Abstract
Bakgrunn
Kaempferol har blitt foreslått som et potensielt stoff for kreft chemoprevention og behandling fordi det er en naturlig polyfenol som inneholdes i plante-baserte matvarer. Nyere studier har vist at kaempferol beskytter mot hjerte- og karsykdommer og kreft. Basert på dette funnet, undersøkte vi de mekanismer som kaempferol produserer anti-metastatisk effekt i menneskelig tunge plateepitelkarsinom SCC4 celler.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien har vi gitt molekylær bevis forbundet med den antimetastatiske virkning av kaempferol ved å demonstrere en betydelig undertrykkelse av SCC4 celle migrering og invasjon. Denne effekten var assosiert med redusert uttrykk for MMP-2 og TIMP-2-mRNA og proteinnivåer. Analyse av den transkripsjonelle regulering indikerte at kaempferol hemmet MMP-2-transkripsjon ved å hemme c-Jun-aktivitet. Kaempferol produserte også en hemmende effekt på fosforylering av ERK1 /2.
Konklusjoner
Disse funnene gir ny innsikt i de molekylære mekanismene som er involvert i anti-metastatisk effekt av kaempferol, og er verdifulle i forebygging av kreft i munnhulen metastaser
Citation. Lin CW, Chen PN, Chen MK, Yang WE, Tang CH Yang SF, et al. (2013) Kaempferol Reduserer matriksmetalloproteinase-2 uttrykk ved å nedregulere ERK1 /2 og Activator Protein-1 signalveier i oral cancer celler. PLoS ONE 8 (11): e80883. doi: 10,1371 /journal.pone.0080883
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 18 oktober 2013; Publisert: 20.11.2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert med tilskudd fra National Science Council, Taiwan (NSC-100-2632-B-040-001-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er den sjette vanligste kreftformen i verden og den fjerde største årsaken til kreft dødsfall blant menn i Taiwan [1]. Kirurgi og strålebehandling er en kritisk behandlingsform i den tidlige fasen av OSCC [2]. Til tross for fremskritt i terapi, er OSCC fortsatt karakteriseres som gjennomgående og metastaser til regionale cervical lymfeknuter, som produserer dårlige pasienten prognoser. Den 5 års overlevelse av kreftpasienter er mindre enn 50%, men sjansene for tidlig diagnose og forebygging av denne sykdommen er egnet til å øke hvis den molekylære mekanismen er identifisert [3]. Selv om årsaken til OSCC er multifaktoriell, metastase, som er motstandsdyktig overfor konvensjonell terapi, er sannsynlig å være den viktigste årsaken til død [4].
Nedbrytning av basalmembraner og stromale ekstracellulære matriks (ECM) komponenter utgjør en avgjørende prosess i løpet av lokale vev invasjon og metastasering [5]. Ved å skille proteolytiske enzymer, kan kreftceller lage en bane for å migrere både lokalt og fjernt. Matriks-metalloproteinaser (MMP) tilhører en familie av sink-avhengige endopeptidaser som bryter ned flere komponenter i ECM [6]. Strukturen og substrat for MMP’er familien gjør at den kan bli delt inn i undergrupper av kollagenaser, stromelysiner, gelatinaser, membran-type MMP og andre MMP’er [7]. Dette er avgjørende for normale fysiologiske prosesser slik som embryoutvikling, inflammasjon, angiogenese, og sårheling. Imidlertid har nyere forskning har vist at høye nivåer av MMP er ofte korrelert med humane kreftformer, slik som lunge [8], bryst [9], lever [10], og oral cancer [11]. Aktivitetene til MMP’er er regulert av fysiologiske inhibitorer, vev-inhibitorer for metalloproteinaser (TIMPs) [12]. Ubalansen av aktive MMP og TIMPs er et avgjørende element involvert i ombygging av ECM utstilt i en rekke sykdomstilstander [13]. Gohji et al. foreslo at serum MMP-2:. TIMP-2-forholdet er en uavhengig prognostisk indikator på urothelial kreft tilbakefall [14]
Flavonoids er polyfenoliske forbindelser som finnes i frukter og grønnsaker [15]. Flavonoider er vanligvis brukes i kardiovaskulær sykdom forebygging [16], [17]. I tillegg har tidligere undersøkelser vist at diett flavonoider hemme utviklingen av forskjellige humane kreftformer, slik som brystcancer [18], prostatakreft [19] og tykktarmskreft [20]. Kaempferol, en naturlig polyfenol som hører til gruppen flavonoid, er til stede i høye nivåer i te, vindruer, brokkoli, og bær [21], [22]. Flere tidligere studier har indikert at kaempferol oppviser antioksidant [23], anti-betennelse [24] og anti-tumor egenskaper [25]. Det er minst seks forskjellige typer av flavonoider. Kaempferol tilhører flavonol og har en lignende struktur som quercein og myricetin, som også har anti-kreft effekt [26]. Kaempferol ble funnet å hemme angiogenese og VEGF-ekspresjon i humane eggstokkreft celler, og trasé som er involvert i reguleringen av HIF-1α [27]. Kaempferol produserte også en apoptose effekt gjennom AKT uttrykk i humane glioma celler [28] og leukemiceller [29]. Nyere studier har indikert at kaempferol induserer G2 /M cellesyklus arrest og autophagic celledød i humane leverkreftceller [30]. Dessuten, Kang et al., Rapporterte at kaempferol og quercetin indusert caspase-3-avhengig apoptose i orale hulrom kreftceller [31]. Effekten av kaempferol på kreft metastasering av OSCC, og de underliggende mekanismene for denne effekten, har ennå ikke blitt studert. I denne studien, viser vi at undertrykkelsen av metastatisk evne ved kaempferol er produsert av nedregulering av MMP-2 uttrykk, og vi håper å kunne gi et grunnlag for videre forskning.
Materialer og metoder
celle og cellekultur
SCC-4, en human tunge squamous cell carcinoma cellelinje oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med et like stort volum av et næringsstoff blanding, F-12 Hams medium (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 10% føtalt bovint serum (Hyclon Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin , og 400 ng /ml hydrokortison. Alle cellekulturer ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Celleviabilitet assay (MTT måle)
SCC4-celler ble sådd ut i 24-brønners plater ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn og behandlet med kaempferol i en konsentrasjon mellom 0-100 uM ved 37 ° C i 24 timer. Etter eksponeringsperioden, ble mediet fjernet, og cellene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter inkubert med 20 ul MTT (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) for fire h. Den levedyktig celle nummer per parabolen er direkte proporsjonal med produksjonen av formazanforbindelsen, ved dehydrogenases i mitokondriene i levende celler, som kan måles spektrofotometrisk ved 563 nm følgende solubilization med isopropanol.
Cell migrasjon og invasjon analyser
etter en behandling med kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 og 100 pM) i 24 timer, overlevende celler ble høstet og sådd ut i Boyden kammer (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) ved 10
4 celler /brønn i serumfritt medium og deretter inkubert i henholdsvis 24 timer eller 48 timer ved 37 ° C i migreringsanalyse eller invasjon assay,. For invasjon assay, 10 ul Matrigel (25 mg /50 ml; BD Biosciences, MA, USA) ble påført på 8 um porestørrelse polykarbonat membranfiltrene og den nederste kammer inneholdt standard medium. Den invaderte celler ble fiksert med 100% metanol og farget med 5% Giemsa. Celleantallet ble tellet under et lysmikroskop. Migrasjonen Analysen ble utført som beskrevet i invasjonen analysen uten belegg av Matrigel.
Gelatin underlaget gel zymografi
Aktivitetene MMP-2 i betinget medium ble målt ved gelatin Zymografi protease analyser . I korthet ble samlet medier med et passende volum (justert med vital cellenummer) fremstilt med SDS-prøvebuffer uten koking eller reduksjon og underkastet 0,1% gelatin-8% SDS-PAGE-elektroforese. Etter elektroforese, ble gelene vasket med 2,5% Triton X-100, og deretter inkubert i reaksjonsbuffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl
2 og 0,01% NaN
3) i 12 timer ved 37 ° C. Deretter gel ble farget med Coomassie brilliant blue R-250. Bånd tilsvarende MMP-2 aktivitet ble visualisert ved hjelp av negativ farging 0,3% Coomassie-blått i 50% metanol og 10% eddiksyre.
Western blot-analyse
Cellulære lysater ble fremstilt ved å suspendere 2 x 10
6/10 cm fatet i 200 mL av RIPA buffer som inneholder proteasehemmere cocktail. Cellelysater ble utsatt for en sentrifugering med 10.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, og det uløselige pellet ble kastet. Proteinkonsentrasjonen av de totale cellelysatene ble bestemt ved Bradford-analysen. De 20 mikrogram prøver av totale cellelysater eller atom fraksjonene ble separert ved SDS-PAGE på 10% polyakrylamid geler og overført på en nitrocellulosemembran ved hjelp av Mini-Protean Tetra Electrophoresis System som tidligere beskrevet [32]. Blottet ble deretter inkubert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk binding, og deretter over natten med polyklonale antistoffer mot MMP-2, TIMP -2 eller tre MAPK (ERK 1/2, 1/2 JNK og p38) med de spesifikke antistoffer til ufosforylerte eller fosforylerte former av det tilsvarende ERK 1/2, 1/2 JNK og p38. Blottene ble deretter inkubert med et pepperrotperoksidase geit-anti-kanin eller anti-mus IgG i 1 time. Etterpå signal ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) kommersielt sett (Amersham Biosciences) og relativ fotografisk tetthet ble kvantifisert ved å skanne de fotografiske negativer på en gel dokumentasjon og analysesystem (AlphaImager HP System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA).
RNA isolering, semi-kvantitativ RT-PCR og Taqman kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert fra 1 x 10
6 SCC4 celler ved hjelp Trizol (Life Technologies Grand Island, NY) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (2 pg) ble reverstranskribert inn i cDNA ved Superscript III First-Strand Synthesis Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR ble utført i en reaksjonsblanding inneholdende 2 ul cDNA, 0,2 mM dNTP-blanding, 2 uM av hver primere, en U Taq DNA-polymerase, og ett gangers konsentrasjon av termisk Pol buffer (New England Biolabs, MA, USA) ved denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av amplifisering av angitte sykluser på 95 ° C i 30 sek, 62 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sek. De spesifikke primer-sekvensene for disse genene er som følger: MMP-2: 5′-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 «(fremover), 5′-GGCATCCAGGTTATCGGGG A-3′ (revers), og TIMP-2: 5»-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3 « (fremover), 5»-CACAGGAGCCGTCACTTCTCTTG-3 «(bakover). Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført ved anvendelse av Taqman ett-trinns PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng av total cDNA ble tilsatt pr 25 ul reaksjon med MMP-2 eller GAPDH-primere og TaqMan prober. De MMP-2 og GAPDH primere og prober ble utformet ved hjelp av kommersiell programvare (ABI PRISM Sequence Detection System, Applied Biosystems). Kvantitative real-time PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer på en StepOnePlus sekvens detection system. Terskelen ble satt over den ikke-mal kontroll bakgrunn og innenfor den lineære fasen av målet genamplifisering å beregne syklusen nummeret som karakterutskriften ble oppdaget.
luciferasereportergenet analysen
SCC4 celler ble sådd ved en konsentrasjon på 5 x 10
4 celler per brønn i 6-brønners cellekulturplater. Et fragment av MMP-2-promotor ble innsatt i pGL3-basisvektor for å generere MMP-2-promotor plasmidet. Etter 24 timers inkubering, pGL3-basis (vektor) og MMP-2-promotor plasmidet ble ko-transfektert med et β- galaktosidase-ekspresjonsvektor (pCH110) inn i celler ved hjelp Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Etter 12 timer med transfeksjon, ble cellene behandlet med bærer eller kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 og 100 pM) i 24 timer. Luciferase og β-galaktosidase-aktivitet ble analysert i henhold til produsentens protokoll (Promega). Luminescens ble målt ved anvendelse av en Microplate Tropix TR717 Luminometer (Applied Biosystems). Verdien av luciferase-aktiviteten ble normalisert til transfeksjonseffektivitet og overvåkes av β-galaktosidase-ekspresjon.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse
AP-1-bindingsanalyser i nukleære ekstrakter ble utført med biotin-merket dobbelt -stranded c-jun oligonukleotider (5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 «), og den elektroforetiske mobilitet skift analyse ble utført ved hjelp av Lightshift kit (Promega). I korthet bindingsreaksjoner inneholdende 10 ug av kjerneprotein, 10 mM Tris, 50 mM KCl, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl
2, 2 ug poly (dI · dC) og 2 pmol av oligonukleotid-probe ble inkubert i 20 min ved romtemperatur. Protein DNA-kompleksene ble separert ved elektroforese på en 6% ikke-denaturerende akrylamidgel, overført til positivt ladet nylonmembraner og deretter tverrbundet i et Stratagene tverrbindingsmiddel. Gel-skift ble visualisert med et streptavidin-pepperrot-peroksidase etterfulgt av kjemiluminescens deteksjon. De umerkede oligoer av AP-1 på 200 × ble tilsatt for å konkurrere spesielt med merket oligo bindende i den konkurranseutsatte EMSA.
Chromatin immunpresipitasjonsanalyse (chip)
Chromatin immunpresipitasjonsanalyse ble utført som beskrevet tidligere [33]. I korte trekk, kromatin og proteiner fra tilnærmet 2 x 10
6-celler ble tverrbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Disse cellene ble oppsamlet, lysert, og sonikert på is for å skjære kromatin DNA til en lengde mellom 200 – 1000 basepar ved hjelp av ultralyd 3000 (Misonix, NY, USA). Den ultralydbehandlet kromatin lysatet ble immunopresipitert med anti-c-Jun-antistoff, og samles med protein A /G-agarose-kuler (Pierce, IL, USA). De protein /DNA-tverrbindinger i de immunoutfelt kompleksene ble reversert ved inkubering i 0,2 M NaCl ved 65 ° C i 4 timer, og deretter ble DNA renset og anvendt til PCR som beskrevet ovenfor for å bestemme bindingsevnen av c-Jun til MMP- 2 promoter. Sekvensene av prim er 5′-CTCTTTAGCTCTTCAGGTCTCAGC-3 «(fremover), og 5′-TGTTGGGAACGCCTGACT-3» (bakover).
Statistisk analyse
For alle målinger, analyse av varians etterfulgt av Scheffe posteriori sammenligning ble brukt for å vurdere de forskjeller mellom kontroll og celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av kaempferol. En forskjell på p 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant, og forsøkene ble gjentatt tre ganger
Resultater
Effekt av kaempferol på levedyktigheten til SCC4 celler
Vi har analysert. de cytotoksiske effekter av kaempferol i forskjellige konsentrasjoner (0-100 uM) på SCC4 celler ved hjelp av MTT-analysen. Som vist i figur 1, ved hjelp av kaempferol behandling på SCC4 cellene produserte ingen cytotoksisk virkning på cellenes levedyktighet. Derfor ble dette konsentrasjonsområde på kaempferol anvendt i de følgende eksperimenter.
SCC4 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 40, 60, 80 og 100 uM) av kaempferol i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av et MTT-assay. Verdiene representert gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
Kaempferol hemmer SCC4 celle migrasjon og invasjon
For å undersøke hvorvidt cellen migrasjon og invasjon ble undertrykt av kaempferol, vi sådd SCC4 celler i en Boyden kammer og beregnet antall invasive celler i nærvær av kaempferol. Vi har observert at kaempferol vesentlig hemmet migrering og invasjon av SCC4-celler på en doseavhengig måte, med bare 58% og 56% gjenværende etter en behandling med 100 uM av kaempferol ved henholdsvis 24 timer og 48 timer, (figurene 2A og 2B) .
etter å ha blitt behandlet med kaempferol ved en konsentrasjon på 0, 20, 40, 60, 80 og 100 uM, ble (A) cellemigrering og (B) celle invasjon målt ved bruk av et Boyden kammer for 24 timer og 48 timer, henholdsvis. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Kaempferol reduserer uttrykk for MMP og TIMP
For å vise om undertrykkelse av SCC4 migrasjon ble formidlet ved å regulere MMP-2 uttrykk , en gelatin zymografi analysen ble utført. De gelatin zymografi data indikerte at MMP-2-enzymaktiviteten ble inhibert med 53% ved den høyeste konsentrasjonen av kaempferol (100 pM) (Figur 3A). Figur 3B viser en Western blot-analyse av MMP-2 og TIMP-2 proteinnivåer. Protein nivåer av både MMP-2 og TIMP-2 i det vesentlige redusert. MRNA uttrykk også vist de samme resultatene (figur 3C). Vi har også brukt en kvantitativ real-time PCR-analyse for å bekrefte den MMP-2-mRNA-ekspresjon (figur 3D). Således Kaempferol hemmer betydelig MMP-2-mRNA-ekspresjon i en konsentrasjonsavhengig måte.
SCC4 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 40, 60, 80 og 100 uM) av kaempferol i 24 timer . De kondisjonerte medier ble oppsamlet og aktiviteten til MMP-2 ble påvist (A), eller et western blot med anti-MMP-2 og anti-TIMP-2-antistoffer ble utført (B). (C) semikvantitativ RT-PCR ble utført for å sammenligne MMP-2 og TIMP-2-mRNA-nivåer. (D) Et mRNA-nivåene av MMP-2 ble kvantifisert ved anvendelse av en sanntids-PCR-analyse. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Kaempferol hemmer transkripsjonen aktivitet av MMP-2
For ytterligere å undersøke om kaempferol regulert arrangøren aktivitet av MMP-2, vi utført et luciferase reporter-analyse, og en reporter-gen som inneholdt MMP-2 promoter region ble transfektert inn i cellene SCC4. Som vist i figur 4A, ble MMP-2 promoteraktivitet redusert på en doseavhengig måte, noe som indikerer at kaempferol inhiberer MMP-2-ekspresjonen på transkripsjonsnivået.
(A) SCC4-celler ble transfektert med pGL3 grunn eller en MMP-2 promoter /reporter plasmid, deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 40, 60, 80 og 100 uM) av kaempferol. Etter 24 timers inkubasjon, luciferase-aktivitet ble bestemt og normalisert til p-galaktosidase-aktivitet. (B) Kjerne ekstrakt fremstilt fra SCC4 celler med forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 40, 60, 80 og 100 uM) av kaempferol ble inkubert med biotin-merket AP-1-spesifikke oligonukleotider med konsensussekvensen for AP-1-binding. Bundne komplekser ble analysert ved anvendelse av en elektroforetisk mobilitet skift analyse. (C) Binding av c-Jun til MMP-2-promoteren ble målt ved anvendelse av en chip-analyse. (D) Representative resultater av c-Jun og Fos c-proteinnivåer ved hjelp av western blot-analyse. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Kaempferol reduserer c-Jun /AP-en aktivering i SCC4 celler
Fordi tidligere data viste at AP-en var et sentralt transkripsjonen regulator i MMP-2 fremming [33], ble EMSA og chip-analyser deretter utført for å undersøke effekten av kaempferol på AP-1 DNA-bindende aktivitet. Som illustrert i figur 4B, bindingsaktiviteten av AP-1 til MMP-2 promoteren avtatt betydelig i SCC4 celler etter å ha blitt behandlet med kaempferol på en konsentrasjonsavhengig måte. Spesielt ble bindingskapasitet av AP-1 på promoteren til MMP-2-genet trykt i SCC4 celler etter å ha blitt behandlet med 60 uM kaempferol (figur 4C) .For å bestemme transkripsjonsfaktorer, anvendte vi en Western blot-analyse for å detektere kjernefysisk translokasjon av c-Jun og c-Fos. Behandling SCC4 celler med kaempferol redusert atomtranslokasjon av c-Jun, men ga ingen effekt på nivået av c-Fos (figur 4D).
Kaempferol hemmer fosforyleringen av ERK1 /2
i henhold til de data vi oppsamlet, kaempferol hemmet SCC4 cellemigrering ved å redusere MMP-2-ekspresjon. For ytterligere å undersøke den underliggende mekanisme av anti-metastatisk evne kaempferol i SCC4 celler, anvendte vi en Western blot-analyse for å påvise ekspresjon av MAPK-reaksjonsveier. Figur 5A viser at fosforylering av ERK ble undertrykket etter behandling av cellene med SCC4 kaempferol. Imidlertid fosforyleringen av JNK1 /2 og p38 trasé forble upåvirket (figurene 5B-5C).
SCC4 celler ble behandlet med forskjellige doser av kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 og 100 pM ) i 24 timer og hele cellelysatene fremstilt fra disse celler ble anvendt for western blot-analyse med (A) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK1 /2 og (C) anti-p38 (totalt og fosforylerte) antistoffer som beskrevet i Materialer og metoder. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Effekt av kaempferol på MMP-2 uttrykk for SCC4 celler behandlet med U0126
For å vise om undertrykkelse av MMP-2 ekspresjon av kaempferol oppsto hovedsakelig ved inhibering av ERK1 /to signalveien, ble SCC4 celler behandlet med U0126, en MEK-inhibitor. De gelatin zymografi data viste at MMP-2 Enzymaktiviteten ble undertrykket når bare behandling av kaempferol eller U0126 med 47% og 42%. Imidlertid kombinasjonsbehandling av inhibitoren med kaempferol intensivt redusert MMP-2-enzymaktiviteten med 78% (figur 6A). I tillegg ble tilsvarende resultater oppnådd fra Boyden kammer analysen av cellulær invasjon. Figur 6B viser at både kaempferol og U0126 hemmer celle invasjon, og behandlinger å kombinere disse to kjemiske forbindelser forbedre anti-invasjons aktivitet. Derfor kan hemming av ERK1 /2 signalbaner som resulterer i en redusert ekspresjon av MMP-2, og redusert tumorcelle-migrering.
SCC4-celler ble forbehandlet med U0126 (10 eller 20 uM) for ett time, og deretter inkubert i nærvær eller fravær av kaempferol (60 uM) i 24 timer. (A) Et dyrkningsmedier ble anvendt som emner for analyse av MMP-2 aktivitet, og cellene ble anvendt for invasjon assay (B) som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Diskusjoner
Forbruket av frukt og grønnsaker inneholder flavonoider produserer viktige helsemessige fordeler.. Kaempferol, et flavonoid, viser forskjellige biologiske og farmakologiske effekter, for eksempel antioksidantaktivitet og anti-kreft-relaterte egenskaper [23], [31], [34]. Vår studie brukes SCC4 muntlig plateepitelkarsinom celler, og resultatene indikerer at kaempferol (1) hemmer migrasjon og invasjon av SCC4 celler; (2) reduserer genekspresjon og enzymaktiviteten av MMP-2; (3) reduseres den nukleære translokasjonen av AP-1 til MMP-2-promoteren; og (4) inhiberer fosforylering av ERK1 /2.
Flere tidligere studier har vist at tallrike fytokjemikalier bruke anti-metastase egenskaper ved å undertrykke den enzymaktivitet eller gen-ekspresjon av MMP-2 [35], [36] . Koffeinsyre fenetyl ester hemmer oral cancer cellemetastase ved å regulere MMP-2 og MAPK trasé [11]. Silibinin undertrykker humane osteosarkom MG-63 celle invasjon ved å hemme ERK-avhengig induksjon av MMP-2 [37]. Wang et al observert at PAK5-Egr1-MMP-2 signal styrer migrasjon og invasjon i brystkreftceller [38]. Selv om TIMP-2 var den fysiologiske inhibitor av MMP-2, våre data indikerer at kaempferol reduserer MMP-2 og TIMP-2-mRNA og protein ekspresjon. I tidligere studier, TIMP-2 overekspresjon redusert invasjon og angiogenese, og beskyttet melanom celler fra apoptose [39]. Bourboulia et al. viste at TIMP-2 fremmer en anti-tumor transkripsjonen profil med opp regulerende E-cadherin i lungekreftceller [40]. Men de Vicente et al. viste at uttrykket av TIMP-2 i muntlig plateepitelkarsinom ble korrelert med TNM staging, lokalt tilbakefall, og mindre gunstige overlevelse [41]. Det samme funn ble inkludert i studien utført av Baker et al. som oppdaget høyere gjennomsnittlige nivåer av TIMP-2 i tumorvevet enn i normalt vev [42].
Tidligere studier har demonstrert omfattende rollen av MAPK-reaksjonsveien i regulering MMP’er uttrykk [37], [43], [ ,,,0],44]. Shan et al. indikerte at østrogen kan øke uttrykket av VEGF, og aktivere ERK1 /2 vei til å indusere MMP-2 uttrykk [45]. Silibinin hemmer invasjon av orale kreftceller ved å undertrykke aktivering av ERK1 /2 og MMP-2-ekspresjon [46]. Selaginella tamariscina (Beauv.), En tradisjonell medisinsk plante, besitter antimetastatic effekter på humane osteosarkomceller ved å redusere MMP-2 og MMP-9 sekret gjennom p38 og Akt signalveier [47]. Men vår studie viste resultatene at kaempferol bare hemmer ERK-fosforylering og ingen signifikante effekter var tydelig på JNK og p38 signalveier. Faktisk, som vist i figurene 5-6, kaempferol hemmet fosforyleringen av ERK1 /2, og involvering av MAPK-reaksjonsveien var godt demonstrert ved hjelp av MEK-inhibitor i SCC4 celler, hvilket viser at en behandling ved hjelp av U0126 kan føre til en inhibering av MMP-2 sekresjon og SCC4 celle invasjon.
ekspresjon av MMP-2-genet er regulert av transkripsjonsnivået interaksjonen av AP-1 bindende sekvenser i MMP-2-gen-promoteren [33], [48]. AP-1 er ikke en eneste transkripsjonsfaktor, men en heterodimer bestående av c-Fos og c-Jun familier. Flere rapporter har vist at tallrike medikamenter hemmer kreftmetastase ved å modulere den DNA-bindende aktivitet av AP-1. Hong et al. indikerte at ascochlorin hemmer MMP-9 uttrykk ved å undertrykke AP-1 aktivitet [49]. Nobiletin, en sitrus flavonoid, svekket MMP-7 uttrykk ved å redusere AP-en DNA-bindende aktivitet [50]. Våre nåværende data indikerer at kaempferol reduserte MMP-2 aktivitet av SCC4 celler ved inhibering av AP-1-aktivering. Dette funnet støtter tidligere rapporter som indikerte silibinin undertrykte menneske osteosarkomcellelinje invasjon ved å hemme ERK-avhengige AP-en induksjon av MMP-2 [37]. Imidlertid observerte vi at kaempferol undertrykker bare de c-Jun ekspresjon i kjernen uten å påvirke c-Fos. Alle disse resultatene tyder på at kaempferol inhiberer SCC4 cellemigrering og invasjon ved å redusere MMP-2-genpromoteren bindingsaktivitet av AP-1 transkripsjonsfaktorer, inkludert c-juni
I sammendrag, tyder resultatene på at Kaempferol inhiberer AP-1-aktivitet, reduserer MMP-2-ekspresjon, og deretter undertrykker invasjonen av SCC4 celler. Videre demonstrerte vi at kaempferol inhiberer ERK1 /2 fosforylering, effektivt fører til MMP-2-nedregulering. Disse resultatene antyder at kaempferol kan være en kraftig kandidat i utviklingen av midler anvendt for å forebygge kreft metastasering.
