Abstract
Til tross for en bedre forståelse av patogenesen av kreft i munnhulen, forblir dens behandlingsresultat dårlig. Det er således et behov for nye terapeutiske muligheter for å bedre prognose av denne sykdommen. RNA interferens (RNAi) ser ut til å være et lovende terapeutisk verktøy ved behandling av mange sykdommer, inkludert kreft i munnhulen. Det er imidlertid en hindring for RNAi-mediert terapi vært levering, spesielt retensjonen av små interfererende RNA (sirnas) i endosomer og deres etterfølgende nedbrytning i lysosomer, noe som resulterer i ineffektiv genet demping. Således, denne studien undersøkte muligheten for å utforme og å benytte et peptid, betegnet 599, som består av en syntetisk influensavirus-stammer endosomet-nedbrytende fusogent peptid-sekvens og en strekning av kationisk celle-gjennomtrengende nona (D-arginin) rester, for å levere sirnas inn muntlige kreftceller og indusere stanse av den terapeutiske målet, CIP2A, et oncoprotein overexpressed i ulike menneskelige maligniteter inkludert kreft i munnhulen. Økning av 599 peptid-til-siRNA molforhold demonstrert en høyere bindingskapasitet for siRNA-molekyler og forbedret siRNA levering inn i cytoplasma av orale kreftceller. Faktisk, kvantitative målinger av siRNA levering inn i celler demonstrerte at en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold kunne levere 18-ganger høyere mengder sirnas sammenlignet med celler behandlet med siRNA alene uten vesentlige langtids cytotoksiske virkninger. Viktigst, 599 peptid-mediert siRNA levering fremmes betydelig CIP2A mRNA og protein lyddemping som resulterte i redusert oral cancer celle invasivitet og forankrings-uavhengig vekst. Sammen viser disse dataene at et kimært peptid som består av et fusogent sekvens, i kombinasjon med celle-gjennomtrengende reststoffer, kan anvendes for effektivt å levere sirnas inn i orale kreft celler og indusere stanse av dens target-genet, noe som potensielt gir en ny terapeutisk strategi bekjempelse av kreft i munnhulen
Citation. Cantini L, Attaway CC, Butler B, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw A (2013) fusogene-Oligoarginine Peptide-mediert levering av siRNAs rettet mot de CIP2A Oncogene inn muntlige kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10,1371 /journal.pone.0073348
Redaktør: Kin-Hang Kok, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: May 14, 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 3. september 2013
Copyright: © 2013 Cantini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIDCR og NCRR gir R00DE018191 (AJ) og P20RR017696 hhv. Dette arbeidet ble også finansiert av Bankhead-Coley Florida Cancer Research Program stipend 08BN-02 (AJ). Teknisk støtte fra Clemson Lys Imaging Facility ble gjort mulig av National Science Foundation Award # 1126407 og en Clemson University Kjerne Facility tilskudd til Terri F. Bruce. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er anslått at om lag 40 000 nye tilfeller og ca 8000 dødsfall relatert til kreft i munnhule og svelg vil skje årlig i USA i 2012 [1]. Munnhule kreft er for tiden rangert som den sjette vanligste kreftsykdommen globalt, med plateepitelkarsinom i munnslimhinnen er den vanligste typen (~90%) [2], [3]. Til tross for enorme mengder forskning og fremskritt innenfor områdene onkologi og kirurgi, har 5-års overlevelse for kreft i munnhulen bare beskjedent forbedret i de siste 30 årene og dens prognose er fortsatt dårligere enn bryst, tykktarm, eller prostatakreft [1] . Derfor er nye terapeutiske strategier for å forbedre utfallet av denne sykdommen.
RNA interferens (RNAi) er en svært konservert post-transcriptional gene reguleringsmekanisme utløses av små, ikke-kodende dobbel-strandet RNA-molekyler som kan spesielt slå genekspresjon ved enten å undertrykke oversettelse og /eller indusering av mRNA degradering [4], [5]. Korte dobbelt-trådede RNA-molekyler, som kalles små interfererende RNA (siRNA) er funksjonelle molekyler som i forbindelse med RNA-indusert stanse kompleks (RISC) medierer sekvens-spesifikk mRNA-target utvalg og spaltning [6], [7], [8 ], [9]. Oppdagelsen av at innføringen av kjemisk syntetiserte sirnas inn i pattedyrceller kan effektivt indusere sekvens-spesifikk inhibering av genekspresjon [6], gjort tydelig det terapeutiske potensialet til å utnytte RNAi som et middel for å spesifikt målrette og stillhet sykdomsfremkallende gener. Påfølgende prekliniske eksperimenter på dyr og nyere kliniske studier har videre validert sirnas som potente hemmere av et utvalg av sykdomsfremkallende gener, og som en lovende ny klasse av legemiddelselskap [8], [10], [11].
Selv om utformingen av terapeutisk-grade sirnas har forbedret [8], [10], fortsatt levering den største hindringen mot gjennomgripende bruken av siRNAs for terapeutiske anvendelser [8]. Fordi terapeutiske makromolekyler er generelt leveres gjennom endocytose [12], en av de viktigste begrensende trinn for mange leveringsfremgangsmåter, inkludert siRNA levering, er endosomale innfanging og påfølgende nedbrytning av det terapeutiske lasten i lysosomer [11], [12], [13] . Derfor, for å forbedre den intracellulære biotilgjengeligheten av siRNAs, effektive strategier for endosomal flukt er nødvendig.
For å transportere viral genom inn i cytoplasma, dyrevirus som er internalisert via reseptor-mediert endocytose, utnytte proteiner med endosomet-nedbrytende fusjonspeptid domenesekvenser for å mediere destabilisering av den aktuelle vertscelle endosomale membran [14]. Fremgangsmåten ved hvilken disse virale proteiner destabilisere endosomale membraner inntrer i et surgjøring-avhengig måte og ble etterlignet av syntetiske peptider, betegnet fusogene peptider [15], [16]. Spesielt flere syntetiske fusogene peptider basert på den N-terminale fusjonsdomenet av HA2-underenheten til influensavirus hemaglutinin-protein har vist seg å være effektiv ved å påvirke genoverføring [15]. Blant disse fusogene peptider, både INF-7 peptid og dens dimer form diINF-7, har vist sin endosomet nedbrytende evne ved å forbedre ikke-virale genoverføringssystemer og styrke både cytosoliske levering av immunoliposome-innkapslet makromolekyler og lipofektamin-mediert siRNA- induserte genet Slå [15], [16], [17]. Videre, co-inkubering av kimære peptider bestående av HA2 endosomet-nedbrytende peptid fusjonert til cellepenetrerende peptider (CPP; kationiske peptid vektorer som raskt kan forårsake sin egen cellulære internalisering ved ulike former for endocytose [18]), er også blitt demonstrert for å forbedre den endosomale rømning av CPP-kompleks last, og følgelig fremme sterkere biologiske virkninger [12], [18], [19]. I en bestemt studie, ble co-inkubasjon av HA2 bundet CPP peptider med CPP-kompleks sirnas funnet å moderat bedre stanse av målrettet reporter genet [20].
Selv om de ovenfor beskrevne strategier har vist forbedringer i siRNA-mediert stanse effekter, flere problemer fortsatt som kan begrense effekten av fusogene peptid-mediert cytosolic levering av siRNAs. For det første fordi den fusogene eller HA2-kimære peptider ikke var kompleksbundet til de sirnas, denne tilnærmingen ikke garantere at peptidene vil samtidig lokalisere innenfor de samme endocytiske vesikler som siRNA lasten [12]. Co-lokalisering er nødvendig for å frigjøre siRNA-molekyler fra den endocytiske vesikkel-[12]. For det andre, på grunn av denne mangel på interaksjon mellom peptidene og sirnas, er det mulig at peptider som kunne unnslippe endosomer uten å forstyrre alvorlig den endosomale membraner, til slutt forlater siRNA lasten innesluttet innenfor det vesikkel [12]. Derfor, for å omgå disse problemene, denne studien var å utforme et kimært peptid som består av et fusogent sekvens knyttet til en CPP som ville muliggjøre stabil binding med sirnas via elektrostatiske interaksjoner og fremme deres intracellulær levering og endosomale flukt, for å indusere den terapeutiske stanse av en målrettet onkogenet i orale kreftceller. På grunn av at INF-7 peptidet er en mer potent membran-destabiliserende peptid sammenlignet med moder HA2 peptidet og kationisk nona (D-arginin) peptider er meget effektive CPP i stand til forbedret cellulært opptak [12], [21], samt levering av siRNAs i svulster og hjernen til mus [22], [23], har vi designet en kimære peptid, kalt 599, som ville utnytte begge disse egenskapene i ett enkelt molekyl til direkte komplekse til og forbedre den intracellulære biotilgjengeligheten av siRNAs. Her viser vi at 599 peptid leverer effektivt sirnas utformet for å målrette CIP2A, et oncoprotein overexpressed i menneskets hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCCs), inkludert muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs) [24], [25], [26] , til muntlige kreftceller, formidler effektiv CIP2A stanse, og dermed hemmer kreft i munnhulen celle invasivitet og forankringsuavhengig vekst.
Resultater
Den 599 Peptide effektivt binder og Leverer sirnas til munnhulekreft Cells
for å teste hvorvidt den 599 peptidet via sin kationisk nona (D-arginin) rester kan effektivt binder negativt ladede sirnas basert på elektrostatiske interaksjoner, ble en agarosegel shift assay utføres (fig. 1). Under anvendelse av forskjellige mengder av peptidet 599, som strekker seg fra 1 til 50-ganger molart overskudd av sirnas, ble det vist at den 599 peptidet kunne binde faktisk siRNA-molekyler utformet for å målrette CIP2A (siCIP2A) ved å forsinke det siCIP2A allerede ved en peptid-til- siRNA molar (P: N) forhold på 20:01, med ingen gratis sirnas påvisbare i gelen ved 50:1. På P: N-forhold på 10:01, peptid bare hadde moderate effekter på siRNA bindende, og ved 01:01 var det helt ineffektivt
En etidiumbromid beiset 4% agarosegel shift analysen undersøke muligheten av. forskjellige mengder av den 599 peptid (som strekker seg fra 1 til 50-ganger molart overskudd av sirnas) til å danne komplekser med siCIP2A. siCIP2A, siRNA rettet mot CIP2A onkogen; MWM, vekt markør molekylær (antall basepar for hver DNA fragment vises)
Ved å demonstrere at 599 peptid kan binde seg til sirnas på bestemte P:. N-forhold, vi neste undersøkt muligheten av peptidet for å levere fluorescent-merkede sirnas inn i oral cancer celler ved fluorescens mikroskopi-analyse (fig. 2A). Ved bruk av en fluorescens-merket siRNA, DY547-konjugert til siCIP2A (D-siCIP2A), i kompleks med økende mengder av 599 peptid, som strekker seg fra 1 til 50-ganger molart overskudd av sirnas, ble det observert at en økning av P: N-forholdet forbedres levering av siRNA-molekyler inn CAL 27 muntlige kreftceller etter to timer inkubasjon. Mer spesifikt, den 50:1 P: N-forholdet vist å ha en økt evne til å indusere siRNA opptak i celler i forhold til 20:01 P: N-forhold, som bare hadde en moderat effekt. Motsatt celler behandlet med D-siCIP2A alene eller i kompleks med 599 peptid på en 1:01 P: N-forholdet var ute av stand til effektiv siRNA opptak. Kvantitative målinger av internalisert D-siCIP2A inn CAL 27 celler etter 2,5 timer inkubasjon også bekreftet at økende 599 P: N forholdstall økt siRNA opptak i celler. Spesielt er 50:1 og 100:1 P: N-forhold levert ca. 18 og 42 ganger betydelig større mengder av D-siCIP2A, respektivt, sammenlignet med celler behandlet med D-siCIP2A alene (figur 2B.). Som en sammenlikning, den kommersielle transfeksjon midlet INTERFERin ™ (IFN) bare levert ca. 2 ganger større mengder av D-siCIP2A, sammenlignet med celler behandlet med D-siCIP2A alene. Av notatet, selv om 100:1 P: N forholdet var i stand til å levere det høyeste beløpet av siRNAs inn i cellene, det induserte betydelige langsiktige cytotoksiske effekter målt ved hjelp av en ikke-måls siRNA (Sint) kontroll (Fig 2C.) . Spesielt er 100:1 P: N-forholdet betydelig redusert proliferasjonen av celler 48 timer etter behandling, sammenlignet med ubehandlede celler. Derimot er 50:1 P: N ratio hadde ingen signifikant effekt på lang sikt cytotoksisitet. Som et resultat, basert på disse funnene den 50:1 P:. N-forholdet ble anvendt for ytterligere karakterisering og eksperimentering
(A) Fluorescensmikroskopi analyse av CAL 27 orale cancerceller inkubert i 2 timer med DY547-konjugert siRNA målretting CIP2A (D-siCIP2A; rød) alene eller i kompleks med økende mengder av peptid 599 (som strekker seg fra 1 til 50-ganger molart overskudd av siRNAs). Kjerner (blå) ble kontra med DAPI. Skala: 50 mikrometer. (B) CAL 27-celler ble inkubert i 2,5 timer med D-siCIP2A alene eller i kompleks med økende mengder av peptid 599 (som strekker seg fra 1 til 100 gangers molart overskudd av siRNAs). For sammenligning, ble cellene også transfektert ved å bruke den kommersielle transfeksjon reagens, INTERFERin ™ (IFN). Mengden av siRNA leveres inn i celler i pmol pr mg protein rapporteres med hver behandling normalisert til D-siCIP2A alene. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av fire separate forsøk, hvor *** P 0,001, ** P 0,01 sammenlignet med D-siCIP2A alene behandlede celler (ANOVA, Dunnetfs multiple sammenligningstest). (C) Vurdering av langtids toksisitet (som målt ved hjelp av en celle-proliferasjonsanalyse) av CAL 27 celler 48 timer etter behandling med enten et ikke-målsøkende siRNA (Sint) alene, økende konsentrasjoner av 599 peptid alene, eller økende mengder 599 peptid (som varierer fra 1 til 100 gangers molart overskudd av sirnas) i kompleks med Sint. For sammenligning, ble cellene også transfektert med den kommersielle transfeksjon reagens, IFN. Ubehandlede celler ble definert som 100% levedyktighet. Dataene er gjennomsnitt ± SEM utført in triplo (n = 3), hvor *** P 0,001, ** P . 0,01 sammenlignet med ubehandlede celler (ANOVA, Dunnetfs multiple sammenligningstest)
Karakterisering av 599 Peptide-siRNA Complex
for å få innsikt i mekanismen av cellen oppføring av 599 /siRNA kompleks ble subcellulære lokalisering av 599 /D-siCIP2A kompleks videre undersøkt i levende celler ved fluorescens mikroskopi kombinert med fase kontrast (fig. 3A). Ved nærmere inspeksjon av internalisert D-siCIP2As, dukket det basert på den omfattende punktat opptak mønster av siRNAs at 599 /D-siCIP2A komplekset ble endocytose. Co-farging av fikserte celler med tidlig endosomale markør EEA1, bekreftet colocalization av D-siCIP2As med endosomale vesikler (Fig. 3B), og indikerer således en endocytiske internalisemodus.
(A) Fluorescensmikroskopi analyse og overlegg av et fasekontrastrikt bilde av levende CAL 27 p-cancerceller inkubert i 2 timer med DY547-konjugert siRNA som målretter CIP2A (D-siCIP2A; rød) kompleksdannet med 599 peptidet ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Skala: 50 mikrometer. (B) Indirekte immunfluorescens-mikroskopi-analyse av CAL 27 orale cancerceller inkubert i 2 timer med D-siCIP2A (rød) kompleksdannet med 599 peptidet ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Endosomer (grønn) ble farget ved hjelp av en kanin monoklonalt anti-EEA1 antistoff. Kjerner (blå) ble kontra med DAPI. Samlokaliseringen av D-siCIP2A med endosomer (gul) er observert i det fusjonerte panel og understrekes av piler. Skala: 25 mikrometer
For å vurdere 599 peptid i form av partikkelstørrelse og overflateladning etter kompleks med siCIP2A både dynamisk lysspredning og zeta potensialet målinger ble utført. (Fig 4A.). Basert på målingene, ble 96% av de dannede partikler sentrert ved 74 nm og 4% ved 220 nm etter antall veide størrelsesfordeling, med den gjennomsnittlige partikkelstørrelse av de store befolkningen være 80 ± 0,5 nm. Zeta-potensialet av 599 /siCIP2A kompleks ble bestemt til å være positiv, med en verdi på 32,5 ± 0,5 mV. 599 /siCIP2A komplekset ble også visualisert ved hjelp av mørkefelt-basert optisk belysning (Fig. 4B). Ved hjelp av denne bildeteknologi 599 /siCIP2A komplekset ble funnet å vise nokså ensartede sfæriske strukturer.
(A) Størrelse distribusjon og zeta potensialet i 599 peptid kompleks med siCIP2A på en 50:1 peptid-til-siRNA molar forholdet 20 minutter etter formulering i vann. (B) Darkfield-basert optisk mikroskopi bilde av 599 peptidet kompleksdannet med siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold 20 minutter etter at preparatet i vann. Skala:. 10000 nm
For å teste betydningen av de to viktigste komponentene (dvs. endosomet-nedbrytende og kationiske celle-gjennomtrengende Nona (D-arginin) rester porsjoner) i overdragelse evne til 599 peptid for å levere sirnas inn i celler, ble to ytterligere peptider syntetisert som består av enten endosomet-nedbrytende sekvens (616) eller den kationiske celle-gjennomtrengende nona (D-arginin)-rester alene (9R). Ved behandling av CAL 27 celler med enten 599, 616 eller 9R peptider i kompleks med D-siCIP2A på en 50:1 P: N ratio, analyser fluorescens mikroskopi viste at bare intakt 599 peptid med både endosomet forstyrrende og kationiske celle-gjennomtrengende Nona (D-arginin) rester deler kunne mekle levering av siRNAs inn i celler, mens både 616 og 9R peptider hadde tilsynelatende ingen effekt på siRNA levering 2 timer etter behandling (fig. 5).
fluorescens mikroskopi-analyser av CAL 27 orale cancerceller inkubert i 2 timer med DY547-konjugert siRNA som målretter CIP2A (D-siCIP2A; rød) kompleksdannet til peptider 599, 616, og 9R ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Kjerner (blå) ble kontra med DAPI. Skala: 50 um
Svikt i 616 peptid å levere sirnas inn i cellene var mest sannsynlig på grunn av sin manglende evne til å binde sirnas selv på P:. N-forhold så høyt som 100:1 (data ikke vist). Men resultatet med den 9R peptidet var noe overraskende, siden det ble vist å effektivt å binde sirnas på en 50:1 P: N-forhold basert på en agarosegel skift analyse (Fig. S1A), og danne partikler med en gjennomsnittlig størrelse på 58,2 ± 0,2 nm og et zeta potensiell verdi på 25,8 ± 0,5 mV (fig. S1B). Fordi paraformaldehyde fiksering av celler kan resultere i kunstig omfordeling av (Arg)
9 peptider [27], var det mulig at den cellulære fordeling av 9R /D-siCIP2A kompleks kan ha blitt påvirket av dette kjemikaliet fiksativ. Derfor er opptaket av D-siCIP2A ble også vurdert ved hjelp av fiksering uavhengige kvantitativ tilnærming som likeledes funnet at den 9R peptidet, som strekker seg fra 0,1 til 100-gangers molart overskudd av sirnas, var ute av stand til å mediere siRNA levering inn i celler og var umulig å skille fra celler behandlet med D-siCIP2A alene (fig. S1C).
den 599 Peptide som megler CIP2A genet Slå i Oral kreft celler
for 599 peptid å bli betraktet som en effektiv levering kjøretøy for siRNA- baserte legemiddelselskap, må den være i stand til å levere funksjonelle siRNAs inn i celler som kan slå sin tiltenkte genet mål. For å vurdere funksjonaliteten til 599 /siRNA kompleks, to muntlige kreftcellelinjer, CAL 27 og SCC-25, ble behandlet med 599 peptid kompleks med enten siCIP2A eller en Sint kontroll på en 50:1 P: N-forhold, hvoretter både CIP2A mRNA og proteinnivåer ble vurdert 48 timer etter behandling ved real-time PCR og Western blot analyser, henholdsvis. Kvantifisering av real-time PCR viser en signifikant knockdown i CIP2A mRNA nivåer i både muntlig kreft cellelinjer som ble behandlet med 599 /siCIP2A kompleks sammenlignet med kontroll 599 /Sint behandlede celler (fig. 6A). Nærmere bestemt ble en -60% og -85% reduksjon i CIP2A mRNA-nivåer observert i CAL 27 og SCC-25 p-kreft-cellelinjer, henholdsvis. Videre analyser Western blot bekreftet evnen til 599 peptidet til å mediere levering av funksjonelle sirnas i begge cellelinjer ved å demonstrere undertrykkelse av CIP2A proteinnivåer 48 timer etter behandling med 599 /siCIP2A kompleks sammenlignet med kontroll 599 /Sint behandlede celler ( fig. 6B). Av notatet, ble proteinnivået i den onkogene transkripsjonsfaktoren c-Myc også vurderes fordi CIP2A er kjent for å regulere stabiliteten av dette protein [25]. Western blot analyser bekreftet at lyddemping av CIP2A forårsaket destabilisering av c-myc i begge cellelinjer (Fig. 6B).
(A) Real-time PCR-analyse av CIP2A mRNA nivåer i CAL 27 og SCC-25 oral kreftceller 48 timer etter behandling med 599 peptid kompleks på en 50:1 peptid-til-siRNA molare forhold til 100 nM av siRNA rettet mot CIP2A (siCIP2A) sammenlignet med kontroll ikke-måls siRNA (SINT). De CIP2A mRNA-nivåer ble normalisert til 18S rRNA. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre separate eksperimenter utført i tre eksemplarer, hvor ** P 0,01 i forhold til Sint behandlede celler (Student t test). (B) Western blot analyser av CIP2A og c-myc protein uttrykk nivåer i CAL 27 og SCC-25 muntlige kreftceller 48 timer etter behandling med 599 peptid kompleks med enten 100 nM av Sint eller siCIP2A på en 50:1 peptid-å -siRNA molar ratio. GAPDH protein nivåer ble overvåket for å sikre lik lasting av prøvene.
Karakterisering av 599 /siCIP2A Complex-mediert RNAi Response
I et forsøk på å ytterligere karakterisere 599 peptid-mediert stanse av CIP2A i muntlig kreftceller varigheten av genet stanse, doseavhengig genet Slå, og aktiviteten stanse i serum ble også vurdert. Den vellykkede gjennomføringen av RNAi som en form for terapi avhenger av disse tre viktige funksjoner. Således, i et forsøk på å bestemme varighet av 599 peptid-mediert stanse av CIP2A i orale kreftceller over tid, analyserer et Western blot av CIP2A protein ekspresjonsnivåer i CAL 27 og SCC-25 p-kreftceller 1, 3, 5, 7 og 9 dager etter behandling med 599 peptid kompleks med enten Sint eller siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold ble utført (fig. 7A). Etter en enkelt behandling med 599 /siCIP2A ble lyddemping virkning observert å vare i 5 dager i CAL-27-celler og opp til 9 dager i SCC-25-celler med maksimal demping forekommende i 3 og 7 dager, henholdsvis. I dose-respons eksperimenter i SCC-25 celler (Fig. 7B), ble 599 peptid observert å gi siCIP2A mediert stanse doseavhengig med siRNA konsentrasjoner ≥ 50 nM overdragelse ~ 100% CIP2A protein knockdown og siRNA konsentrasjoner så lave som 20 nM fortsatt har målbare Silencing effekter. Lignende resultater ble observert i CAL 27 celler (data ikke vist), bortsett fra at høyere siRNA konsentrasjoner (≥80 nM) var nødvendig for å gi i beste ~90% CIP2A protein lyddemping. Til slutt, fordi stabiliteten av sirnas er et viktig forhold i RNAi-terapi, ble 599 peptid-mediert CIP2A stanse vurderes i fravær og nærvær av serum og sammenlignet med flere kommersielt tilgjengelige standard kationisk lipid-baserte transfeksjon reagenser (Fig. 7C). Ved behandling av SCC-25-celler med 599 /siCIP2A, ble ~95% CIP2A protein slått ned i fravær av en første inngang av serum og var sammenlignbare med CIP2A stanse observert for alle kationiske lipid-baserte transfeksjon reagenser som ble testet (mer enn 99%) bortsett HiPerFect® som viste bare en ~ 30% reduksjon i protein nivåer. Av betydning er imidlertid at selv i nærvær av serum, kan den 599 /CIP2A kompleks likevel gi en meget effektiv RNAi-respons ved ~70% CIP2A protein knockdown. Kvantifisering av disse data var basert på den densitometriske analyser av tre uavhengige Western blot eksperimenter ved hjelp av Image software J [28].
(A) Western blot analyser av CIP2A protein ekspresjonsnivåer i CAL 27 og SCC-25 oral kreftceller 1, 3, 5, 7 og 9 dager etter behandling med 599 peptid kompleks med enten 100 nM av kontroll ikke-målsøkende siRNA (Sint) eller siRNA målretting CIP2A (siCIP2A) ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. GAPDH proteinnivåer ble overvåket for å sikre lik belastning av prøvene. (B) Western blot-analyse av proteiner CIP2A knockdown i SCC-25 p-cancerceller 48 timer etter behandling med 599 peptid alene (5 uM) eller kompleks ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til enten Sint (100 nM ) eller avtagende konsentrasjoner av siCIP2A. De CIP2A proteinnivåer i ubehandlede celler ble også analysert for sammenligning. GAPDH proteinnivåer ble overvåket for å sikre lik belastning av prøvene. (C) Western blot analyser av CIP2A protein knockdown i SCC-25 p-cancerceller 48 timer etter behandling med 599 peptid kompleks til enten 100 nM for Sint eller siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molarforhold, i nærvær (+) eller fravær (-) av serum, sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med kommersielle transfeksjon reagenser Lipofectamine® RNAiMAX (RNAiMAX), Lipofectamine® 2000 (LF2000), INTERFERin ™ (IFN), og HiPerFect®. GAPDH protein nivåer ble overvåket for å sikre lik lasting av prøvene.
Den 599 Peptide-mediert stanse av CIP2A Reduserer Oral Cancer Cell Invasivitet og Anchorage-Uavhengig Vekst
Tidligere publisert litteratur har vist at CIP2A stanse i kreftceller fra ulike vev, for eksempel HNSCCs, nyrecellekarsinomer, og brystkreft kan ha effekt på kreftcelle invasjon og forankringsuavhengig vekst [25], [29], [30]. Følgelig, for ytterligere å demonstrere den potensielle nytten av 599 peptidet i siRNA-baserte terapeutiske midler for oral cancer, testet vi om 599 peptid-mediert stanse av CIP2A kan påvirke invasivitet og forankringsuavhengige vekstegenskaper av orale kreftceller. På grunn av det faktum at CAL 27 celler oppviste bare en kort lyddemping effekt, og ikke vokser godt i halvfast medium [31], 599 peptid-mediert CIP2A stanse virkning på celleinvasjon og forankrings-uavhengig vekst ble bare testet i SCC- 25 celler. Ved behandling av SCC-25 celler med 599 peptidet kompleksdannet til siCIP2A, observerte vi en betydelig ~33% inhibering i celle invasivitet, sammenlignet med kontroll 599 /Sint behandlede celler (Fig. 8A). Videre 599 peptid-mediert stanse av CIP2A i SCC-25 celler betydelig redusert forankringsuavhengig vekst ved ~39% sammenlignet med kontroll 599 /Sint behandlede celler (Fig. 8B). Sammen utgjør disse resultatene demonstrerte muligheten av 599 peptid til å virke som et effektivt redskap for levering siRNA baserte orale legemiddel.
(A) Kvantitering av prosentandelen av invaderende SCC-25 p-kreftceller etter behandling med 599 peptid kompleks på en 50:1 peptid-til-siRNA molare forhold til 100 nM av siRNA rettet mot CIP2A (siCIP2A) sammenlignet med kontroll ikke-måls siRNA (SINT). Dataene er gjennomsnitt ± SEM av fire separate forsøk, hvor * P 0,05 i forhold til Sint behandlede celler (Student t test). (B) krings-uavhengig vekst av SCC-25 p-kreftceller etter behandling med 599 peptid kompleks ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til 100 nM av siCIP2A sammenlignet med kontroll SINT. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av fire separate forsøk, hvor * P. 0,05 i forhold til Sint behandlede celler (Student t test)
Diskusjoner
For RNAi-baserte teknologier for å være effektive terapi, de krever effektiv intracellulær avlevering av terapeutiske siRNAs inn i cytoplasma av celler. Imidlertid, fordi de fleste levering nærmer trafikk siRNA last inn i celler via endocytose, har innfanging av disse molekylene i de endocytiske vesikler blitt et stort begrensende trinn [11], [12], og således en barriere mot den effektive bruk av RNAi-basert terapi. For å omgå dette problemet, har vi utviklet og testet et peptid, betegnet 599, som besto delvis sekvensene til både en svært effektiv CPP og endosomet-destabiliserende INF-7 peptid som kombinert ville muliggjøre effektiv levering av kompleks siRNA last inn i celler. Resultater fra studien viste at 599 peptid kan øke den intracellulære biotilgjengeligheten av siRNAs i orale kreftceller og effektivt formidle ved å stanse all målrettet CIP2A oncoprotein med påfølgende hemming av munnhulekreft celle invasivitet og forankringsuavhengig vekst.
på grunn kovalent konjugering av sirnas til CPP kan resultere i ineffektiv levering av funksjonelle sirnas til celler [18], [32], [33], 599 peptid ble utformet for å inkludere kationisk nona (D-arginin) rester som ville fungere ikke bare som CPP-komponent, men også muliggjøre ikke-kovalent binding av negativt ladede molekyler siRNA til peptidet via ladede interaksjoner. Agarose-gel-skift-analyser bekreftet at 599 peptid kunne for komplekse til siRNA-molekyler, og at bindingen mellom 599 peptidet og sirnas syntes å være avhengig av nona (D-arginin) rester. Dette var spesielt tydelig basert på det faktum at 616 peptid, som omfattet bare den sterkt anioniske INF-7 peptid-sekvens, kunne ikke binde sirnas.
Investigation til hvorvidt 599 peptid-siRNA kompleksdannelsen var tilstrekkelig til å indusere internalisering av de sirnas i celler, viste at en økning av P: N-forhold vil resultere i økt siRNA opptak i celler etter to timers behandling i forhold til celler behandlet med INTERFERin ™ eller naken siRNA. Disse funnene var konsistente med flere andre studier som likeledes funnet at økende konsentrasjoner av spesifikke CPP økes deres evne til opptak siRNA [20], [23]. Den økte opptak av siRNAs inn celler mest sannsynlig skjedde ved høyere P: N-forhold basert på flere faktorer. Først, fordi jo høyere P: N-forhold var mer effektiv ved å binde frie sirnas i oppløsning, som var tydelig gjennom agarose gel skift assays, dette in-part ville ha bidratt til større mengder sirnas blir internalisert inn i celler. For det andre, fordi behandling av celler med høye ekstracellulære konsentrasjoner av CPP har blitt rapportert å indusere deres internalisering i celler via aktivering av endocytose [34], økt opptak av sirnas inn i celler ved høyere P: N-forhold kan det også blitt tilskrevet nærværet av større mengder av det 599 peptidet som ville mer effektivt utløse endocytose av komplekset.
CPP-formidlet internalisering i celler er drevet av kationiske rester innenfor sin sekvens, og denne fremgangsmåte er blitt rapportert å forekomme gjennom ulike former for endocytose [18]. I vår undersøkelse ble 599 peptidet observert å mediere internalisering av sirnas i løpet av de første to timer til endocytiske vesikler og fjerning av nona (D-arginines) fra 599 peptidet, som representert ved 616 peptidet, bekreftet kravet om kationiske rester for levering av siRNA last. Overraskende, 9R peptidet som besto bare av kationisk nona (D-arginin) rester var likeledes i stand til å levere sirnas i celler, selv om det kan danne komplekser med sirnas.
