus SKCXCR2 celler. SKCXCR2 celler hadde over 50% reduksjon i cyklin B1 (0,49), cyklin F (0,38), cyklin G2 (0,47) og p21 (0,25) i forhold til SKA celler. TNF hadde ingen signifikant effekt på cellesyklusrelaterte gener i kontroll SKA celler, men det resulterte i 2 ganger økning av GADD45α i SKCXCR2 celler (tabell S1). GADD45α har vist seg å være en mediator av syntetisk retinoid indusert apoptose i eggstokk-carcinoma-celler [24]. Således avbrudd av GADD45α har vist seg å fremme dannelsen rør og migrering av endotelceller [25]. Cellemigrasjon og invasive evner var faktisk mye høyere i GADD45α-mangelfull mus embryonale fibroblaster [26]. Basert på disse funksjonelle egenskaper GADD45α, er usannsynlig å bli assosiert med den forbedrede celleproliferasjon i SKCXCR2 celler en TNF-indusert økning i GADD45α.
CXCR2 positive celler Forbedre NF-kB aktivering Etterfulgt av en økning på CXCR2 ligander (CXCL1 og 2), som sammenlignet med CXCR2-negative celler
NF-kB er den primære signalveien for TNF-funksjoner, har vi derfor undersøkt om den TNF-indusert celleproliferasjon i SKCXCR2 celler involvert NF-kB signalering. Både basal og TNF-induserte nivåer av NF-kB-promoter-aktivitet var høyere i SKCXCR2-celler (figur 2A). Immunofluorescerende farging viste at SKCXCR2 cellene hadde mer fosforylert IkB i forhold til SKA celler (figur 2B). På den annen side, IkB ekspresjon var høyere i SKA celler sammenlignet med SKCXCR2 celler (figur 2B). Western blot-analyse viste at CXCR2-uttrykkende celler hadde mer fosforylert IKK og IkB (som et direkte nedstrøms virkning av IKK) i begge sine basale tilstander så vel som i respons på TNF over tid (figur 2C). CXCR2-mediert NF-kB-aktivering kan innebære kjemokin ligander som inneholder kB områder i deres promotere [5] – [6], [23]. Derfor sammenlignet vi chemokin nettverksprofiler i SKA og SKCXCR2 celler ved hjelp av en PCR array. Resultatene viste at SKCXCR2 cellene hadde en . 2 gangers økning i proinflammatorisk kjemokiner CXCL1 og CXCL2 i forhold til SKA-celler (figur 2D)
(A) Effekt av TNF på NF-kB luciferase-aktivitet i SKA og SKCXCR2 celler. Etter transfeksjon ved bruk av NF-kB luciferase vektor over natten, ble cellene behandlet med TNFa (10 ng /ml) i 4 timer. Forsøk ble utført in triplo og data er vist som gjennomsnitt ± S.E. * Og # (p≤0.05) sammenlignet med kontroll og SKA celler, henholdsvis ved den parede Student
t
-test. (B) Representant immunfluorescens farging av SKA og SKCXCR2 celler indikerer IKB aktivering og CXCR2 protein uttrykk nivåer (i grønt). (C) Effekt av TNF (10 ng /ml) over tid (0-120 min) på NF-kB-aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Helcellelysater ble fremstilt og Western blot utført under anvendelse av antistoffer som er spesifikke til IkB og IKK så vel som deres fosforylerte former (pIκB og pikk). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) chemokin profilen sammenligninger i SKCXCR2 forhold til SKA celler. Etter isolering av total-RNA, ble en human kjemokin PCR matrisen utført. Den stiplede linjen viser en to-fold økning; de med en 2-dobling og gjennomsnittlig syklus terskel 30 er anerkjent som indusert kjemokiner, og i dette tilfellet representerer CXCL1 og 2 (*)
CXCR2 positive celler Øk CXCL1 /2. , og er involvert i celleproliferasjon og forbedre migrasjon, invasjon og kolonidannelse Sammenlignet CXCR2 negative celler
Vi bekreftet at SKCXCR2 celler produsert mer CXCL1 og CXCL2 enn SKA celler ved QRT-PCR og ELISA-analysen (figur 3A og 3B). Selv om SKCXCR2 celler hadde en større økning i CXCL2 enn CXCL1 på mRNA-nivå (figur 3A), så langt det totale protein var det mer total CXCL1 protein (figur 3B) enn CXCL2, sannsynligvis som følge av høyere mengde av CXCL1 mRNA (figur 2D ). Basert på den antatte CXCR2-NF-kB-CXCL1 /2-tilkobling, vi testet om CXCL1 eller dets antistoff påvirket celleproliferasjon annerledes i SKA og SKCXCR2 celler. Tilsetning av CXCL1 hadde ingen virkning på celleformering i SKA celler, men betydelig økt proliferasjon av SKCXCR2 celler (figur 3C). Også mens en panne antistoff for CXCL1 /2/3 hadde ingen virkning på celleformering i celler SKA det betydelig redusert spredning i SKCXCR2 celler (Figur 3D). I tillegg fikk vi bekreftet at den pan antistoff redusert CXCL1 og CXCL2 mRNA i SKCXCR2 celler (Figur 3E). Fordi CXCL1-CXCR2 aksen ble funnet å fremme gastrisk tumorinvasjon [15], sammenlignet vi migrasjons- og invasjons mulighetene i SKA og SKCXCR2 celler. SKCXCR2 cellene hadde forbedret migrasjon og invasjon egenskaper sammenlignet med SKA celler (Tall 3F og 3G). På bakgrunn av den økte migrering og invasjon i SKCXCR2 celler, vi testet videre en bløt agar-kolonidannelse for å detektere hvorvidt det var en høyere malign transformasjon i SKCXCR2 celler, og fant at SKCXCR2 cellene produserte flere kolonier enn SKA-celler (figur 3 H).
(A) bekreftelse på CXCL1 og CXCL2 uttrykk i SKA og SKCXCR2 celler ved QRT-PCR. Etter å isolere total RNA, ble QRT-PCR utføres ved hjelp av primere for CXCL1 og CXCL2. (B) Cellular CXCL1 og CXCL2 konsentrasjoner i SKA og SKCXCR2 celler i løpet av en periode på 24 timer. Helcellelysater ble fremstilt og ELISA utført under anvendelse av antistoffer som er spesifikke til CXCL1 og CXCL2 og verdier ble normalisert til total-protein. (C) Virkning av CXCL1 på celleproliferasjon i SKA og SKCXCR2 celler for 48 timers inkubering. (D) Effekt av pan antistoff for CXCL1 /2/3 på celleproliferasjon i SKA og SKCXCR2 celler. Celler ble inkubert med normalt IgG (kontroll) og pan antistoff (1:100 fortynning) i 48 timer. Analysen celleformering ble utført ved anvendelse av MTT og verdier ble normalisert til ubehandlede kontroller. (E) Effekt av pan antistoff for CXCL1 /2/3 på CXCL1 og CXCL2 uttrykk i SKCXCR2 celler ved QRT-PCR. Etter behandling med pan-antistoff i 24 timer og deretter isolering av total-RNA, ble QRT-PCR utført ved anvendelse av primere for CXCL1 og CXCL2. (F) Migrasjons egenskaper mellom SKA og SKCXCR2 celler. (G) Invasion egenskaper mellom SKA og SKCXCR2 celler. (H) Sammenligning av kolonidannelse mellom SKA og SKCXCR2 celler. Alle forsøkene ble utført i det minste i tre eksemplarer, og data er vist som gjennomsnitt ± S.E. * Og # (p≤0.05) som beregnet av Student
t
-test.
CXCR2 positive celler Transactivate EGFR i større grad, noe som resulterer i Akt Activation som bidrar til NF- kB Signa
Siden det ble vist at CXCL1 kan indusere spredning i epitelceller eggstokkreft celler av trans av EGFR [27], sammenlignet vi EGFR trans i SKA og SKCXCR2 celler. SKCXCR2 celler hadde en større grad av fosforylert EGFR, noe som fører til høyere Akt aktivering, men det var liten effekt på ekstra fordel nivåer (figur 4A). Konfokalt avbildnings viste at SKCXCR2 cellene hadde mer fosforylert Akt i forhold til SKA celler (figur 4B). Siden Akt og ERK stier knyttet til celle overlevelse og spredning, sjekket vi sammenlignende effekter av PI3K /Akt eller ERK-hemmere på celleproliferasjon i SKA og SKCXCR2 celler. Selv om AG-1478, LY294002 og PD98059 dempes celleproliferasjon i både SKA og SKCXCR2 celler, deres virkninger på spredning var langt større i SKCXCR2 celler (Figur 4C). Vi så bestemt om EGFR nedstrøms hemmere påvirket NF-kB promoter aktivitet i SKA og SKCXCR2 celler. AG-1478, en spesifikk EGFR kinase-hemmer, hadde ingen signifikant effekt på NF-kB-promoter-aktivitet i SKA-celler, men det dempet aktiviteten i CXCR2-positive celler på en doseavhengig måte (figur 4D). Selv om LY294002, en meget selektiv PI3K-inhibitor som blokkerer Akt aktivering, svekket NF-kB-promoter-aktivitet i begge celletyper på en doseavhengig måte, hadde en større hemmende virkning på aktiviteten i SKCXCR2 celler. Interessant, PD98059, en spesifikk inhibitor Erk, hadde ingen signifikant effekt på NF-kB promoter-aktivitet i hver celletype (figur 4D). Vi bekreftet effekten av spesifikke hemmere på EGFR, Akt og Erk aktivisering (figur 4E).
(A) Sammenligning av EGFR aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Helcellelysater var forberedt og Western blot utføres ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for EGFR, Akt, Erk og fosforylerte formene (pEGFR, Pakt og Perk). De ikke-fosforylerte formene ble brukt som laste kontroller. (B) Representative immunfluorescens fargemønstre som indikerer Akt aktivering og CXCR2 protein uttrykk nivåer i SKA og SKCXCR2 celler. (C) Sammenlignbare effekter av AG-1478, LY294002 og PD98059 på celleproliferasjon i SKA og SKCXCR2 celler. Celler ble inkubert med bærer (kontroll), AG-1478 (AG, 2 uM), LY294002 (LY, 2 uM) eller PD98059 (PD, 20 pM) i 48 timer. Analysen celleformering ble utført ved anvendelse av MTT og verdier ble normalisert til ubehandlede kontroller. * Og # (p≤0.05) sammenlignet med kontroller (C) og SKA celler, henholdsvis ved Students
t
-test. (D) doseavhengig effekt av EGFR nedstrøms hemmere på NF-kB luciferasepreparater aktiviteter i SKA og SKCXCR2 celler. Etter transfeksjon med NF-kB luciferase vektor over natten, ble cellene behandlet med AG-1478 (EGFR inhibitor, 0, 0,5, 1 og 2 uM), LY294002 (Akt inhibitor, 0, 0,5, 1 og 2 uM) eller PD98059 (Erk-inhibitor , 0, 5, 10 og 20 uM) i 4 timer. * Og # (p≤0.05) sammenlignet med kontroller (0 h) og SKA celler, henholdsvis ved Students
t
-test. Alle forsøkene ble utført i det minste i tre eksemplarer, og data er vist som gjennomsnitt ± S.E. (E) Bekreftelse på spesifikke hemmere på EGFR, Akt og Erk aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Celler ble behandlet med AG-1478 (2 uM), LY294002 (2 uM) og PD98059 (20 uM) i 4 timer. Helcellelysater var forberedt og en western blot ble utført ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for EGFR, Akt, Erk og deres fosforylerte formene (pEGFR, Pakt og Perk). Non-fosforylerte formene ble brukt som laste kontroller.
CXCL1 Forbedrer NF-kB aktivering i CXCR2 uttrykke celler som øker CXCL1 Arrangøren aktivitet via en NF-kB Side
For å klargjøre involvering av NF-kB signalering i de CXCL1-CXCR2 aksen, testet vi sammenlignende effekten av tilsatt CXCL1 på NF-kB aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. CXCL1 produsert mer fosforylert IKB i SKCXCR2 celler sammenlignet med SKA celler (figur 5A). I tillegg er en CXCL1 /2/3-antistoff hadde ingen effekt på NF-kB-promoter-aktivitet i SKA celler, men signifikant redusert aktivitet i dette SKCXCR2 celler (Figur 5B). Basert på involvering av NF-kB i CXCL1-CXCR2-aksen sammenlignet vi effektene av Bay11-7082, en spesifikk NF-kB-inhibitor, på celleproliferasjon i SKA og SKCXCR2 celler. Bay11-7082 hadde ingen virkning på celleformering i SKA celler, men signifikant redusert proliferasjon i SKCXCR2 celler (figur 5C). Inhiberingen var størst i SKCXCR2 celler, sannsynligvis på grunn av høyere aktivering av NF-kB i disse celler (figurene 2A-C). Videre, sammenlignet vi effektene av Bay11-7082 på et CXCL1-indusert celle invasjon. Selv om CXCL1 hadde en liten virkning på celle invasjon i SKA-celler, er forskjellene ikke var signifikante (figur 5D). På den annen side, SKCXCR2 celler hadde minst en fordobling av celle invasjon tall som respons på CXCL1 sammenlignet med kontroller (figur 5D). Bay11-7082 også blokkert CXCL1-indusert celle invasjon i SKCXCR2 celler (figur 5D), noe som indikerer involvering av NF-kB signalering.
(A) Sammenlignbare effekter av CXCL1 på NF-kB aktivering i SKA og SKCXCR2 celler . Celler ble behandlet med CXCL1 (100 ng /ml) og resultatene ble undersøkt i en tidsavhengig måte. Helcellelysater var forberedt og Western blot utføres ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for IKB, fosforylert IKB (pIκB) og CXCR2. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
