Abstract
Dynamisk crosstalk mellom vekstfaktor-reseptorer, celleadhesjonsmolekyler og ekstracellulære matrise er avgjørende for kreft celle migrasjon og invasjon. Inte er transmembrane reseptorer som binder ekstracellulære matrix proteiner og muliggjør celle adhesjon og cytoskeletal organisasjon. De kan også mediere signaltransduksjon for å regulere celleproliferering og overlevelse. Typen en insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGF-IR) formidler tumorcellevekst, adhesjon og hemming av apoptose i flere typer kreft. Vi har tidligere vist at β
1 inte regulere forankringsuavhengig vekst av prostata kreft (PRCA) celler ved å regulere IGF-IR uttrykk og androgen reseptor-mediert transkripsjons funksjoner. Videre har vi nylig rapportert at IGF-IR regulerer ekspresjonen av β
1 griner i PRCA celler. Vi har dissekert den mekanisme som IGF-IR regulerer β
1 inte uttrykk i PRCA. Her rapporterer vi at IGF-IR er avgjørende for PRCA cellevekst og at β
1 inte bidra til regulering av spredning av IGF-IR. Vi viser at β
1 inte regulering av IGF-IR forekommer ikke på mRNA-nivå. Eksogent ekspresjon av et CD4 – β
1 inte cytoplasmatiske domene kimæren ikke interfererer med slik regulering og unnlater å stabilisere β
1 integrin-ekspresjon i fravær av IGF-IR. Dette synes å være på grunn av mangel på interaksjon mellom β
1 cytoplasmatiske domene og IGF-IR. Vi viser at IGF-IR stabiliserer β
en underenhet ved å beskytte den fra proteasomal degradering. Den α
5 subenhet, en av bindingspartnerne til β
1, er også downregulated sammen med β
1 på IGF-IR knockdown mens ingen endring er observert i ekspresjonen av α
2 , α
3, α
4, α
6 og α
7 subenheter. Våre resultater viser en avgjørende mekanistisk rolle for α
5β
1 inte, nedstrøms av IGF-IR, i regulering av kreft vekst
Citation. Sayeed A, Fedele C, Trerotola M, Ganguly KK , Languino LR (2013) IGF-IR Fremmer prostatakreft Vekst av Stabiliserende α
5β
1 inte protein nivåer. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10,1371 /journal.pone.0076513
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 03.07.2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 09.10.2013
Copyright: © 2013 Sayeed et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kontrakts tilskudd sponse: NIH; Kontrakts tilskuddet Nummer: R01 CA-89720 og CA-109 874 (til LRL), P01 CA-140043 (til LRL); American Cancer Society (ACS) -IRG-08-060-04 (til AS); Kontrakts bevilgning sponsor: Pennsylvania Department of Health. Dette prosjektet er også finansiert delvis under en Commonwealth University Research Enhancement Program tilskudd med Pennsylvania Department of Health (H.R.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dr. Languino, tilsvarende forfatter, er en redaksjonell styremedlem for PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Adhesjon av celler til ekstracellulære matriks (ECM) er først og fremst formidlet av inte og er avgjørende for cellevekst og overlevelse. Integriner heterodimere er transmembrane reseptorer, bestående av a og p-underenheter, som er ikke-kovalent forbundet; de fysisk kobling ECM til det intracellulære aktin cytoskjelettet, men er også i stand til å transdusere signaler i to retninger på tvers av plasmamembranen [1]. Ved å binde seg til ECM ligander er inte aktivert og i stand til å regulere cellulære funksjoner ved å initiere intracellulære kaskader av signalering. Så langt, 24 integrin heterodimerer, 18 α og 8 β-subenheter og fem β
1variantsubunits β
1Aβ
1Bβ
1Cβ
1C-2 og β
1D, generert av alternativ spleising , er blitt beskrevet [2], [3]. Integriner er viktige regulatorer av vekst, differensiering, overlevelse, migrering og invasjon [4], [5]. Det har blitt rapportert at utviklingen av prostatakreft (PRCA) til avanserte stadier er knyttet til endringer i integrin uttrykk profiler [6], [7], [8].
Trasé av integrin og vekstfaktor signale er antatt å være mekanistisk koblet fordi celle adhesjon til ECM er avgjørende for celler til å svare på visse vekstfaktorer [9]. Vekstfaktor signale kan forstyrre fokale sammenvoksninger, de antatte områder av integrin-mediert signalisering [9] og følgelig modulere integrin-celleadhesjon og bevegelighet. Fysiske og funksjonelle interaksjoner mellom integriner og komponenter til vekstfaktor signalveier, inkludert insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1) eller dets nedstrøms signaliseringsproteiner [10], [11], er blitt rapportert. Vårt laboratorium har vist at β
1 griner selektivt å modulere type 1 insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGF-IR) -mediert signalering og funksjoner i PRCA [10], [12]. IGF-1 er også blitt rapportert å fremkalle adhesjon og migrering i humane multiple myeloma-celler dels via aktivering av β
1 griner [13]. Videre konstitutivt aktiv beta
1 inte fremme malign fenotype i PRCA celler og målretting dem ble rapportert å hemme PRCA metastase [14].
IGF-1 er en enkelt kjede polypeptid som i tillegg til sin mer klassisk endokrine rolle, medierer autokrin eller parakrin vekst og således virker som en potent vekst og overlevelsesfaktor. IGF-1 frembringer sine virkninger på celler ved å binde seg til sin reseptor, IGF-IR. IGF-IR er en heterotetrameric transmembrane glykoprotein med tyrosinkinase-aktivitet [15]. Insulinreseptoren substrat (IRS) proteiner fungere som konkrete docking proteiner for IGF-IR og insulinreseptoren (IR) [16]. IRS1 og IRS2 inneholder ikke iboende kinase aktivitet, men snarere funksjon ved å rekruttere proteiner til overflaten reseptorer, hvor de montere signalkomplekser. Signalering fra IRS proteiner resulterer i aktiveringen av veier, inkludert fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) [17], [18]. Interessant er begge veier også kjent for å bli aktivert av integrin inngrep [19], [20]. Sammenhengen mellom integriner og IRS1 har vært foreslått som en mulig mekanisme for synergistiske virkningen av vekstfaktor og ekstracellulære matriks-reseptorer [21]. IGF-1-signalisering er blitt rapportert å være regulert av en negativ tilbakekoblingsmekanisme via ubikvitin /proteasom-mediert nedbrytning av IRS2, hvorved størrelsen og varigheten av respons på insulin eller IGF-1 reguleres [22]. Vårt laboratorium har nylig vist at β
1 griner regulere IGF-IR-ekspresjon og er kritisk for IGF-1-mediert økning av androgen reseptor (AR) aktivitet [23]. Vi har også rapportert at IGF-IR tett regulerer β
1 inte uttrykk i PRCA celler [24] men mekanismen bak denne reguleringen er ennå ikke karakterisert.
Til tross for den begrensede enighet om nivåene av IGF- IR uttrykk i godartet og ondartet prostata epitel, flere kliniske studier rettet mot IGF-IR i ulike tumorer, inkludert PRCA, er i gang. Identifisering og forstå nedstrøms effektorer av IGF-IR ville bidra til bedre å definere den funksjonelle rollen til IGF-1 akse i PRCA. Gitt rapporterte bevis for sterk fysisk og funksjonelt samspill mellom β
1 griner og IGF-IR, denne studien undersøkte mekanisme som IGF-IR regulerer β
1 griner. Vi rapporterer en roman vei av crosstalk mellom IGF-IR og β
1 griner, som fremmer kreftcelle spredning, og vise at IGF-IR stabiliserer α
5β
1 inte ved å beskytte den fra proteasomal degradering.
Materialer og metoder
reagenser og antistoffer
følgende reagenser ble brukt. Opti-Mem og oligofectamine (alle fra Invitrogen, CA), syntetiske androgen R1881 (Perkin-Elmer, CA), proteinaseinhibitorer (Sigma, MO), rekombinant IGF-1 (R til a
2 inte (Abcam, Cambridge, UK); til a
7 inte (8G2, EMD, NJ). Rat mAb til CD4 ble kjøpt fra Santa Cruz, CA. De følgende kanin polyklonale antistoffer (PABS) ble anvendt: til IGF-IR (IGF-IR-β sc713), for å AKT og til ERK1 /2 (fra Santa Cruz, CA); å survivin (Novus Biologicals, CO). Rabbit PABS til a
3, α
4, og α
5 spesifikk for den C-terminale domenet til hver underenhet, var en slags gave fra Dr. E. Ruoslahti, University of California Santa Barbara, Sanford -Burnham Medical Research Institute, CA. Den α
6 Ab (AA6A) spesifikk for den C-terminale domene av menneskelig α
6 inte var en slags gave fra Dr. Anne Cress, University of Arizona, AZ. SiRNA oligonukleotider benyttet i denne rapporten har blitt beskrevet før [24].
Cells
LNCaP og C4-2B celler ble kjøpt fra ATCC. Celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i RPMI-1640 supplert med 5% FBS og 1% hver av natriumpyruviat, Hepes og ikke-essensielle aminosyrer. For å evaluere effekten av agonister, etter transfeksjon ble cellene sultet med 2% trekull-strippet serum (CSS) inneholdende medium i 24 timer fulgt av ligand stimulering for ytterligere 24 timer. PC3-celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i RPMI-1640 supplert med 10% FBS. PC3-CH1, PC3-CH2 og PC3-Ch β
1C celler som anvendes for induserbar ekspresjon av chimeriske konstruksjoner er blitt beskrevet tidligere [25], [26]. Celler ble serum-sultet i 24 timer og behandlet med 75 mM ZnSO
4 i 6 timer. Den Ch1 kimære konstruksjon inneholder den ekstracellulære domene av muse-CD4 og de transmembrane og cytoplasmatiske domener av β
1A integrin; Ch β
1C konstruksjon (anvendt som en kontroll) er samme som Ch1 med unntagelse av at β
1A integrin-kodende regionen er erstattet av β
1 C-kodende region. Ch2-konstruksjon representerer en annen kontroll og bærer det ekstracellulære domene av muse-CD4 koblet til det transmembrane domenet av β
1 integrin-subenhet. Alle konstruksjonene er uttrykt under kontroll av mus metallotionein-1-promoteren og ekspresjon av kimære varianter induseres ved tilsetning av ZnSO
4 til vekstmediet.
Transient transfeksjon siRNA
Transient transfeksjon av celler med siRNA-oligonukleotider ble utført som beskrevet [23]. Inverted-IGF-IR siRNA ha en invers mål sekvens av IGF-IR siRNA fungerte som kontroll.
spredningsanalyse
LNCaP og C4-2B celler ble transient transfektert med kontroll eller IGF-IR siRNA . Tjuefire timer post-transfeksjon ble cellene trypsinert og analysert for effektiviteten av IGF-IR og β
1 integrin nedregulering. Transfekterte celler ble tellet og re-belagt i tre paralleller i 6-brønners plater ved 3 x 10
4 celler pr brønn i 2% CSS-holdig medium i nærvær av 1 nM R1881. Levende celler ble talt for neste tre påfølgende dager etter hemocytometer. Bilder av levende celler ble tatt på dag 2 og 3 før de blir høstet for telling.
Anchorage uavhengig vekst analysen
LNCaP celler ble belagt og transfektert med kontroll eller IGF-IR siRNA i kombinasjon med enten vektor alene, pBJ1, eller en pBJ1-β
1 konstrukt [27]. Tjuefire timer senere ble cellene trypsinisert og sådd ut i myk-agar i 6-brønners skåler ved 5000 celler /brønn. Cellene ble tillatt å vokse i to uker og koloniene telles. Kolonien størrelse ble målt ved hjelp av et okular utstyrt med en måletrådkors og koloniene med størrelse på 0,1 mm ble tellet i forskjellige prøver. Koloniene ble fiksert og farget med krystallfiolett og bilder av kolonier ble tatt til fange av stereomikroskop.
Immunpresipitasjon og Immunoblotting
Immunpresipitasjon av PC3 celler ble utført som beskrevet tidligere [28]. Cellelysater ble anvendt for immunblotting som beskrevet [12]. For å analysere PC3 cellelysater transfektert med chimeriske konstruksjoner ble PC3-CH1 og PC3-CH2-celler transfektert med kontroll eller IGF-IR siRNA og 24 timer senere ble cellene dyrket i serumfritt medium i 24 timer, etterfulgt av behandling med 75 mM ZnSO
4 i 6 timer og deretter, høstet for immunoblotting. Intensiteten av hvert band ble evaluert av ImageJ analyse og normalisert med lasting kontroll.
FACS analyse
PC3-CH1 og PC3-CH2-celler ble behandlet som ovenfor og høstet for FACS analyse. Cellene ble farget med 1 pg /ml Ab til CD4 eller rotte-IgG som negativ kontroll, etterfulgt av farging med FITC-konjugert sekundært Ab. Expression-profiler ble anskaffet ved hjelp FACS Calibur instrument (BD) og data ble analysert ved FlowJo programvare (Tre stjerners Inc., OR).
Proteasomal inhiberingsassayet
LNCaP celler ble transfektert med kontroll eller IGF -IR siRNA og 24 timer senere ble cellene sultet i 2% CSS-inneholdende medium i 24 timer. Celler ble behandlet med 1 nM R1881 med eller uten 10 mM MG132 i 6 timer. PC3-2-celler ble transfektert på samme måte som LNCaP-celler og 24 timer etter transfeksjon ble behandlet med 10 uM MG132 for enten 6 eller 24 timer og analysert ved immunblotting. For spesifikk hemming av proteasom-funksjonen ved hjelp av epoxomicin, ble LNCaP-celler transfektert som ovenfor, sultet med 2% CSS-inneholdende medium i 24 timer, etterfulgt av behandling med 1 nM R1881 sammen med 0, 100, 250 eller 500 nM epoxomicin i 18 timer og høstet. Lysater ble analysert ved immunblotting. Relative bandet intensiteter av β
1 inte subenheter
Kvantitativ Real Time PCR
Real time PCR-analyse ble utført som beskrevet tidligere [23]. Hver reaksjon ble utført, i det minste i tre eksemplarer; standardavvik og signifikans ble beregnet ved hjelp av Excel (Microsoft) programvare. Sekvensene til oligoer som benyttes er som følger: β
1 integrin, (sense: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, antisense: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, sense: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, antisense: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (sense: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, antisense: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-aktin, (forstand: TCCATCATGAAGTGTGACGT, anti: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).
Statistisk analyse
Statistisk signifikans (P-verdi og t-test) mellom datasettene ble beregnet ved hjelp av Excel (Microsoft) programvare. En to-sidig P-verdi av ≤0.02 ble betraktet som statistisk signifikant. Resultatene ble plottet på en graf ved hjelp DeltaGraph 4,5 (RockWare) programvare.
Resultater
Tap av IGF-IR og β
1 inte hemmer spredning av PRCA celler
Vi har tidligere vist at β
1 integriner er avgjørende for IGF-IR-mediert c ancer celleproliferasjon [10]. Siden IGF-IR tett regulerer β
1 inte uttrykk, vurderte vi den direkte effekten av IGF-IR uttømming på celleproliferasjon. LnCap og C4-2B cellene ble transient utarmet av IGF-IR og re-belagt i 2% CSS-holdig medium i nærvær av 1 nM syntetisk androgen (R1881). Tap av IGF-IR påfallende inhiberer celleproliferasjon i begge cellelinjene (
* P 0,02) (figur 1A, topplater.). Redusert ekspresjon av IGF-IR og β
1 integrin-underenheter for begge cellelinjer ble bekreftet ved immunoblotting (Fig. 1A, nedre paneler). R1881 ble anvendt for å forbedre uttrykket nivåer av IGF-IR og β
1, og for å forsterke effekten av disse reseptorer på proliferasjon. Signifikante effekter på celle-proliferasjon ble også observert i fravær av R1881 i LNCaP og C4-2B celler etter IGF-IR uttømming (data ikke vist). Redusert celletetthet i kulturbetingelser er tydelig observert ved analyse av C4-2B celler med redusert IGF-IR og p
1-nivåer sammenlignet med celler med endogen ekspresjon av begge reseptorer (Fig. 1B). Representative celle tetthet bilder av dag 2 og dag 3 spredning analysene er vist. Disse data viser at IGF-IR og β
1 integriner er avgjørende for spredning av PRCA celler.
(A) LNCaP og C4-2B-celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller IGF-IR siRNA og 24 time senere ble cellene trypsinisert og tellet. Celler ble utsådd i tre paralleller ved 3 x 10
5 celler per brønn i 6-brønners plater med 2% CSS-holdig medium i nærvær av 1 nM R1881, høstet og tellet på dag 1, 2 og 3 etter re-plating . Hver eksperimentelle analyse ble utført i tre paralleller og Feilstolpene representerer standardavviket fra tre uavhengige verdier (
* P 0,01), i forhold til de respektive styre siRNA behandlinger. En parallell sett LNCaP og C4-2B cellelysater ble analysert for effektivisering av IGF-IR og β
1 inte subenhet downregulation av immunoblotting (nedre paneler). (B) Representative bilder av relative C4-2B celletettheter på dag 2 og dag 3 er vist.
Eksogene uttrykk for β
1 inte subenheten gjenoppretter den reduserte forankringsuavhengig vekst av PRCA celler ved IGF-IR downregulation
funnene som IGF-IR regulerer β
1 inte uttrykk og at oppheving av IGF- IR kompromittert veksten av kreftceller, bedt oss om å undersøke hvorvidt β
1 integriner spiller en rolle i IGF-IR-mediert vekstregulering. For å bestemme om β
1 inte ekspresjon ville reversere inhiberingen av forankrings-uavhengig vekst indusert av IGF-IR-uttømming ble LNCaP-celler transfektert med IGF-IR siRNA, med eller uten β
1 integrin cDNA, og lov til å vokse og danne kolonier i myk-agar for to uker. IGF-IR uttømming reduserer veksten av kolonier i soft-agar (
** P 0,01) (figur 2).. Eksogene ekspresjon av β
en subenhet imidlertid reduserer delvis den veksthemming indusert av IGF-IR knockdown målt i antall kolonier med størrelse ≥100 um (
* P 0,02). Representative bilder av levende kolonier ble tatt opp med et invertert mikroskop og er vist i den nedre platen (fig. 2). Disse data underbygger rolle β
1 integriner i IGF-IR-medierte regulering av vekst i PRCA celler.
LNCaP-celler ble ko-transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA og med enten pBJ1 -β
en konstruksjon eller kontroll vektor pBJ1. Celler ble platet i bløt-agar og tillatt å vokse i 2 uker. Størrelsen av koloniene ble målt ved bruk av et invertert mikroskop utstyrt med et okular som inneholdt en 25 mm trådkors og de totale kolonier med størrelsen ≥100 um ble tellet. Tallene som vises i grafen representerer gjennomsnittstall fra tre uavhengige utvalg (
* P 0,02;
** P 0,001). Representative bilder av levende kolonier som gjenspeiler variasjon i kolonistørrelse med eller uten eksogent β
1 er vist i de nedre panelene. Måle søylene representerer en størrelse på 100 um.
IGF-IR regulering av β
1 inte ekspresjon forekommer ikke på mRNA-nivå
samarbeidende virkning av disse reseptorene videre veksten av kreftceller ledet oss til å undersøke mekanismen som IGF-IR regulerer β
1 uttrykk. Vi har tidligere demonstrert at IGF-IR regulerer ekspresjonen av β
1 integrinunderenhetene i -PRCA celler [24]. Denne forskriften kan oppstå på transkripsjons, post-transcriptional, translasjonsforskning eller posttranslasjonelle nivåer. mRNA regulering av β
1 integriner med IGF-IR ble analysert i LNCaP-celler ved å redusere ekspresjonen av IGF-IR med RNA-interferens, etterfulgt av behandling med R1881 og /eller IGF-1. Sanntid-analyser av mRNA-transkripter viser at IGF-IR mRNA induseres 8-fold ved R1881 og 2,5 ganger på IGF-1-behandling (fig. 3). Men ingen vesentlige endringer i β
1 inte mRNA nivåer registreres på begge behandlingene. Nedbryting av IGF-IR uttrykk gir fire ganger reduksjon av IGF-IR mRNA etter ligand behandlinger. Dataene indikerer at β
1 integrin transkripsjonsnivåer ikke endres vesentlig ved IGF-IR knockdown. Analyse av GAPDH ekspresjonsprofilen i dette forsøket tjente som en ytterligere kontroll referanse. Resultatene indikerer klart at IGF-IR ikke regulerer p
1 integrin-underenheter på mRNA-nivå.
LNCaP-celler ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA. Tjuefire timer senere ble cellene dyrket i medium inneholdende 2% CSS for ytterligere 24 timer og behandlet med bærer, 1 nM R1881 eller 100 ng /ml IGF-1 for ytterligere 24 timer. RNA isolert fra disse celler, ble evaluert med hensyn på transkripsjonsnivåer av IGF-IR, β
1 integrin og GAPDH ved hjelp av kvantitativ sanntid PCR. Ekspresjons-verdier ble normalisert i løpet av transkripsjonsnivåer av β-aktin og dataene er presentert som relative uttrykk. Hver reaksjon ble kjørt tre ganger og feilfelt representerer standardavvik (
* P 0,01) i forhold til ubehandlede prøver
induserbar ekspresjon av CD4-β
1A inte cytoplasmaområde chimera gjør. ikke beskytte den endogene β
1 inte subenheten fra degradering indusert av IGF-IR uttømming
for å undersøke om det eksogene uttrykk for cytoplasmaområde av β
1A endrer IGF-IR-mediert regulering av endogen β
en integrinunderenhetene, chimeriske konstruksjoner sammensatt av transmembran og cytoplasmatisk domene av β
1A-integrin med CD4-ekstracellulære domene (Ch1) ble anvendt. Det cytoplasmatiske domenet til β
en subenhet eksisterer i fem forskjellige spleisede former; den mest uttrykt form i kreft, β
1A, regulerer β
en lokalisering, celleproliferasjon og migrasjon [2]. Vi har spekulert at binding av det cytoplasmatiske domene av β
1 integriner til IGF-IR ville føre til noen konkurranse for binding av IGF-IR til forskjellige former for β
1 og resultere i en β
en beskyttende effekt under utarmet IGF-IR forhold. Ekspresjon av Ch1 kimæren (CH1-celler), eller CH2-kimer, som tilsvarer det transmembrane domenet av β
1 pluss CD4-ekstracellulære område (CH2-celler), i PC3-celler ble indusert ved ZnSO
4 behandling. IGF-IR uttømming i stabilt transfekterte celler ble bekreftet av immunoblot analyse (Fig. 4A, venstre panel). Induksjon av det cytoplasmatiske β
en variant ble bekreftet ved FACS (fig. 4A, nedre paneler). Ved induksjon, ville IGF-IR forventes å redistribuere og binder seg til både endogene β
1 og eksogene cytoplasmisk variant. Eksogene induksjon av β
1 cytoplasmatiske domene, men forandrer ikke IGF-IR-medierte regulering av endogent β
1 integrin-nivåer (figur 4A, panel øverst til høyre). For å undersøke om den β
1A cytoplasmisk variant fysisk samvirker med IGF-IR, immunutfelling av CD4 i PC3-Ch1 og PC3-Ch β
1 C-celler (som er stabilt transfektert med cytoplasmatiske domene av β
1C integrin pluss CD4-ekstracellulære domene [29]) ble utført etter inkubering av cellene med ZnSO
4. Immunoavtrykket viser (øvre panel) tilstedeværelse av IGF-IR i cellelysat men ikke i CD4 immunoutfelt prøver. Det nedre panel viser at CD4 var effektivt immunopresipitert; en irrelevant bånd ble også påvist i de IgG immunoutfelt prøvene. Dataene indikerer at det cytoplasmatiske domenet til β
1A-integrin-varianten ikke reagerer med endogen IGF-IR (Fig. 4B).
(A), PC3-Ch1 (uttrykk ekstracellulære domene av CD4 og murint de transmembrane og cytoplasmatiske områdene til β
1) og styre PC3-CH2-celler (som uttrykker det ekstracellulære domene av muse-CD4 koblet til det transmembrane domenet av β
1) ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene høstet for å vurdere effektiviteten av IGF-IR knockdown (øverst til venstre panel). PC3-CH1 og CH2 PC3-cellene ble sultet i serumfritt medium i 24 timer og der det er angitt, indusert med 75 mM ZnSO
4 for ytterligere 6 timer for å fremme ekspresjonen av kimære proteiner. Cellene ble høstet for analyse av β
en subenhet uttrykk (øverste høyre panel). En parallell sett av prøver ble bearbeidet for å bekrefte den induserbare ekspresjon av kimærene ved FACS-analyse ved bruk av en Ab til CD4 (nedre paneler). 10.000 celler i hver prøve ble anskaffet og data er vist i histogrammet med x-aksen representerer gjennomsnittlig relativ CD4-ekspresjon og y-aksen som representerer antall celler. (B) PC3-Ch1 og PC3-Chβ
1C (kontrollceller som uttrykker ekstracellulære domene av muse CD4 og de transmembrane og cytoplasmiske domener av det β
1 C) inkubert med 75 pM ZnSO
4 for å indusere ekspresjon av det cytoplasmatiske domene av β
1A eller β
1C griner, respektivt. Lysates ble immunopresipitert med enten kontroll IgG eller Ab mot kimære CD4-domener. Immunokomplekser ble analysert med hensyn på IGF-IR-ekspresjon ved immunblotting. Input lysatene ble kjørt som kontroller.
Forbedret proteasomal degradering av β
1 integrin subenheter i fravær av IGF-IR
Etter å vise at IGF-IR regulerer ikke β
1 integrin transkripsjoner, forsøkte vi å finne ut om IGF-IR-mediert regulering av β
1 integrin nivåer ville oppstå ved post-translasjonell nivå. Forbigående reduksjon av IGF-IR i LNCaP-celler ble etterfulgt av R1881 behandling alene eller i kombinasjon med en proteasominhibitor, MG132, i 6 timer. R1881 ble anvendt for å forbedre de basale uttrykket nivåer av IGF-IR og β
1 integrin-underenhet som er rapportert av vår tidligere gruppe [23] og cellelysatene ble analysert. Reduksjonen av β
1 integrin nivåer fremkalt av IGF-IR-uttømming ble opphevet ved behandling med celle denne proteasominhibitor (Fig. 5A). Resultatene av dette eksperimentet ble bekreftet i PC3-celler etter transfeksjon med enten kontroll siRNA eller IGF-IR siRNA etterfulgt av behandling med MG132 for enten 6 eller 24 timer (fig. 5B). Vi i tillegg bekreftet disse resultatene ved hjelp av ulike doser av epoxomicin, en annen svært spesifikk proteasominhibitor [30]. LNCaP-celler ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA som ovenfor og behandlet med økende konsentrasjoner av epoxomicin. β
1 integrin-underenheter er til stede i enten forløper eller modne formene (henholdsvis 110 og 130 kD) og begge blir nedregulert ved IGF-IR-tap. Dataene viser at epoxomicin blokkerer degradering av den modne formen av β
1 integrin-subenhet (fig. 5C). Den modne β
1 reseptoren alene ser ut til å følge proteasomal degradering etter internalisering. Forløperen form av β
1 (110 kD) som trenger ytterligere posttranslasjonelle modifiseringer for å gjennomgå en modning er ikke gjenvinnes ved proteasomal inhibering. Dataene viser at IGF-IR stabiliserer β
1 integrin-subenhet ekspresjon ved å hemme proteasomal degradering.
(A) LNCaP-celler ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA. Tjuefire timer senere ble cellene dyrket i medium inneholdende 2% CSS for ytterligere 24 timer og behandlet med bærer, 1 nM R1881 og /eller 10 uM MG132 i 6 timer. Cellelysater ble analysert for ekspresjon av β
1 integrin-subenhet og IGF-IR ved immunblotting. AKT ble anvendt som en kontroll lasting. Båndintensitetene av β
1 integrin-subenhet ble kvantifisert ved ImageJ analyse og normalisert med de av AKT som en lasting kontroll. De relative intensitetsverdiene er uttrykt som prosent av kontrollprøven transfektert med kontroll-siRNA alene. (B) PC3-celler ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 uM MG132 til 6 eller 24 timer i RPMI-medium inneholdende 10% serum. Cellelysater ble analysert for ekspresjon av β
1 integrin-subenhet og IGF-IR ved immunblotting. AKT ble anvendt som en kontroll lasting. β
1 integrin subenheter ble kvantifisert ved ImageJ som ovenfor og verdier normalisert med de av lasting kontroll AKT. Relative intensitetsverdiene av β
1 er uttrykt som prosent av kontrollprøven transfektert med kontroll siRNA alene. (C) LNCaP-celler ble transfektert som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere ble cellene dyrket i medium inneholdende 2% CSS i ytterligere 24 timer, etterfulgt av behandling med 0, 100, 250 eller 500 nM epoxomicin i kombinasjon med 1 nM R1881 i 18 timer. Cellelysater ble analysert for moden og forløper former β
1 integrin-subenhet og IGF-IR ved immunblotting. AKT tjener som en lasting kontroll. Relative bandet intensiteter av modne β
1 inte ble bestemt ved ImageJ analyse som ovenfor.
Analyse av α inte subenheter ved IGF-IR downregulation
Integriner er heterodimerer som består av α og p-subenheter. Det er 24 mulige heterodimerer med evne til å aktivere bestemte signalveier [19]. β
1 integriner, blant andre delenheter, er kjent for å heterodimerize med α2, α3, α4, α5, α6 og α7 integrin underenheter, som er uttrykt i LNCaP-celler. Siden reduksjon av IGF-IR uttrykk nivåer fører til nedregulering av β
1 inte subenhet, bestemte vi oss for å finne ut hvilke a inte subenheten ble påvirket av IGF-IR downregulation. Vi viser en signifikant reduksjon av den α5 integrin-underenheten i forbindelse med redusert IGF-IR og p
1 nivåer (Fig. 6). Ingen forandring ble funnet i uttrykket nivåer av andre a integrin heterodimere partnere (fig. 6 og data ikke vist). Disse resultatene er i overensstemmelse med våre tidligere observasjoner i PC3-celler hvor oppheving av β
1 integriner med shRNA førte til en betydelig reduksjon i overflaten ekspresjon av α5 integrin-underenheten [3]. Våre data viser at den store komplekse regulert av IGF-IR er α5β
1 integrinet.
LNCaP-celler ble transfektert med enten kontroll eller IGF-IR siRNA og behandlet med 2% CSS-inneholdende medium i 24 timer etterfulgt av behandling med 1 nM R1881 i 24 timer. IGF-IR og β1 grin nedregulering ble evaluert ved immunoblot. Lysatene ble så analysert for ekspresjon av forskjellige a-integrin-subenheter. Spesifikk Abs mot α
2, α
4, α
5, α
6 og α
7 integrin-subenheter ble brukt til å identifisere den α integrinet partner av β
1 integrin subenhet, som er nedregulert på IGF-IR uttømming.
Diskusjoner
Denne studien beskriver en roman observasjon at IGF-IR-funksjoner i PRCA celler er delvis mediert av β
1 inte. For å dissekere den mekanismen som IGF-IR regulerer β
1 inte uttrykk, viser vi at IGF-IR forbedrer β
1 inte stabilitet ved å redusere sin proteasomal degradering. Vi viser også at α
5 inte subenhet forbundet med β
1 selektivt downregulated på IGF-IR tap.
Store epidemiologiske og prekliniske data har identifisert IGF-IR vei som en viktig regulator av tumorcellebiologi. De skuffende resultatene, men fra flere kliniske studier forsøkte å hemme IGF-IR, er å spørre forskere til å utvikle prediktive biomarkører for å forbedre pasient utvalg som ville ha nytte av behandling rettet mot IGF-IR. Dessuten er det nødvendig med en klarere forståelse av relative andeler av IGF-IR og IR-komplekser i svulster.
