Abstract
kjemokinreseptor CCR6 er nylig vist å være assosiert med tykk- og endetarmskreft (CRC ) progresjon. Men den direkte bevis for om CCR6 i tumorer er en prognostisk markør for overlevelsen av pasienter med CRC og om det spiller en avgjørende rolle i CRC metastaser
in vivo
mangler. Her viser vi at nivåene av CCR6 ble oppregulert i CRC-cellelinjer og primære CRC-kliniske prøver. CCR6 oppregulering var nært korrelert med sykdomsstadier og overlevelse av CRC pasienter. Knockdown av CCR6 hemmet migrasjon av CRC celler
in vitro
. Overekspresjon av CCR6 i CRC celler økt spredning, migrasjon, og kolonidannelse
in vitro Hotell og fremmet sin metastatiske potensial
in vivo
. CCR6 aktivert Akt signal, oppregulert metastase gener og downregulated metastase suppressor gener. Selektiv målretting av CCR6 i svulster dramatisk hemmet veksten av CRC i mus. Dermed spiller svulsten uttrykk for CCR6 en avgjørende rolle i CRC metastaser, oppregulert CCR6 spår dårlig overlevelse i CRC pasienter, og målretting CCR6 uttrykk i svulster kan være en potensiell terapeutisk strategi for CRC
Citation. Liu J, Ke F, Xu Z, Liu Z, Zhang L, Yan S, et al. (2014) CCR6 Er en prognostisk markør for total overlevelse hos pasienter med tykktarmskreft, og dens Overuttrykte Forbedrer metastaser
In Vivo
. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10,1371 /journal.pone.0101137
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 26 januar 2014; Godkjent: 03.06.2014; Publisert: 30 juni 2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina og 973 Program (No: 91029730, No: 81202304, No: 2012CB917100, No: 2010CB529700 og No: 30972787), ved Program for professor i Special Appointment (Eastern Scholar) ved Shanghai institusjoner for høyere utdanning, av Science and Technology Commission av Shanghai Kommune (No: 09140902600), av ledende akademisk disiplin prosjekt Shanghai Municipal Education Commission (No: J50208 og No: J50207), ved Shanghai Pujiang Program (No: 10PJ407300 ), og ved Shanghai Committee of Science and Technology (11DZ2260200). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en stor helse bekymring verden over. Selv om store fremskritt har blitt gjort i det siste tiåret, utfordringene med å behandle CRC og dens metastaser forbli formidabel [1]. Foreløpig, til tross for bruk av spesifikke aktive legemidler for behandling av metastatisk CRC stadig mer populært, kur priser er lav og de underliggende molekylære mekanismer for organrettede metastasering av CRC er ikke fullt ut forstått.
Kjemokiner er 8 – 12-kDa peptider som fungerer som kjemotiltrekkende cytokiner og utøve sine biologiske effekter ved å kommunisere med G protein-koblede trans kjemokinreseptorer. En rekke kjemokiner og deres korresponderende reseptorer er kjent for å spille en viktig rolle i leukocytt-handel og homing, spesielt på steder med inflammasjon, vevsødeleggelse og ondartet cellevandring [2], [3]. Interessant, mens de fleste kjemokinreseptorer bindes til flere kjemokiner, har kjemokinreseptoren CCR6 bare en kjemokin-ligand, CCL20 (tidligere kjent som makrofag inflammatoriske protein-3α eller MIP-3α) [4].
CCR6 primært uttrykkes på leukocytter, med uttrykk i modne lymfocytter, særlig i hukommelsesceller [4], umodne dendrittiske celler (DCS) for bestemte linjer [5] og trekkende regulatoriske T-celler [6]. I de fleste tilfeller er CCR6 fraværende fra granulocytter (bortsett fra aktiverte neutrofiler), monocyttiske celler, lymfocytter umodne og modne DC [7] – [9]. CCL20 viser både konstitutiv og induserbar ekspresjon, hovedsakelig i mucosa-assosiert lymfoid vev og lever [10], og den basal ekspresjon hastigheten økes i henhold til inflammatoriske tilstander [11]. Basal Ekspresjonsnivået av CCL20 er tenkt å regulere migrasjon av CCR6-uttrykkende umodne DC og minne-lymfocytter fra blod for homeostatisk overvåking. Den oppregulering av CCL20 i løpet av betennelse kan øke migreringen av begge disse celletyper inn i vevet, [12] – [14]. For kreft hos mennesker, akkumulerte data antyder en sammenheng mellom chemokin-kjemokinreseptoren systemet og metastatisk potensial av kreftceller. For eksempel kreftceller fra minst 23 ulike typer av kreft hos mennesker av epitel, mesenchymale og hematopoietisk opprinnelse express CXCR4 [15], [16]. CCR7 ble også funnet i bryst, mage, og esophageal plateepitel kreft, og dens ekspresjon ble korrelert med dårlig prognose [15], [17], [18]. Alle disse studiene viser at uttrykket av kjemokinreseptorer i kreft metastase er ikke tilfeldig.
kjemokinreseptor CCR6 er av spesiell interesse for levermetastaser fra kolorektal kreft. Den unike chemokine ligand CCL20 hovedsakelig uttrykt i lymfatisk vev og i leveren [19]. Den avvikende ekspresjon av kjemokinreseptoren CCR6 på CRC-celler er angivelig involvert i orgel-selektive tumormetastase [20], [21]. Men den direkte
in vivo
bevis som støtter en rolle for CCR6 i metastasering av CRC mangler. I denne studien fant vi at oppregulert CCR6 uttrykk i metastatisk CRC cellelinjer spådd dårlig overlevelse for CRC pasienter. Overekspresjon av CCR6 var tilstrekkelig til å fremme barnekonvensjonen celle metastase både
in vitro Hotell og
in vivo
. Selektivt blokkerer CCR6 funksjon kraftig hemmet veksten av CRC i mus. CCR6 viser en direkte rolle i metastasering av menneskelig CRC, muligens ved å regulere metastaserelaterte gener.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikk komiteer av Hospital of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina.
Alle musene ble holdt under spesifikt patogen-fri (SPF) forhold i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorie dyr og med godkjenning (SYXK-2003-0026) av den vitenskapelige undersøkelsen styret i Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, Kina. For å bøte på noen lidelse hos mus observert i løpet av disse eksperimentelle studier, ble musene avlivet av CO
2 innånding.
En vev microarray inkludert 191 menneskelige tykktarmskreft og tilsvarende para-tumorprøver ble kjøpt fra National Engineering Center for biochips på Shanghai. Skriftlig informert samtykke fra donor ble innhentet for bruk av sine prøver til forskningsformål. Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller radioterapi før kirurgisk reseksjon. De tilstøtende ikke-kreft i kolon vev ble erholdt fra et minimum på 2 cm fra tumor for å sikre at disse vevene var fri for kreftceller. Prøvene ble rutinemessig fiksert i 10% formalin i umiddelbar postoperativ periode og i parafin innen 24 timer for fjerning.
Mus
C57BL /6J, Balb /c og B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (utpekt som CCR6
– /-). mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)
CRC celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekulturer
en udødelig humane embryonale nyrecelle linje, HEK293T, ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Hyclone) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Musen kolorektal cellelinje CMT93 ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS. En annen mus kolorektal cellelinje, CT26, ble opprettholdt i RPMI-1640 medium med 10% FBS. HEK293T, CMT93, CT26 og syv menneskelige CRC cellelinjer, Caco-2, SW480, HT-29, HCT116, SW1116, SW620 og LoVo, ble alle hentet fra Cell Bank fra Komiteen for Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina), hvor de ble preget av DNA fingerprinting, mycoplasma deteksjon, og celle vitalitet. Caco-2-celler ble dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (Gibco) med 20% FBS. HT-29 og HCT116-celler ble dyrket i McCoys 5a-medium (Gibco) med 10% FBS. SW1116, SW480 og SW620-celler ble dyrket i Leibovitz L-15 medium (Gibco) med 10% FBS. LoVo ble dyrket i F-12K Medium (Gibco) med 10% FBS. Alle celler ble dyrket i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 og 95% luft, bortsett fra SW1116, SW480 og SW620, som ble dyrket i 100% luft ved 37 ° C.
Immunhistokjemi
immunohischemistry, vevssnitt (5
um) ble kuttet fra rutinemessige blokker, de-paraffinized med xylen, rehydrert, og underkastes varme-induserte epitop gjenfinning (HIER) metoder før inkubering med de aktuelle antistoffer. Snittene ble neddykket i 10
mM natriumcitratbuffer ved pH 6,0 og ble deretter oppvarmet i en trykkoker for 10
min. Etter skylling i rennende vann og PBS, ble seksjonene inkubert i TBST /5% normalt geiteserum blokkeringsløsning i 0,5 timer ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med et monoklonalt anti-human CCR6 antistoff (1:50 fortynning; R D System, klone: # 53103). Denne fortynning ble betraktet som optimalt etter antistoff-titrering ved bruk av humant tonsil som en positiv kontroll. Et irrelevant muse-IgG
2b antistoff ble anvendt som en isotype-kontroll i alle tilfeller for å demonstrere at fargingen var spesifikk for CCR6. På neste dag, ble deler merket med en passende HRP-konjugert sekundært antistoff, utviklet med diaminobenzaminidine (DAB) og kontra med hematoksylin.
Evaluering av Immunohischemistry Farging
For visuell vurdering, vurdering av farging ble utført uavhengig av to patologer som var blindet for kliniske data for pasienter. Som tidligere utført av andre [18], skapte vi en immunoreactive poengsum ved å multiplisere poengsum for prosent av positive celler, og utlignet for fargeintensitet. Poengsummen for prosentandelen av positive tumorceller ble gradert som følger: 0, none; 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; og 4, 75-100%. Farging intensitet ble vurdert som følger: 0, none; 1, svak; 2, middels; og 3, intens. Vi delt alle prøver (n = 191) inn i to grupper (lav eller høy CCR6 uttrykket) i henhold til median prinsipp. For å sammenligne den differensielle CCR6 ekspresjon i kreft colonic vev og matchede normale tilstøtende vev i hvert klinisk stadium, ble kvantifisering av det spesifikke CCR6 farging intensitet utført ved å bruke bilde-gel-programvare (IPWIN60). Kort sagt ble det CCR6 farging av alle kreft colonic vev og passet tilstøtende ikke-kreft i kolon vev på vevet matrise chip fotografert med et mikroskop ved 100 gangers forstørrelse (Carl Zeiss). Bildet gel programvare (IPWIN60) ble brukt til å beregne OD verdiene i tatt bilder. Median OD verdien til tre bilder fra hver kjerne på vevet array-lysbildene ble brukt, og differensial CCR6 uttrykk i svulsten og matchet normale tilstøtende vev ved hver klinisk stadium ble sammenlignet.
Wound Healing analysen
HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr, SW1116
CCR6, SW480
shCtr, SW480
shCCR6, LoVo
shCtr og LoVo
shCCR6 celler ble separat sådd inn i seks-brønns plater, kultur før nesten 80% sammenflytende, og serumsultede for 24
timer. Kunstige sår ble laget ved å skrape monolagene med en steril 10
μ
l spiss, og cellene ble vasket med PBS flere ganger for å fjerne flytende celler. Representative bilder av celler migrerer i sårene ble tatt til fange etter 0 timer og 24 timer under et mikroskop (20 ×).
Transwell Migration Analyse
Transwell kamre består av 8-mikrometer porestørrelse membranfilter innsatser (Corning, USA) ble anvendt for å bestemme cellemigrering evne. FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende. Kort, HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr, SW1116
CCR6, SW480
shCtr, SW480
shCCR6, LoVo
shCtr og LoVo
shCCR6 cellene ble høstet og resuspendert i serumfritt medium. En mengde på 3 × 10
4 celler ble lagt inn i det øvre kammer og inkubert i 24
timer ved 37 ° C. Celler som hadde migrert gjennom membranen til den nedre overflate ble fiksert med kald metanol for 10
minutter ble beiset med 0,1% krystallfiolett i 30
min, vasket, lufttørket, fotografert og utgjorde .
Colony Forming analyse
HCT116
Ctr, HCT116
CCR6, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler ble hver utsådd i seks-brønns plater ved en tetthet på 600 celler /brønn. Mediene ble skiftet to ganger i uken, og etter 14 dager ble cellene fiksert med metanol i 10 minutter og farget med 0,5% krystallfiolett i 15 min, skylles tre ganger med PBS for å fjerne overskudd av fargestoff, fotografert og telles.
Western blot analyse
følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt til western blotting: human CCR6 (# 14-1969, eBioscience ™ San Diego, USA), mus CCR6 (# ab78429, Abcam), β-Actin ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (# 4691, Cell Signaling teknologi), fosfor-Akt (Ser473) Rabbit mAb (# 4060, Cell Signaling teknologi), fosfor-Akt (Thr308) (C31E5E) Rabbit mAb (# 2965, Cell Signaling teknologi), P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (137F5) Rabbit mAb (# 4695, Cell Signaling teknologi), fosfor-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) Rabbit mAb (# 4376, Cell Signaling teknologi). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626201, Biolegend), uPAR (# sc-10815, Santa Cruz Biotechnology), CDH1 (# 3195P, Cell Signaling teknologi), KISS-en (# sc-18134, Santa Cruz Biotechnology ), og TIMP2 (# 635401, Biolegend). Western blot-analyse ble utført som tidligere er publisert [22].
Vector konstruksjon
lentiviral vektor PGC-FU-Luc ble konstruert ved å innføre den ildflue luciferase-genet (Luc) nedstrøms for CMV-promoteren i plasmidvektoren PGC-FU som bærer neomycinresistensgenet. Den lentiviral shuttle vector pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 ble konstruert for å stabilt overuttrykker CCR6 i Luc-HCT116. I korte trekk ble det 1125 bp kodende sekvens av humant CCR6 (NM_004367) amplifisert fra cDNA-templat av humane PBMC og subklonet inn i Xhol og BamHI-setene av den pLVX-IRES-ZsGreen1 vektor (Clontech Laboratories, USA). Den lentiviral shuttle-vektoren pLVXshRNA2 (Clontech Laboratories, USA) ble anvendt for å uttrykke shRNAs fra U6 promoteren. I tillegg til å uttrykke shRNAs, pLVX-shRNA2 uttrykker også den grønne fluorescerende protein ZsGreen1. For knockdown av CCR6 ble fire mål sekvenser designet. De målsekvenser som ble benyttet var som følger: shCCR6-1, 5′-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 «; shCCR6-2, 5»-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 «; shCCR6-3, 5’TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 «; shCCR6-4, 5’GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 «. Egge kontroll, 5’TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 «. I korthet, den komplementære DNA-oligonukleotider som besto av en sekvens-spesifikk 21 nukleotid etterfulgt av loop-sekvensen (CTCGAG) og til slutt den omvendte komplement av det målsøkende sekvens ble syntetisert, glødet, og satt inn i pLVX-shRNA2 vektor (Clontech) mellom BamHI og EcoRI-seter nedstrøms fra U6-promoteren. Fire pLVX-shRNA2-CCR6 shuttle plasmid var forbigående transfeksjon inn i HEK 293 T-celler med lipofectine, ble RT-PCR screenet for en mest mulig effektiv CCR6 mRNA uttrykk knockdown, en ShCCR6-1 plasmid viser nesten 75% redusert CCR6 mRNA i SW480 celler var plukke opp for følgende stabil CCR6 knockdown CRC cellelinje konstruksjon.
Lentivirus Produksjon og Transduksjon
lentiviruses ble produsert og høstet 72 timer etter transfeksjon av 293 T-celler med lentiviruses og emballasje plasmider pMD2.G og psPAX2 hjelp ProFection pattedyr Transfeksjon System (Promega). Etter filtrering gjennom et 0,45 mikrometer med lav proteinbinding-polysulfonsyrer filter (Millipore), ble supernatanten samlet opp separat og sentrifugert i 10 min ved 2000 x g, 4 ° C før filtrering gjennom et 0,45 mikrometer porestørrelse filter igjen. Gjennomstrømnings ble anvendt direkte i den transduksjon av humane kolorektale cancerceller. For knockdown forsøket ble seks klonale linjer screenet for CCR6 uttrykk ved Western blotting. Stabilt transfekterte SW480 og LoVo-cellelinjer som viser effektivt redusert CCR6 protein, ble siktet og ytterligere renset ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering for nedstrøms eksperimenter. For overekspresjon eksperiment ble to omsatte HCT116 cellelinjer generert: HCT116 overekspresjon ZsGreen1 (HCT116
Ctr) og HCT116 overekspresjon de bicistronisk CCR6-ZsGreen1 gener (HCT116
CCR6). Den ZsGreen1
+ HCT116-celler eller ZsGreen1
+ CCR6
+ HCT116-celler ble ytterligere renset ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering og ekspandert i kulturmediet. Tilsvarende Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler ble også generert. I tillegg ble tre transduserte HCT116-cellelinjer produsert for
in vivo eksperimenter
: HCT116 stabilt overuttrykker den Luc-genet (Luc-HCT116) med G418-seleksjon, HCT116 med overuttrykke den Luc-genet og ZsGreen1 genet (Luc-HCT116
Ctr), og HCT116 med overekspresjon av Luc genet og bicistronisk CCR6-ZsGreen1 gener (Luc-HCT116
CCR6). ZsGreen1
+ Luc-HCT116-celler eller ZsGreen1
+ CCR6
+ Luc-HCT116-celler ble ytterligere renset ved fluorescens aktivert cellesortering og utvidet i kulturmedier.
Menneskemetastase PCR Array
HCT116
Ctr eller HCT116
CCR6 cellene ble lysert direkte i TRIzol reagent, og total RNA ble ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, California). Deretter ble Super Script III syntese system (Invitrogen) anvendt for cDNA syntese. Sanntids-PCR ble utført på hver prøve ved hjelp av Menneskelig tumormetastase RT
2 Profiler PCR Array (Super Array Bioscience, USA) på en ABI 7900HT hurtig real-time PCR-system (Applied Biosystems, USA). Menneskelig β-Actin ble ansatt for normalisering av ΔΔCt metoden.
Experimental
in vivo
levermetastaser Modell
Liver metastatisk kapasitet ble bestemt ved å injisere 1 x 10
6 celler per mus i milten av Balb /c nakne mus. I korte trekk ble BALB /c nakne mus som bedøvet ved i.p. injeksjon av Pelltobarbitalum Natricum, og 1 x 10
6 HCT116
Ctr eller HCT116
CCR6 tumorceller i 25 pl ble injisert inn i milten exteriorized med en insulinsprøyte (BD selskap) etter abdominal innsnitt. Fem minutter etter celleinjeksjon, ble miltblodårer ligert, og milten ble fjernet. Til slutt, abdominal såret ble lukket med stifter. Etter 5 uker, ble musene avlivet og leveren ble deretter fjernet og fotografert.
Experimental
in vivo
Lung Metastase Modell
Seven 7 uker gamle BALB /c naken mus i hver gruppe ble injisert med Luc-HCT116
Ctr eller Luc-HCT116
CCR6 celler. I korthet, 5 x 10
6-celler suspendert i 200 ul PBS ble injisert i halevenen til hver BALB /c naken mus. Etter 6 uker ble dyrene avlivet og undersøkt makroskopisk og mikroskopisk for tilstedeværelse av metastaser. For hele kroppen små dyr avbildning ble mus gitt 150 ug /g D-luciferin substrat i steril PBS ved intraperitoneal injeksjon, og deretter bedøvet med isofluran. Bioluminesens bildene ble tatt med en CCD (Xenogen IVIS 200 System, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, USA) innen 15 minutter etter underlaget injeksjon.
syngene Graft CRC Modell og anti-CCR6 Therapy
CMT93 celler i 100 mL PBS ble injisert subkutant (sc) i seks uker gamle mannlige CCR6
– /- mus (1 × 10
6 celler /mus), eller CT26 celler i 100 ul PBS ble injisert sc til 7 uker gamle BALB /c-mus (1 x 10
6 celler /mus). Ti dager etter tumorcelle-inokulasjon, når tumorcellene som dannes faste tumorvev podet CCR6
– /- mus eller BALB /c-mus ble tilfeldig delt i to grupper for behandling med IgG kontroll eller anti-CCR6. Tyve mikrogram av IgG
2A (R 0,05, **
p
0,01, og ***
p
0,001.
Resultater
oppregulering av CCR6 er korrelert med tumorprogresjon
for å undersøke den kliniske relevansen av oppregulert CCR6 i CRC, samlet vi 191 parafininnstøpte primære CRC vevsprøver (tabell S1), og CCR6 uttrykk nivåer ble undersøkt i alle disse prøvene ved hjelp av immunhistokjemi. Korrelasjonen av CCR6 uttrykk med clinicopathological funksjoner og overlevelse av CRC pasienter ble oppsummert (tabell S2). Statistiske analyser viste at CCR6 uttrykk var signifikant korrelert med klinisk stadium (
p
= 0,0117), N-klassifisering (
p
= 0,0309), M klassifisering (
p
= 0,0334) og vital status (
p
= 0,0019) hos pasienter med CRC (tabell S2). Videre fant vi at CCR6 uttrykket ble markert oppregulert i alle analysert kliniske CRC-prøvene, men var bare påvises ved lave nivåer i paratumor vev (figur 1A), og univariat analyse avdekket en sterk sammenheng mellom CCR6 fargeintensitet og tumorstadier (n = 14,
p
= 0,0039; n = 104,
p
0,0001, n = 57,
p
0,0001, n = 16,
p
= 0,0005) (figur 1B). Disse data tyder på at CCR6 oppregulering er sterkt assosiert med den kliniske utviklingen av menneskelig CRC.
(A) Immunhistokjemisk farging av CCR6 i primær CRC avledet fra 191 CRC pasienter med klinisk stadium I-IV. (B) Digital bildeanalyse ble utført for å telle flekker intensitet CCR6 område fraksjon (CCR6-AF) verdier av sammenkoblede para-tumor /tumorprøver i hvert klinisk stadium, Wilcoxon test.
oppregulert CCR6 Indikerer dårlig Prognose for CRC Pasienter
Viktigere, viste vi at CCR6 uttrykket ble omvendt korrelert med overlevelsestiden (
p
0,001) (figur 2A). Videre CCR6 uttrykk ble korrelert med total overlevelse for gruppen av pasienter på ulike klinisk stadium, vesentlig i stadium IV (
p
0,05) (figur 2B-E). I tillegg univariate og multivariate analyser viste at M klassifisering og CCR6 uttrykk ble hver anerkjent som uavhengige prognostiske faktorer i CRC (tabell S3). Sammen utgjør disse data tyder på at CCR6 har potensial klinisk verdi som en prediktiv biomarkør for sykdommen utfallet i CRC-pasienter.
(A) Kaplan-Meier-kurver av CRC pasienter med lav versus høy uttrykk for CCR6 (n = 191,
p
0,001, log-rank test). (B) Kaplan-Meier-kurver av CRC pasienter med lav versus høy uttrykk for CCR6 i klinisk fase I (n = 14,
p
= 0,0679, log-rank test). (C) Kaplan-Meier-kurver av CRC pasienter med lav versus høy uttrykk for CCR6 i klinisk stadium II (n = 104,
p
= 0,0738, log-rank test). (D) Kaplan-Meier-kurver av CRC pasienter med lav versus høy uttrykk for CCR6 i klinisk fase III (n = 57,
p
= 0,1749, log-rank test). (E) Kaplan-Meier-kurver av CRC pasienter med lav versus høy uttrykk for CCR6 i klinisk stadium IV (n = 16,
p
= 0,0429, log-rank test).
knockdown av CCR6 Hemmer migrering av CRC Cells
in vitro
den observerte CCR6 overekspresjon hadde en sterk tilknytning til CRC progresjon, noe som fikk oss til å undersøke effekten av CCR6 på CRC celle migrasjon evne . To CRC cellelinjer, SW480 og LoVo, som uttrykte den høyeste CCR6 uttrykk for kolorektal cellelinjer vi analysert, ble brukt til å lage underlinjer med CCR6 stabilt banket ned av shRNA (figur 3A, B). Påfallende, viste resultatene at den knockdown av CCR6 forårsaket en betydelig undertrykkelse av cellemigrasjon i både SW480 og LoVo cellelinjer i et sårhelende assay (
p
0,05, figur 3C). Vi har også brukt en annen klassisk transwell-analyse for å vurdere bidraget av CCR6 på cellemigrering. Vi viste at ablasjon av CCR6 markert redusert migrasjon av både SW480 og LoVo cellelinjer (
p
0,01, Figur 3D). Til sammen våre data tydet på at den spesifikke knockdown av CCR6 i CRC cellelinjer kan redusere cellemigrasjon
in vitro.
(A) Western blotting-analyse av CCR6 nivåer i 7 dyrket CRC celle linjer. Verdier ble uttrykt som gangers endring relativt til Caco-2, og normalisert til p-aktin. (B) Western blotting-analyse av knockdown av CCR6 i SW480 og LoVo celler, β-actin fungert som en lasting kontroll. Verdier ble uttrykt som fold endringer i forhold til kontroller (ShCtr), og normalisert til p-aktin. (C) sårhelende analyser for motilitet av CCR6-forstummet SW480 og LoVo celler og kontrollceller. Representative bilder av ett felt i begynnelsen (t = 0 timer) (øvre panel) og ved slutten av opptaket (t = 24 timer) (nedre panel) i hver tilstand er vist. Den relative cellemigrasjon i ShCtr og shCCR6 grupper vises i panelet til høyre. (D) Representative bilder av Transwell migrerte celler i CCR6-forstummet SW480 og LoVo celler (nedre panel) eller kontrollceller (øvre panel) celler. Antallet migrerte celler i ShCtr og shCCR6 grupper vises i panelet til høyre. Verdier representerer mener fra tredoble brønner, ± S.D. *
p
0,05, **
p
0,01, Wilcoxon test. Dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
CCR6 Fremmer Aggressivitet av CRC Cells
in vitro
For å undersøke om ektopisk overekspresjon av CCR6 kunne forbedre aggressivitet av CRC celler, HCT116, ble Caco-2 og SW1116 cellelinjer stabilt uttrykker ektopisk CCR6 etablert (Figur 4A). Påfallende, både sårtilheling og migrasjonskammer analyser viste at CCR6 overekspresjon utpreget forbedret celle migrasjon sammenlignet med kontrollgruppene (
p
0,05 eller
p
0,01) (figur 4B, C) . I tillegg, under prosessen med å etablere CCR6 stabile cellelinjer, oppdaget vi at det var flere kolonidannelse i CCR6-transfekterte celler enn kontroll-transfekterte celler. Vi utførte derfor kolonidannelse analyser ved hjelp av stabilt transfektert HCT116
CCR6, HCT116
Ctr, Caco-2
Ctr, Caco-2
CCR6, SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler . Igjen, vi bemerket at i forhold til kontroll (CTR) celler, størrelsen og antall kolonier dannet i CCR6 overekspresjon HCT116, Caco-2 og SW1116 celler ble signifikant økt (
p
0,05) (figur 4D) . Til sammen våre data gi bevis på at den forhøyede uttrykk for CCR6 spiller en avgjørende rolle i den aggressive fenotype av CRC celler
in vitro
.
(A) Western blotting-analyse av ektopisk uttrykk for CCR6 i HCT116
Ctr og HCT116
CCR6 celler eller Caco-2
Ctr og Caco-2
CCR6 eller SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler. β-actin fungert som en lasting kontroll. Verdier ble uttrykt som fold endringer i forhold til kontroller (CTR) og normalisert til p-aktin. (B) sårhelende analyse for bevegelighet av HCT116
Ctr og HCT116
CCR6 eller Caco-2
Ctr og Caco-2
CCR6 eller SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler . Representative bilder av ett felt i begynnelsen (t = 0) (øvre panel) og ved slutten av opptaket (t = 24 timer) (nedre panel) i hver tilstand er vist. Den relative cellemigrasjon i CCR6 og kontrollgrupper er vist i høyre panel. (C) Representative bilder av Transwell migrerte celler i stabilt transfektert HCT116
Ctr, Caco-2
Ctr, SW1116
Ctr (øvre panel) eller HCT116
CCR6, Caco-2
CCR6, SW1116
CCR6 (nedre panel) celler. Gjennomsnittlig antall migrerte celler av HCT116
Ctr og HCT116
CCR6 eller Caco-2
Ctr og Caco-2
CCR6 eller SW1116
Ctr og SW1116
CCR6 celler er vist i panel rett. (D) Representant bilde av kolonidannelse i HCT116
Ctr, Caco-2
Ctr, SW1116
Ctr (øvre panel) eller HCT116
CCR6, Caco-2
CCR6, SW1116
CCR6 celler (nedre panel). Verdier representerer mener fra tredoble brønner, ± S.D. *
p
0,05, **
p
0,01, Wilcoxon test. Dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Overuttrykte CCR6 forenkler metastasering av CRC Cells
in vivo
Leveren er den vanligste stedet for kolorektal kreft metastasering. For å bestemme hvorvidt CCR6 spiller spesielt en viktig rolle i den levermetastaser av CRC, vi etablert en eksperimentell
in vivo
levermetastase modell ved å injisere humane tumorceller inn i milten av Balb /c naken mus og deres evne til å etterfulgt invadere via portvenen til leveren til å danne metastaser. For å definere forholdet mellom CCR6 og CRC levermetastaser
in vivo
, seks syv uker gamle BALB /c naken mus i hver gruppe ble injisert med HCT116
Ctr eller HCT116
CCR6 celler i milten før splenektomi. Etter 5 uker ble musene drept, og de metastatiske tumorknuter som dannet i leveren ble undersøkt. Påfallende, metastatisk tumornoduler ble oftere funnet i leveren hos den HCT116
CCR6 gruppe enn HCT116
Ctr gruppe (figur 5A, angitt med hvite piler). Disse resultatene tyder på at CCR6 overekspresjon i kreftceller kan forbedre levermetastaser av CRC. I tillegg har vi brukt hele kroppen lite dyr fluorescens bildesystem (IVIS) for å overvåke migrasjon av tumorceller
in vivo
. Først, konstruerte vi den stabilt uttrykte luciferase cellelinje, luciferase-HCT116 ved å transfektere HCT116-celler med luciferase lentivirus, og velges disse cellene med G418.
