Abstract
Kjemoterapi er et viktig alternativ for behandling av ulike kreftformer, inkludert lungekreft . Imidlertid har tumorresistens overfor cytostatika blitt mer vanlig. Det har blitt rapportert at autofagi er en av de prosesser som bidrar til denne motstand. I denne studien fant vi at den anti-kreft narkotika 5-fluorouraci (5-FU) kan indusere autofagi i A549 celler. 5-FU behandling kan føre til omdannelse av LC3 I /II, opp-regulering av Beclin-1, den nedregulering av p62 og dannelse av sure vesikulær organeller (avos) på A549-celler. Forbehandling av kreftceller med 3-MA eller siAtg7 kunne øke 5-FU-indusert apoptose gjennom aktivering av kaspaser og kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK reddet cellenes levedyktighet reduksjon. Videre er inhiberingen av autophagy også stimulert ROS dannelse og rensing av ROS ved antioksydant NAC hemmet caspase-3 aktivitet, hindret frigjøringen av cyt-c fra mitokondrier og til slutt reddet kreftceller fra 5-FU-mediert apoptose. Disse resultater antyder at 5-FU-fremkalte autophagic respons spiller en beskyttende rolle mot celle apoptose og inhibisjon av autophagy kan sensibilisere dem til 5-FU-indusert caspase-avhengig apoptose gjennom stimulering av ROS formasjonen.
Citation : Pan X, Zhang X, Sun H, Zhang J, Yan M, Zhang H (2013) Autophagy Hemming Fremmer 5-Fluorouraci apoptose ved å stimulere ROS-formasjonen i human ikke-småcellet lungekreft A549-celler. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10,1371 /journal.pone.0056679
Redaktør: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 13. oktober 2012; Godkjent: 12 januar 2013; Publisert: 18 februar 2013
Copyright: © 2013 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt av Shandong-provinsen Higher Educational Science and Technology Program (J10LC66) og Natural Science Foundation National of China (Grant nr. 81102828, 81273037, 81202516). Forfatterne ønsket også å vise takknemlighet til Natural Science Foundation i Shandong-provinsen i Kina (No. ZR2011HM011). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest vanlige ondartede sykdommer i verden og den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i mange land. Tilnærmet 85% av lungekreft tilfeller tilhører ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) [1], [2]. Kjemoterapi er et viktig alternativ i herding eller kontrollere lungekreft. 5-fluorouracil (5-FU), som utøver sin anticancer virkning ved hemming av tymidylatsyntase og inkorporering av dets aktive metabolitter til RNA og DNA, slik som å påvirke uracil metabolisme og til slutt føre til apoptose i kreftcellen [3] . I de siste tiårene, 5-FU-baserte kombinasjonsterapier er standard behandling for mange pasienter diagnostisert med forskjellige ondartede svulster, inkludert NSCLC [4] – [6]. Men sammen med sin bruk, motstand mot 5-FU har blitt vanlig og har blitt anerkjent som en grunn for mange kreftformer terapi svikt [7], [8]. Derfor har mange forsøk blitt utført for å redusere motstanden og forbedre dets terapeutiske effektivitet. Selv om mange aggressive behandlinger, for eksempel nye medikamenter i kombinasjon med 5-FU, har bedre pasienter overlevelse, effekten av disse behandlingene er fortsatt langt fra tilfredsstillende i dag. Det er derfor ønskelig å finne mer hensiktsmessige terapeutiske muligheter for NSCLC. Heri, rapporterer vi induksjon av autophagy av 5-FU i humane NSCLC-A549 celler.
I løpet av de siste tiårene har apoptoseinduksjon vært viktig faktor i anti-kreft narkotika utvikling. Men kreftceller utløse flere veier å flykte fra apoptose [1]. Nylig, autophagy har vært mye studert i kreftterapi. I tillegg til sin rengjøring rolle i å fjerne misfoldede eller aggregerte proteiner, å fjerne skadede organeller og eliminere intracellulære patogener, har autophagy flere fysiologiske og patofysiologiske funksjoner i kreftterapi. Mange studier har fokusert på forholdet mellom autophagy og tumor patogenese, utvikling og behandling. Imidlertid synes autofagi å spille en paradoksal rolle i kreft celle overlevelse og død. I kjemoterapi, når celler støter noen anti-kreft narkotika, er autofagi talt til å beskytte kreftceller mot apoptose for celle overlevelse. Derfor autofagi er anerkjent som en cytoprotective prosessen [7], [9] – [11]; I mellomtiden har nylige studier vist at inhibering av autophagy induserer senket apoptotisk nivå, og derfor deltar autophagy i oppregulering av apoptose [12], [13]; Videre, i likhet med apoptose, er autophagy også en alternativ rute for programmert celledød, kalt type II programmert celledød [14] – [16]. Antagelig kan rollen til autophagy avhenge av tumortype og stimuli, graden av tumorigenese og apoptotisk status i tumorceller. Passende modifikasjon av autophagy, til inhibering av cytobeskyttende autophagy øke apoptose av tumorceller i respons til anti-kreftmidler kan forbedre effekten av kjemoterapi [9]. Derfor, i tillegg til apoptotisk respons, studiet av autophagy er en potensiell retning for utviklingen av anti-kreftlegemidler.
reaktive oksygenarter (ROS) spiller en viktig rolle i en rekke cellulære programmer under fysiologiske så samt patologiske tilstander. Når produsert i moderate mengder, ROS virke som signalmolekyler i signaltransduksjonsveiene for å regulere cellevekst, differensiering, overlevelse, inflammasjon og immunresponsen [17]. På den annen side, når overdrevet produsert, men de deler evnen til å påføre oksidativ skade på viktige biologiske molekyler, for eksempel DNA, lipider og proteiner, som endrer deres funksjonalitet og forårsaker svekkelse av cellulær integritet [18]. I de siste årene, montering bevis indikerer at ROS er innblandet i autofagi induksjons i kreftbehandling [19] – [21], noe som tyder på at ROS spiller en avgjørende rolle i respons til kreftbehandling, er deregulering av ROS dannelse assosiert med kreft initiering, progresjon og narkotika motstand.
i denne studien undersøkte vi mekanismen bak den anti-kreft effekt av 5-FU i A549 lungekarsinom. Har vi funnet at 5-FU indusert autophagy i A549-celler og inhibering av autophagy kan føre til forbedring av 5-FU-mediert apoptose. Videre viste vi den mekanismen som autofagi hemming sensibilisert celle til apoptotisk celledød var ved å øke dannelsen av ROS som til slutt lettet frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene, som senere forbedret caspase-avhengig apoptose.
Materialer og Metoder
Cell kultur
den menneskelige NSCLC celler A549 ble hentet fra den Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellene ble dyrket med RPMI-1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C under en fuktig atmosfære med 95 % luft og 5% CO
2. Celler i den logaritmiske vekstfase ble anvendt i denne studien.
Kjemisk Reagenser og antistoffer
5-FU, 3-MA, 3- (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5-diphnyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT), 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1) og 5- (og 6) karboksy-2’7»-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) ble alle kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Anti-LC3, anti-Beclin1, anti-p62, anti-cytokrom c, anti-spaltet caspase9, anti-spaltet caspase8, anti-spaltet caspase3 og anti-spaltede PARP-antistoffer ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) . Anti-aktin-antistoff og det andre antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Celler ble sådd ut i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /ml med 100 ul per brønn, inkubert i 24 timer og deretter utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU i de angitte tidsrom . Etter behandling, ble 20 ul MTT-løsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn og inkubert i en fuktet 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i 4 timer. Krystallene ble så oppløst i 100 pl dimetylsulfoksyd /brønn. Absorbansen av oppløsningen ble målt ved 490 nm med en mikrotiterplateleser (Bio-Tek ELX800). Cellelevedyktigheten ble beregnet i henhold til følgende formel: cellelevedyktighet (%) = A490 (prøve) /A490 (kontroll) x 100. Minst tre replikater ble utført for hver behandling.
immunfluorescens for LC3
Nivået LC3 ble undersøkt ved hjelp av en immunfluorescens analyse i henhold til vår forrige rapport [22]. Kort sagt ble A549-celler sådd ut på dekkglass. Etter behandling med 5-FU (10 uM) i 48 timer i nærvær eller fravær av 3-MA (5 mmol /L), ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 min. Etter fiksering ble cellene permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i 30 min og deretter blokkert med 2% BSA i 1 time ved romtemperatur. Etter blokkering, ble celler inkubert med anti-LC3 (1:400 fortynnet i BSA-buffer) antistoff ved 4 ° C over natten og deretter omsatt med fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-kanin-IgG (1:100 fortynnet i BSA-buffer) i 1 time ved 37 ° C. Kjernen ble farget med 1 umol /L DAPI (Sigma-Aldrich) i 5 minutter. Deretter LC3 puncta og farget kjerne ble oppdaget under en fluorescens mikroskop og fusjonert (Olympus, Japan).
Påvisning av sure vesikulær organeller (AVOS)
For å kvantifisere utviklingen av Avos, A549 cellene sådd ut i 24-brønners flatbunnede mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /ml med 1 ml per brønn og inkubert i 24 timer. Etter behandling med 10 uM 5-FU i 48 timer i nærvær eller fravær av 3-MA (5 mmol /L), ble cellene farget med 1 pM akridinorange ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, deretter vasket to ganger med PBS. Bilder av AO flekker ble visualisert umiddelbart med fluorescens mikroskop. For å kvantifisere antallet av sure vesikler i de behandlede celler, ble andre celler sådd ut i 6-brønns plater. Etter farging med AO i PBS ved 37 ° C i 15 minutter, ble cellene høstet, vasket to ganger i PBS og resuspendert i 200 ul PBS, deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri-analyse. Grønn (500-550 nm, FL1 kanal) og røde ( 650 nm, FL3 kanal) fluorescens, som ble belyst med blå (488 nm) lys eksitasjon, ble målt ved hjelp av flow cytometer med Cellquest analyse-programvare (Becton Dickinson)
apoptose deteksjon av flowcytometri
Påvisningen ble utført av AnnexinV-FITC apoptose Detection Kit (BD Biosciences, San Diego, USA). Breifly, Celler ble sådd i 6-brønns plater og inkubert i 24 timer og deretter eksponert for 10 uM 5-FU i 48 timer i nærvær eller fravær av 3-MA (5 mmol /L). Etter behandling, ca. 1 x 10
6-celler ble høstet, vasket to ganger i PBS, og deretter farget med Annexin V-FITC og PI i henhold til produsentens instruksjoner. Den resulterende fluorescens ble påvist ved strømningscytometri med Cellquest analyseprogramvare.
Mitokondriell membranpotensialet (MMP) Analyse
Verdiene av mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk JC-1-farging ifølge produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de behandlede-cellene samlet opp, vasket med PBS, og inkubert med 10 pM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. De positive celler ble deretter oppdaget av flowcytometeret med Cellquest analyseprogramvare.
Måling av reaktive oksygenforbindelser (ROS)
ROS-nivåer ble bestemt ved bruk av fluoriserende fargestoff 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Kort sagt ble de behandlede-cellene trypsinert, vasket og inkubert med 10 pM DCFH-DA i 30 min i mørket, og intensiteten av fluorescens ble etterfulgt av flowcytometer med Cellquest analyseprogramvare.
Måling av cytokrom c Slipp
i mitokondriene fraksjonen og cytosol fraksjonen ble utarbeidet av ulike sentrifugering som Jie Li, MD beskrevet [3]. Kort sagt ble de behandlede-cellene høstet og vasket to ganger med PBS, deretter ble resuspendert i en sukrose-buffer (250 mM sukrose, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7,5 supplementert med 1 mM PMSF, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A, 5 ug /ml aprotinin og 5 mM DTT) på is i 30 min. Cellene ble homogenisert og deretter sentrifugert ved 1000 g i 10 min ved 4 ° C for å fjerne kjernene og ubrutte celler. Mitokondriene fraksjon ble deretter pelletert ved sentrifugering ved 10.000 g i 20 min ved 4 ° C. Supernatanten ble sentrifugert videre ved 100.000 g i 60 min ved 4 ° C for å få cytosol fraksjonen.
Caspase aktivitetsanalyse
Aktiviteten av caspaser-3 ble målt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige caspase kolorimetrisk analyse kits (Beyotime, Kina). I korthet, etter behandlingen med angitte midler, ble A459 cellene høstet og vasket med PBS ved sentrifugering ved 600 g i 5 min ved 4 ° C. Cellepelletene ble resuspendert i lyseringsbuffer og stå på is i 15 min. Lysatene ble sentrifugert ved 160000 g i 10 min ved 4 ° C og supernatanten ble oppsamlet for caspase 3 aktivitetsanalyse i lyseringsbuffer inneholdende Ac-DEVD-pNA i henhold til kits instruksjoner. Konsentrasjonen av pNA ble målt ved 405 nm med en mikrotiterplateleser, som benyttes som en indikasjon på kaspase 3 aktivitet.
Western blot-analyse
A549-celler, inkubert med de respektive forhold, var høstet og lysert. En lik mengde protein ble separert ved SDS-PAGE (5-15%) og overført til PVDF-membraner. De blottet Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time og deretter inkubert med de ønskede primære antistoffer (fortynning 1:1000) over natten ved 4 ° C. Da de immunoreaktive bånd ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert IgG sekundære antistoffer. For å kvantifisere lik belastning, ble membranen reprobed med β-aktin-antistoff.
Undersøkelse av autophagosome ved TEM
A549-celler ble fiksert i 2,5% glutaraldehyd ved 4 ° C over natten, og postfiksert med 1% OsO
4 i 1,5 timer. Deretter ble cellene farget med 70% etanol mettet med uranyl-acetat, etterfulgt av dehydrering gradient med etanol-aceton, og endelig innleiret i epoksyharpiks for delen. De supertynne seksjoner ble dobbelt farget av uranylacetat og føre citrate og analysert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
RNA interferens fra Atg7
Atg7 RNA interferens ble oppnådd ved trans A549 celler med Atg7- målrettet siRNA og Universal kontroll siRNA (Invitrogen, 100 pmol /brønn). Korte oligo-RNA ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Etter 24 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med 5-FU i ytterligere 48 timer. Deretter ble cellene samlet og cellelysater ble utsatt for immunblotting av Atg7, LC3 og PARP. Celler ble også behandlet for cellenes levedyktighet og apoptose analyse.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n≥3). Statistisk analyse mellom de to gruppene ble beregnet ved bruk av Student t-test, og flere grupper ble utført ved 10,0 SPSS-programmet.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
5-FU hemmer celledeling i A549 celler
For å undersøke 5-Fluorouracil s potensiell cellevekst-inhibering i A549-celler, ble effekten av 5-FU-behandling på celler undersøkt med et MTT-assay. Som vist på fig. 1A, 5-FU (0-200 uM) ga en dose- og tidsavhengig reduksjon av A549 cellevekst. IC50 i 48 timer av 5-FU behandling i A549-celler var 10,32 ± 0,69 uM. Basert på resultatet, ble 10 pM av 5-FU i 48 timer i A549-celler brukt for videre eksperimenter. I tillegg morfologiske endringer indikerte også at 5-FU behandling ble redusert celletetthet. Interessant, gjorde 5-FU-behandlede cellene ikke dukke opp svært åpen apoptotiske tegn, men mange vakuoler i cytoplasma (Fig. 1B). Dette fikk oss til å undersøke hvorvidt 5-FU indusert autofagi var også inkludert i lungekreftceller.
(A) Celleviabilitet ble bestemt ved MTT-analyse etter behandling med ulike konsentrasjoner av 5-FU i 24 timer og 48 timer . IC50 ble beregnet fra IC50 programmet. (B) Morfologiske forandringer ble observert etter behandling av cellene med 10 umol /l 5-FU i 48 timer ved Invertert mikroskop (Olympus, Japan). Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
5-FU induserer autofagi i A549 celler
Deretter ble transmisjonselektronmikroskopi brukes til å kontrollere dannelsen av autophagosomes i 5- FU behandlede celler. Som vist i figur 2A, behandling med 5-FU i 6-48 timer forårsaket av opphopning av autophagic vakuoler, som oppviste autophagosome og /eller autolysosomal egenskaper, mens bare noen vakuoler ble observert i kontrollceller. Autophagy-spesifikke markører LC3, Beclin-1 og p62 ble også brukt til å undersøke autophagic nivåer og autophagic fluksen i denne prosessen ved immunblotanalyse. Som vist på fig. 2B, opp-regulering av Beclin-1, den nedregulering av p62 og omdannelsen av LC3 I /II viste økende dannelsen av autophagosomes i en tidsavhengig måte i A549-celler.
A549-celler ble behandlet med 10 umol /l 5-FU til forskjellig tid, som angitt, så autophagosomes og autophagic nivåer ble registrert. (A) Dannelse av autophagosomes i behandlede celler ble undersøkt med TEM. (B) LC3, Beclin-en og p62 ble undersøkt ved western blot. β-actin var en lasting kontroll. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Deretter For ytterligere å bevise autofagi indusert av 5-FU, innførte vi 3-MA, som er et populært hemmer autophagy [3 ]. 5 mM 3-MA ble tilsatt til A549-celler i 1 time før 5-FU eksponering. Celler ble delt inn i fire grupper: kontroll (ingen behandling), 3-MA (behandlet med 3-MA), 5-FU (behandlet med 5-FU), og kombinasjonen (behandlet med begge av 5-FU og 3-MA) . Flow-cytometri ble utført etter farging av cellene med akridinorange for kvantifisering av avos. Resultatene viste at antallet av sure vesikler i 5-FU gruppe økt selvsagt, som ble inhibert av 3-MA, bekrefter induksjon av autophagy (Fig. 3A og C). Lignende resultater ble også oppnådd på fluorescens mikroskopisk undersøkelse. Som vist på fig. 3B, A549-celler behandlet med 5-FU i 48 timer viste et stort antall fluorescerende vesikler i cytoplasma, mens bare noen få av fluorescerende vesikler ble observert i kontrollgruppen, 3-MA gruppe og kombinasjonsgruppen. I tillegg, LC3 immunfluorescens og immunoblot ble også utført. Fluorescens mikroskopi avslørte punktformet fordeling av LC3 fluorescens forbedret i 5-FU gruppe (Fig. 3D). Western blot indikerte også at uttrykket av LC3 i kombinasjonsgruppen delvis tilbakestilles til den opprinnelige tilstand på samme tid, noe som reflekterer den effektive inhiberende effekt av 3-MA (fig. 3E). Disse resultatene beviste at autophagy ble indusert i 5-FU-behandlede A549-celler. Derfor bestemte vi oss for å undersøke om hemming av autofagi påvirker følsomheten av A549 cellen til 5-FU behandling.
Celler ble forbehandlet med 5 mmol /L 3-MA i 1 time før eksponering for 10 mikromol /L 5-FU i 48 timer, deretter akridinorange ble anvendt for å farge avos ble fluorescens-aktivert celler analysert ved flow-cytometri (A). Etter behandling ble cellene farget med acridinoransje for AVO observasjon. Cellene ble visualisert under et rødt filter fluorescens mikroskop (B). TO kvantifisering av celler utvikler AVO i A549-celler, ble prosentandelen av utviklet avos beregnet på grunnlag av resultatene av fluorescens-aktivert cellesorteringsanalyse (C). Fluorescerende mikroskop ved immunofluorescens farging for LC3 i den behandlede A549-celler (D). Western blot-analyse ble utført for å påvise LC3 proteinnivåer. Blottene ble på nytt viste med anti-β-actin som en lastekontroll (E). Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Autophagy inhibering forbedrer 5-FU-indusert apoptotisk celledød
Først, for å undersøke hvorvidt inhiberingen av autophagy sensitizes A549-celler til 5-FU-indusert celledød, ble effekten av behandlingen undersøkes med MTT-analyse (fig. 4A). I kombinasjonsgruppen, levedyktigheten av A549 celler ble redusert hurtigere enn i den 5-FU gruppe, kombinasjonsgruppen drev 65,75% av cellene til døden, om en 39,28% økning som i 5-FU gruppe. Selv om celle-levedyktighet i 3-MA gruppe også redusert, i den grad var ikke signifikant. Disse resultatene indikerte at 3-MA forbedrer 5-FU-indusert celledød i A549-celler. Deretter for å validere den observasjon at inhibering av autophagy påvirker celle-sensitivitet overfor 5-FU, Annexin V-FITC og PI-farging ble utført. Strømnings cytometic analyse viste at antallet AV- og AV /pi-positive celler signifikant økt i kombinerte behandlingsgruppen enn 5-FU-bare behandlingsgruppen (fig. 4B). For ytterligere å bekrefte dette, bødlene, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og PARP ble deretter undersøkt. I 5-FU-behandlede grupper, de var alle splittet i sine spesifikke aktive former, og aktiviteten i 5-FU-behandlede celler med hemmet autofagi var betydelig høyere enn i celler behandlet med 5-FU alene (fig. 4C).
Celler ble forbehandlet med 5 mmol /l 3-MA i 1 time før eksponering til 10 umol /l 5-FU i 48 timer. (A) Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av et MTT-assay. Data representerer hjelp av fire uavhengige forsøk. (B) Celle dødeligheten ble analysert av Annexin V-analysen ved strømningscytometri, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (C) Cellelysater ble fremstilt og underkastet immunblotting med antistoffer mot kaspase-9, caspase-8, caspase-3, PARP, og β-aktin. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Rollen autofagi i 5-FU-mediert cytotoksisitet ble videre undersøkt ved å banke ned Atg7 uttrykk ved hjelp siRNA. Som vist på fig. 5, uttrykk for Atg7 ble markert undertrykt i A549 celler transfektert med Atg7 siRNA men ikke de med (5A fig.) Kontroll siRNA. Følgelig celler transfektert med Atg7 siRNA viste redusert nivå av LC3-II-akkumulering og øket nivå av clPARP etter 5-FU behandling (Fig. 5A). I tillegg ble den cytotoksiske virkning av 5-FU betydelig øket ved å blokkere Atg7 ekspresjon og pancaspase inhibitor Z-VAD-FMK reddet celledød (Fig. 5B). Likeledes er graden av apoptose indusert av 5-FU ble også forbedret når banket ned Atg7 ekspresjon og Z-VAD-FMK redusert celle apoptose signifikant (fig. 5C). Som oppsummert i fig. 5, knockdown av Atg7 også akselerere apoptose indusert ved 5-FU. Disse resultatene var i samsvar med anvendelse av 3-MA, som viser at autofagi indusert av 5-FU spiller en beskyttende rolle av tumorceller mot apoptose, og blokkering av autophagy senere forbedret apoptose gjennom aktivering av kaspaser i A549-celler.
Celler ble transfektert med Atg7-målrettet siRNA og kontroll siRNA i 24 timer før eksponering til 10 mmol /l 5-FU i 48 timer. (A) Cellelysater var forberedt og utsatt for immunblotting med antistoffer mot LC3, Atg7, PARP, og b-aktin. (B) Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. (C) apoptotisk celledød ble analysert av Annexin V /PI assay. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Endring av mitokondriemembranen potensial og frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene
Tidligere studier viste at aktiveringen av caspases ble drevet av cyt -c gjennom indre mitokondrie-apoptotisk reaksjonsvei [23], [24]. Derfor ble effekten av inhiberte autophagy på 5-FU-formidlet frigivelse av cyt-c fra mitokondrier inn i cytosol undersøkt ved hjelp av cellefraksjonering. Resultatene som oppnås vi vist at inhibering av autophagy i 5-FU-behandlede celler førte til en drastisk økning i akkumuleringen av cytokrom c i cytosol (Fig. 6A). Effekten på mitokondrier ble også bekreftet ved en nedgang i mitokondriemembranpotensialet. Som vist på fig. 6B, inhibering av autophagy i 5-FU-behandlede celler induserte en tydelig reduksjon av mitokondriemembranpotensialet. Disse dataene tyder på at tap av mitokondriemembranen potensialet kan være nødvendig for 5-FU kombinert tre-MA indusert cyt-c utgivelse i cytosol, som senere utløste aktivering og spalting av caspases og resulterte celle apoptose.
Celler ble behandlet som i fig. 3. (a) mitokondrier og cytosol fraksjoner ble isolert som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder, og deretter ble utsatt for immunblotting for påvisning av cytokrom c. (B) Den MMP-endringen ble vurdert ved JC-1-farging ved strømningscytometri, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Hemming av autofagi stimulerer ROS-formasjonen, som er nødvendig for 5-FU-mediert apoptose i A549 celler
Nylig, flere rapporter gitt bevis for involvering av reaktive oksygenarter (ROS) i induksjon av apoptose og autophagy og vist betydningen av ROS i frigjøring av cyt-c fra mitokondrier [25], [26]. Derfor bestemte vi oss for å analysere om hemming av autofagi kan stimulere produksjonen av ROS i 5-FU-behandlede A549 celler. De behandlede-celler ble farget med klormetyl-2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (CM-H2-DCFDA), et celle gjennomtrengelig fluorescens fargestoff som reagerer på et bredt spekter av ROS. Som vist i figur 7A, ble ROS-nivåer øket åpenbart i cellene behandlet med 5-FU i kombinasjon med 3-MA sammenlignet med 5-FU alene ved flowcytometri, og en slik økning ble effektivt svekket når cellene ble forbehandlet med 10 mM N- acetylcystein (NAC) i 1 time. Siden nivået av ROS var forhøyet i celler med undertrykt autophagy, vi videre analysert hvorvidt inhiberingen av ROS påvirket 5-FU-mediert celledød. For dette formål ble ROS formasjon hemmet av NAC og apoptose ble målt ved flow-cytometri. Som vist i figur 7B, sensibilisering av celler til 5-FU-indusert celle apoptose ble fullstendig blokkert ved å hindre ROS formasjonen. Til slutt, undersøkte vi hvorvidt inhiberingen av ROS påvirket kaspase-aktivitet og frigjøringen av cyt-c. Faktisk, scavenging av ROS hemmet caspase-3-aktivitet, hindret utgivelsen av cyt-c fra mitokondriene, og reddet A549 celler fra 5-FU-mediert apoptose (Fig. 7C og D). Disse resultatene klart indikerte at genereringen av ROS spille en viktig rolle i regulering av celle-død som respons på 5-FU.
Celler ble forbehandlet med 10 mM NAC i 1 time før 10 umol /l 5-FU ( 48 h) behandling i nærvær eller fravær av 3-MA. (A) ROS generasjonen ble påvist ved anvendelse av DCFDA av et flowcytometer. Data ble behandlet med Cellquest-programvare og analysert ved densitometri. (B) Celledød ble målt ved hjelp av Annexin V /PI farging. (C) Caspase-3-aktivitetsanalyse ble utført som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (D) Den cyt-c nivå i cytosol fraksjon ble påvist ved immunblotting. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I lungekreft, kjemoterapi mye brukt til å helbrede og utvide postoperativ overlevelse hos pasienter. 5-fluorouracil (5-FU) er effektivt brukt som et medikament i behandlingen av en rekke humane kreft, inkludert lungekreft. Den store underliggende mekanismen sin antitumor aktivitet har blitt tilskrevet forstyrrelser av DNA og RNA syntese. I de siste tiårene har apoptoseinduksjon med 5-FU vært viktig faktor i kreftbehandling [27] – [29]. Nylig har autophagy blitt omfattende observert hos 5-FU-behandling [3], [7], [30] – [32]. I vår studie fant vi at 5-FU kan hemme A549 celleproliferasjon åpenbart (Fig. 1A), som inkluderte celle autofagi og apoptotisk celledød (Fig. 2,3,4 og 5). Våre resultater viste også at både LC3-II og Beclin1, som har vært ansett som markør for autophagy [33], ble signifikant økt etter 5-FU behandling i A549-celler ledsaget av nedregulering av p62 ekspresjon (Fig. 2B). I mellomtiden, den økende dannelsen av autophagosomes og /eller autolysosomal med tid detektert av TEM (Fig. 2A) og den økte dannelsen av den karakteristiske avos i cytoplasmisk gitt ytterligere to tegn (fig. 3A-C). Alle disse resultatene indikerte at autofagi ble indusert ved 5-FU.
Autophagy er en intracellulær degradering bulk system som finnes overalt i eukaryoter, som er ansvarlig for nedbrytningen av de fleste langlivede proteiner og noen organeller. Cytoplasmatiske bestanddeler, inkludert organeller, er sequestered til dobbelt membraned autophagosomes og deretter sikring med lysosomer å danne autolysosomes hvor innholdet blir degradert. De nedbrutte produkter resirkuleres til cytoplasma for ny anvendelse [34]. Autophagy er stimulert som respons på ytre belastninger og interne behov for å opprettholde cellulær metabolisme, så vel som overlevelsen. Likevel kan autophagy også føre til celledød, kalt «autophagic celledød» (programmert celledød Type II) gjennom over selv-fordøyelse og nedbrytning av essensielle cellulære bestanddeler som under visse omstendigheter [18], [35]. Nylig har en økende mengde bevis indikerer hvilken rolle autophagy i kreft formering og respons på behandling. Men i kreft kjemoterapi, synes autofagi å spille en motstridende rolle, sannsynligvis fremme eller hemme apoptose i kreftcelleoverlevelse og død [9]. For å undersøke bidraget fra autophagy i ferd med 5-FU-indusert A549 celle apoptose, anvendte vi autophagy inhibitor 3-MA, en spesifikk inhibitor av for tidlig stadium autophagic prosessen, i denne studien. Som forventet, 3-MA inhiberte 5-FU-indusert autofagi (fig. 3). Autophagy inhibering forbedret 5-FU-indusert celle apoptose gjennom caspaser aktivering i A549-celler (fig. 4). For ytterligere å klargjøre rollen autophagy i 5-FU-indusert celledød A549, brukte vi Atg7 siRNA å slå ned Atg7 og undersøkt rollen til autophagy mer direkte. I samsvar med resultatene ved anvendelse av 3-MA, transfeksjon av Atg7 siRNA effektivt hemmet LC3-II akkumulering, økt clPARP produksjon og forbedret apoptotisk celledød indusert av 5-FU i A549-celler (Fig. 5).
