Abstract
Bakgrunn
levamisol, en imidazo (2,1-b) Tiazolderivat, har blitt rapportert å være en potensiell antitumormiddel. I foreliggende studie har vi undersøkt virkningsmekanismen av en av de nylig identifiserte analoger, 4a (2-benzyl-6- (4′-fluorfenyl) -5-tiocyanato-imidazo [2,1-b] [1] , [3], [4] tiadiazol).
Materialer og metoder
ROS produksjon og ekspresjon av forskjellige apoptotiske proteiner ble målt følgende 4a behandling i leukemicellelinjer. Tumor dyremodeller ble benyttet for å evaluere effekten av 4a i sammenligning med Levamisole på progresjon av bryst adenocarcinoma og overlevelse. Immunhistokjemi og vestlige blotting studier ble utført for å forstå mekanismen av 4a handling både
ex vivo Hotell og
in vivo
.
Resultater
Vi har bestemt IC
50 verdien av 4a i mange leukemi og brystkreft cellelinjer og fant CEM celler mest sensitive (IC
50 5 mm). Resultatene viste at 4a behandling fører til akkumulering av ROS. Western blot analyse viste oppregulering av pro-apoptotiske proteiner t-BID og BAX, ved behandling med 4a. Dessuten, dose-avhengig aktivering av p53 sammen med FAS, FAS-L, og spaltning av caspase-8 antyder at det fremkaller døden reseptormediert apoptotisk reaksjonsvei i CEM-celler. Enda viktigere, vi har observert en reduksjon i tumorvekst og betydelig økning i overlevelse ved oral administrering av 4a (20 mg /kg, seks doser) i mus. Til sammenligning ble 4a funnet å være mer potent enn dets paren analoge Levamisole basert på både
ex vivo
og
in vivo
studier. Videre, immunohistokjemi og Western blotting-studier indikerer at 4a behandling førte til oppheving av tumorcelle-proliferasjon og aktivering av apoptose ved den ytre vei til og med i dyremodeller.
Konklusjon
Således våre resultater tyder på at 4a kunne brukes som et potent kjemoterapeutisk middel
Citation. Hegde M, Karki SS, Thomas E, Kumar S, Panjamurthy K, Ranganatha SR, et al. (2012) Novel levamisol Derivative induserer ytre vei av apoptose i kreftceller og hemmer tumorprogresjon hos mus. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10,1371 /journal.pone.0043632
Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Mexico
mottatt: 13 februar 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 10.09.2012
Copyright: © Hegde et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Lady Tata Memorial Trust, Storbritannia, og Indian Institute of Science oppstart stipend for SCR. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at det ikke er noen konkurrerende interesse
Innledning
Kreft er en vanskelig sykdom å behandle, og bare svært få effektive medisiner er tilgjengelige. Utviklingen av nye, effektive, selektive og mindre giftige kreft terapeutiske molekyler har vært et utfordrende mål. Forståelsen av den molekylære mekanismen som er involvert i kreftformer vil føre til oppdagelse av nye anticancermidler. Endringer i ekspresjonsnivåer av RNA og proteiner på grunn av forskjellige mutasjoner er blitt studert i mange kreftformer, inkludert leukemi og lymfom [1] – [4]. Nylig har det vært et omfattende arbeid for å karakter mekanismen av translokasjon og slettinger som resulterer i leukemi og lymfom [5], [6]. Mange Genfusjonene har også blitt identifisert i prostatakreft og brystkreft [7]. De mest diskuterte proteiner ansvarlig for leukemi og lymfom i den siste tiden er de rekombinasjon aktivere gener (filler, enzymet ansvarlig for antistoff mangfold) [5], [6] og aktivering indusert deaminase (AID, enzymet ansvarlig for somatisk hypermutasjon og klasse bryter rekombinasjon) [5], [8]. Men enzymene som er ansvarlige for utviklingen av Genfusjonene er ennå ikke identifisert.
De siste to tiårene har sett en dramatisk endring i kreftbehandling paradigmer. For eksempel, Imatinib (Gleevac), et stoff som utvikles mot den aktiverte tyrosinkinase hos kronisk myelogen leukemi, er en av slike store fremskritt [9]. I tillegg har mange andre forbindelser også blitt identifisert og klinisk testet. Selv om suksessen til kliniske studier for å identifisere nye agenter og behandlingsmetoder har vært betydelig, dagens behandlinger har mange begrensninger. Dette inkluderer bivirkninger indusert av medikamenter og ervervet resistens [10]. Således er behovet for utvikling av effektive anti-kreft terapeutiske midler med veldefinerte farmakokinetiske egenskaper er av stor betydning.
For tiden er det forskjellige måter ved hvilken et legemiddel blir testet for sin effektivitet som et anticancermiddel . I denne forbindelse har forskjellige apoptotiske reaksjonsveier blitt studert inngående for mange forbindelser for å forstå deres virke cytotoksisitet [11]. Cellesykluskontrollpunkter som induseres av små molekyler er også blitt undersøkt [12], [13].
Levamisole er en immunomodulator i forskjellige kreftceller, inkludert kolorektal, bryst cancer, melanom, leukemi og [14]. Tidligere har det vist seg at det påvirker celleproliferasjon i forskjellige krefttyper [15] og modulerer fosforyleringen relevant for både cellesyklusprogresjon og apoptose. Studier har også vist at det kan anvendes for anti helminthic infeksjoner og forskjellige autoimmune sykdommer, [16], [17]. Dessuten har det vist seg at levamisol har anticancer-aktivitet i kombinasjon med fluorouracil (5-FU) som adjuvant terapi for tumor-node-metastase (TNM) trinn III (Dukes «C) colon-karsinom [18].
Den imidazo (2,1-b) tiazol-derivater av Levamisole er rapportert som potensielle antitumormidler, [19]. Senere, anti-tumoraktivitet av 5-formyl-6-arylimidazo- [2,1-b] -1,3,4-tiadiazol sulfonamider ble også rapportert [20]. Basert på disse lovende resultater, syntetiserte vi en serie av analoger inneholdende fluor i posisjon 4 av 6-fenyl imidazo [2,1-b] -1,3,4-tiadiazol og identifisert 4a som hovedforbindelsen [21]. Imidlertid er mekanismen ved hvilken den induserte cytotoksisitet var ikke kjent. Dessuten, det ble aldri testet på dyremodeller for sin effekt på tumorprogresjon. I den foreliggende undersøkelse, avdekker at 4a utøver sin effekt på tumorceller ved å aktivere den ytre vei av apoptose. Vi fant også at 4a hemmer utviklingen av svulst i mus effektivt og øker levetiden betraktelig.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Alle kjemikalier som brukes i dag studien var av analytisk kvalitet og kjøpt fra Sigma-Aldrich, USA. Antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, USA.
Syntese av 4a
Syntese og karakterisering av 2-benzyl-6- (4′-fluorfenyl) -5-tiocyanato-imidazo [2, 1-b] [1], [3], [4] tiadiazol, 4a har blitt beskrevet tidligere [21]. Levamisol (Tetramisol hydroklorid, kat. Nr L9756) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, USA.
Cell kultur
humane cellelinjer, CEM (T-celle leukemi), K562 (kronisk myelogen leukemi) REH (B-celle leukemi) og Nalm6 (B-celle leukemi), ble dyrket i RPMI1640 (Sera Lab, UK) inneholdende 10% FBS (Gibco BRL, USA), 100 U penicillin G /ml og 100 ug streptomycin /ml (Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. EAC (brystkreft) cellelinjen ble anskaffet fra National Center for Cell Science, Pune og dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS, som beskrevet ovenfor.
Trypan blått fargestoff utelukkelse assay
Effekten av 4a på levedyktighet av leukemi (CEM, K562, REH, Nalm6) og brystkreft (EAC) celler ble bestemt ved trypan blått fargestoff utelukkelse analyse [22]. Celler ble dyrket (0,75 x 10
5-celler /ml) i 24 timer, og forbindelsen ble tilsatt i området fra 1 til 100 uM for å bestemme den IC
50 verdi. DMSO-behandlede celler ble anvendt som bærerkontroll. Celler ble oppsamlet ved intervaller på 24 timer i fem dager, og antallet levedyktige celler ble bestemt etter trypan blå farging. For Levamisole, ble vann anvendt som bærerkontroll. I tilfelle av EAC, en adherent cellelinje, ble levedyktighet målt ved 48 og 72 timer etter behandling av 4a. Hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger, og feilstolper ble beregnet og plottet.
MTT-analysen
MTT-analysen ble utført som beskrevet tidligere [23]. CEM, K562, Reh eller Nalm6 celler (0,75 x 10
5 celler /ml) ble behandlet med 4a (for CEM og REH celler 1, 5, 10 og 20 um, for K562 1, 5, 10, 20, 40 og 100 uM, for Nalm6, 1,5,10, 20, 40 uM), inkubert i 48 og 72 timer og underkastet MTT-analyse. Celler behandlet med DMSO eller vann ble anvendt som bærerkontroller for 4a, henholdsvis. Forsøket ble gjentatt minst to uavhengige ganger slapp med dupliserte reaksjoner og feil barer angitt.
LDH utgivelsen analysen
LDH utslipp i media etter 4a behandling (1, 5, 10 og 20 um) på CEM-celler etter 48 og 72 timer etter behandling ble målt ved anvendelse av standardprotokollen [24]. Prosentandelen av LDH meldingen ble beregnet som:. LDH utgivelse i media /(LDH utgivelse i media + intracellulær LDH release) × 100%
Påvisning av intracellulær ROS produksjon av flowcytometri
Nivået av total intracellulær ROS produksjonen ble målt ved hjelp av celle gjennomtrengelig fluorescerende probe 2,7-dichlorodihydro fluorescein diacetat (H
2DCFDA) i CEM og Reh celler [25]. CEM-celler ble behandlet med 5 og 10 uM av 4a og REH-celler med 10 pM til 5, 10, 15, 30 og 60 min, høstet, vasket og den fluorescerende intensitet ble analysert ved flow-cytometri. Celler behandlet med H
2o
2 ble brukt som positiv kontroll for kompensasjon av eksperimentelle prøver.
Western blot analyse
Cell lysat ble utarbeidet etter behandling med 4a på CEM (0 , 0,5, 1 og 5 uM i 48 timer). Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [23]. I korthet ~40 ug protein Prøven ble elektroforisert på 8-12% SDS-PAGE, overført til PVDF-membran (Millipore, USA) og probet med respektive primære og sekundære biotinylerte antistoffer. De primære antistoffene som ble brukt var BCL2, BCL-XL, BAX, t-BID, p53, p-p53 [Ser 392], PUMA, AKT, Pakt [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, caspase -3, caspase-8 og cytokrom C. Flekkene ble utviklet ved hjelp av kjemiluminescerende reagenser (Immobilon ™ western, Millipore, India) og skannes av gel dokumentasjonssystem (LAS 3000, Fuji, Japan). Blottene ble strippet deretter i henhold til standard protokoll og re-undersøkt med anti-tubulin antistoff [23].
Separasjon av mitokondrie og cytosoliske fraksjoner fra 4a behandlet CEM-celler
CEM-celler ble behandlet med 5 iM 4a for 48 timer, høstes og brukes for isolering av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ved hjelp av mitokondrie utvinning kit (IMGENEX, USA, kat. nr 10082k) i henhold til produsentens instruksjoner. DMSO-behandlede celler ble anvendt som kontroll. De resulterende fraksjoner ble brukt til western blot analyse mot anti-cytokrom C. Actin ble brukt som lasting kontroll.
In vivo eksperimenter
Etikk erklæringen.
Mus ble opprettholdt som per prinsippene og retningslinjene i den etiske komiteen for dyr omsorg av Indian Institute of Science i henhold til indiske National Law på dyr omsorg og bruk. Den eksperimentelle design av studien ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee (Ref. CAF /Etikk /125/2007/560), Indian Institute of Science, Bangalore, India.
Dyr
sveitsiske albino mus, 6-8 uker gamle, som veier 18-22 g ble kjøpt fra sentrale dyre~~POS=TRUNC, Indian Institute of Science (IISc), Bangalore, India og vedlikeholdes i dyrehuset, Avdeling for biokjemi, IISc. Dyrene ble huset i polypropylen bur og gitt standard pelletdiett (Agro Corporation Pvt. Ltd., India) og vann ad libitum. Standarden pelletdiett sammensatt av 21% protein, 5% lipider, 4% fiber, 8% aske, 1% kalsium, 0,6% fosfor, 3,4% glukose, 2% vitamin, og 55% nitrogen-fri ekstrakt (karbohydrater). Musene ble holdt under kontrollerte betingelser for temperatur og fuktighet med en 12 timers lys /mørke syklus.
Utarbeidelse av Ehrlich ascites karsinom (EAC) celler.
EAC celler ble samlet inn fra bukhulen av tumor-bærende mus som donor av 20-22 g kroppsvekt og suspendert i steril fosfatbuffer-saltvann (PBS). Et fast antall levedyktige celler (1 x 10
6 celler /22 g b. Vekt) ble implantert i bukhulen til hver mottaker mus og lov til å formere seg. Tumorcellene ble tatt ut, fortynnet i saltvann, talt og re-injisert (1 x 10
6 celler /dyr) til høyre lår vev hos forsøksdyr for å utvikle fast tumor.
Evaluering av antitumoraktivitet av 4a i mus
for å studere og sammenligne den antitumor aktivitet av 4a, ble 32 sveitsiske albino mus brukt i denne studien, (to grupper av 16 dyr hver). Av 16 mus, fire ble brukt som ubehandlet (normal) kontroll. Resten av mus ble injisert med EAC å indusere fast tumor, og delt i tre grupper, som hver inneholder fire dyr for tumorkontroll (gruppe to), Levamisole behandlet (gruppe tre) og 4a-behandlet (gruppe fire). Gruppe to fikk vann som kjøretøykontroll, gruppe tre fikk peroral administrasjon av levamisol (20 mg /kg, f. Wt) og gruppe fire fikk peroral administrasjon av 4a (6 doser på 20 mg /kg) på hver alternativ dag ved hjelp av mage gavages starter fra 12
th dagen for injeksjon av tumorceller.
diametrene for utvikling av tumor ble målt i tilfellet med gruppen to, tre og fire dyr ved hjelp av vernier calipers en gang i fem dager. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen V = 0.5ab
2, der «a» og «b» indikerer større og mindre diameter, henholdsvis [26]. Ved slutten av 25
th og 45
th dag av forsøksperioden, ble ett dyr fra hver gruppe avlivet ved cervikal dislokasjon og vev fra normale (gruppe en), tumor (gruppe to), Levamisole behandlet (gruppe tre ) og 4a behandlet (gruppe fire) dyr ble samlet inn og lagret.
For å sjekke holdbarheten indusert av 4a i tumor mus, ble 24 dyr studert, to grupper som inneholder 12 hver. Av 12, seks tjente som tumorkontroll og andre ble behandlet med 4a som forklart tidligere. Den prosentvise økningen i levetid ble beregnet og sammenlignet med den for kontrolldyrene. Døds mønster for kontroller og 4a behandlede dyr ble registrert, og% økning i levetid ble beregnet ved anvendelse av formelen [(T-C) /C] x 100, hvor «T» angir antall dager 4a behandlede dyrene overlevde og «C «angir antall dager tumor dyr overlevde [26] -. [28]
Evaluering av toksisitet av 4a i normal mus
Swiss Albino mus ble behandlet med 4a og levamisol (6 doser, på hver annen dag) og bivirkninger ble evaluert ved to forskjellige tidspunkter (
th 20 og 50
th dag). Av 36 mus, 18 hver ble brukt på 20
th og 50
th dag. I begge tilfeller, 6 dyr tjente som kontroll, mens 6 ble behandlet med levamisol (20 mg /kg) eller 4a (20 mg /kg). Kroppsvekten til hvert dyr ble overvåket gjennom eksperimentet og gjennomsnittsvekten beregnet ved 20
th og 50
th dag for kontroll, 4a og Levamisole administreres mus og ble plottet med feilfelt. For å evaluere effekten av 4a og Levamisol på fysiologiske funksjoner, ble blod oppsamlet på 20
th og 50
th dag som tidligere beskrevet [29]. Serum ble separert og lever og nyre funksjonstester ble utført for hvert dyr, for å bestemme nivåer av alkalisk fosfatase (ALP), ble kreatinin, urinstoff og blodtelling utføres under anvendelse av plasma som tidligere beskrevet [29]. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Western blot analyse for 4a behandlet faste og flytende tumorceller
Solid svulst ble utviklet som beskrevet tidligere [29]. Etter 6 doser av 4a, ble tumor samlet og ekstrakt ble fremstilt ved anvendelse av RIPA-buffer metoden [23]. Væsken tumor ble utviklet ved å injisere EAC-celler (2 x 10
6 celler) fra donor mus til bukhulen til forsøksdyrene. Etter EAC injeksjon (5
th dag), ble dyrene behandlet med 4a (20 mg /kg; 4 doser hver alternative dager) og EAC-celler ble isolert fra bukhulen. De makro avstamning celler ble separert fra ikke-heft EAC celler ved forsiktig aspirasjon og vasket med 1 x PBS. Cellelevedyktigheten ble kontrollert ved bruk av trypan-blått eksklusjon-analyse og 92% cellene ble funnet å være i live i både eksperimentelle og kontrollerer grupper. EAC-celler ble lysert i RIPA-buffer, ble ekstraktet fremstilt som tidligere beskrevet [30] og benyttet for Western blot-analyse.
Histologisk evaluering
Tumor og levervev hos normale og eksperimentelle mus ble oppsamlet og behandlet i henhold til standardprotokoller. I korte trekk ble vev innstøpt i parafin, seksjonert ved 5-10 um i en roterende mikrotom (Leica Biosystems, Tyskland) og farget med hematoksylin og eosin [31], [32]. Hjernevev ble samlet inn, behandlet og farget med Luxol Fast Blå å studere demyelinisering. Hver del ble undersøkt ved lysmikroskopi og bilder ble tatt (Zeiss, Tyskland).
Immunhistokjemisk (IHC) analyse
antistoff-farging ble gjennomført på formalinfikserte, parafin innleiret vev, som ble seksjonert ved en tykkelse på 5 mikrometer. Slides ble de-paraffinized bruker xylen, rehydrert og behandlet med 3% H
2o
2 i PBS. Antigen gjenfinning ble utført ved bruk av 0,01% natrium-citrat-buffer etterfulgt av blokkering i PBST inneholdende 0,1% BSA og 10% FBS. Primær antistoff inkubasjon (Ki67, BID eller 53BP1) ble utført over natten ved 4 ° C. Platene ble vasket og inkubert med biotinylert sekundært antistoff (1 time). Slides ble deretter vasket, inkubert i streptavidin-HRP (1:1000). Platene ble igjen vasket (PBS inneholdende 0,1% Tween 20) og farge ble utviklet ved bruk av DAB + H
2o
2, motfarget med hematoksylin og montert i DPX (Sigma-Aldrich, USA). Bilder ble tatt med lysmikroskop (Zeiss, Tyskland). Endring i intensitet av antistoffarging følgende 4a behandling ble bestemt ved hjelp av ImageJ programvare [33].
Statistisk analyse
Verdier blir uttrykt som gjennomsnitt ± SEM for kontroll og eksperimentelle prøver og statistisk analyse ble utført ved hjelp av en enveis ANOVA fulgt av Dunnetfs test, og hver verdi ble sammenlignet med kontrollen og betydning er nevnt. For denne analyse ble GraphPad programvare prisme 5,1 anvendt. Verdiene ble betraktet som statistisk signifikant hvis p-verdien var lik eller mindre enn 0,05.
Resultatene
4a induserer cytotoksisitet i kreftceller
Tidligere mens screening en serie av levamisol derivater, identifiserte vi 4a som hovedforbindelsen (fig. 1A) [21]. I denne studien har vi brukt en rekke leukemiske cellelinjer (CEM, K562, Reh og Nalm6) og en mus brystkreft cellelinje, Ehrlich ascites karsinom (EAC) for å evaluere sitt potensial til å indusere cytotoksisitet. For det første, IC
50 av 4a på CEM, K562, Nalm6 og REH-celler ble bestemt ved bruk av trypanblått og MTT-analyser (fig. 1). Celler behandlet med DMSO ble anvendt som bærerkontroll. Resultatene viste at 4a behandling signifikant påvirket cellelevedyktighet ved lavere konsentrasjoner i CEM, Nalm6 og REH (Fig. 1 B, C). Interessant, K562-celler som viste minst følsomhet overfor 4a behandling (Fig. 1 B, C). Basert på begge trypanblått og MTT-analyser, IC
50 verdi ble beregnet til å være omtrent 5, 70, 10 og 8 uM i CEM, K562, Nalm6 og REH-celler, henholdsvis etter 48 timer med 4a behandling. Interessant, i sammenligning med 4a, Levamisole behandling på CEM-celler viste mindre følsomhet (Fig. 2A, B). 4a viste signifikant cytotoksisitet i EAC-celler (IC
50, 33 uM), mens celler som var ufølsom for Levamisole, på rekke konsentrasjoner testet (fig. 2C, D). Videre ble LDH-målingen ble utført for å analysere celleskade indusert ved 4a på CEM-celler. Celler ble behandlet med 4a i 48 og 72 timer, henholdsvis, høstet og utsatt for LDH måling. Resultatene viste en doseavhengig økning i frigjøring av LDH (fig. S1).
A. Strukturen av 4a. B. 4a induserte cytotoksisitet som bestemt ved trypan blå analyse. CEM, K562, Nalm6 og REH-celler ble dyrket (0,75 x 10
5-celler /ml) og cytotoksisitet ble målt etter tilsetning av økende konsentrasjon av 4a som angitt. Cellene ble tellet ved intervaller på 24 timer inntil cellene oppnådde stasjonær fase og ble plottet. DMSO-behandlede celler ble anvendt som bærerkontroll. Standardfeil ble beregnet på grunnlag av minst to uavhengige eksperimenter. C. Bestemmelse av celleproliferering ved hjelp av MTT-assay etter tilsetning av 4a-CEM, K562, Nalm6, og REH celler (48 og 72 t). Resultatene som vises er fra et minimum på to uavhengige eksperimenter, som hver ble utført i duplikater og resultatene er uttrykt som% av celleproliferasjon. I alle paneler «C» står for DMSO behandlet kjøretøy kontroll.
A. Strukturen av Levamisole, foreldre forbindelsen med 4a. B. Bestemmelse av celleproliferering ved hjelp av MTT-analysen på CEM-celler behandlet med levamisol eller 4a. Ved Levamisole, konsentrasjonene som ble anvendt var 1, 5, 10 og 20 uM, mens den var 10 pM for 4a. Standard feil ble beregnet basert på to uavhengige forsøk. C, D. Cytotoksisitet av 4a og Levamisol på EAC-celler som målt ved trypan-blå-analyse. EAC-celler ble dyrket (0,75 x 10
5-celler /ml) og behandlet med 1, 5, 10, 20 og 40 uM av 4a eller levamisol. Levedyktighet av cellene ble bestemt ved trypanblått-analysen ved 48 og 72 timer. Standard feil ble beregnet basert på tre uavhengige eksperimenter.
4a induserer intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS)
Overproduksjon av ROS etter tilsetning av en forbindelse er en indikator på cellulær respons som fører til DNA-skader og apoptose. Vi har funnet at behandling 4a indusert ROS-produksjon i tilfelle av CEM (5 og 10 uM), så vel som REH (10 pM) celler ved 10 og 15 minutter (Fig. 3 A, B, fig. S2). Videre, har økningen i inkubasjonstiden ikke øke ROS-nivå. Celler behandlet med H
2o
2 ble anvendt som en positiv kontroll, mens DMSO-behandlede celler tjente som bærerkontroll (fig. 3). Således våre resultater tyder på at ROS-produksjon er et mellomliggende trinn som er involvert i 4a indusert cytotoksisitet.
A, B. CEM (A) og REH (B) celler behandlet med 4a (5 uM og 10 uM, henholdsvis) for forskjellige tidspunkter ble anvendt for testing av dannelsen av intracellulære ROS ved strømningscytometri-analyse. Konsentrasjonen valgt for studien var basert på deres respektive IC
50 verdier. H
2o
2 behandlede celler ble brukt som positiv kontroll mens celler alene ble brukt som negativ kontroll. DMSO-behandlede celler ble anvendt som bærerkontroll. Cellepopulasjon som viser ROS ble vist sammen med standard feil gjennomsnitt (n = 2).
4a modulerer uttrykk for apoptotiske proteiner
For å studere mekanismen som 4a induserer celledød vi studerte uttrykket nivåer av ulike apoptotiske proteiner følgende 4a behandling. CEM-celler ble valgt ut for undersøkelsen som det viste maksimal følsomhet til 4a. CEM-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av 4a (0,5, 1 og 5 uM i 48 timer), cellelysat ble fremstilt og anvendt for Western blot studiene. Resultatene viste at 4a behandling førte til en bemerkelsesverdig økning i nivåene av p53 samt fosfo-p53 (fig. 4A). Siden p53 er en kjent aktivator av apoptose, testet vi ekspresjonen av forskjellige BCL2 familie proteiner som har pro /antiapoptotic funksjoner (fig. 4A, B). I samsvar med våre ovennevnte resultatene, observerte vi en økning i uttrykket av proapoptotiske proteiner PUMA, BAX, og spalting av BID (Fig. 4A, B). Interessant, har vi også observert oppregulering av antiapoptotic proteiner, BCL2 og BCL-XL, spesielt 0.5 og 1 mikrometer konsentrasjoner (Fig. 4B). Videre, 4a behandling førte til økningen i ekspresjon av død-reseptorsignalisering proteiner, FAS, FAS-L og FADD, noe som indikerer at cytotoksisiteten indusert av 4a kan være mediert gjennom døden reseptor-mediert apoptose (Fig. 4C).
CEM cellelysat ble fremstilt følgende behandling med 4a (0, 0,5, 1 og 5 uM i 48 timer). DMSO-behandlede celler ble anvendt som kontroll (0 uM). Western blotting studiene ble utført med bestemte primære og sekundære antistoffer for uttrykk for (A) Phospho p53, p53, PUMA, fosfor AKT, AKT (B) BCL2, BCL-XL, BAX og t-BID; (C) FAS, FAS-L, FADD, og SMAC /DIABLO (D) caspase-3, caspase-8 og cytokrom C. α-tubulin ble brukt som lasting kontroll. Kvantifisering av bandene i hver blot vist i panelet til venstre er vist som søylediagram med standard feil basert på to uavhengige eksperimenter følgende normalisering med respektive tubulin E. versjonen av cytokrom C fra mitokondrier etter behandling med 4a. Mitokondriell samt cytosoliske fraksjoner ble separert fra CEM-celler etter 48 timers behandling med 4a (5 pM), ble DMSO-behandlede celler anvendt som kontroll (C), western blotting ble utført ved anvendelse av anti-cytokrom C. Aktin ble anvendt som kontroll lasting .
PI3K /AKT veien er kjent for å bli aktivert i et flertall av T-ALL. Det er også kjent at det spiller en kritisk rolle i å kontrollere overlevelse og apoptose. Økning i p-AKT skifter cellene mot overlevelse ved å forstyrre p53 mediert vei av apoptose. Derfor var vi interessert i å sjekke nivåene av AKT etter behandling med forbindelsen. Resultatene viste oppregulering av AKT etter tilsetning av 4a (fig. 4A). Til tross for økningen i nivåene av p-AKT, medikamentinduserte celledød, noe som tyder på at forholdet mellom proapoptotiske og antiapoptotic signaler i cellen ble avbrutt.
SMAC /DIABLO er et pattedyr-mitokondrie protein som fungerer som en regulerende komponent under apoptose. Vi testet dets ekspresjon ved 4a behandling og resultatene viste en oppregulering av proteinet uttrykket (fig. 4C). En doseavhengig økning i nivået av cytokrom C, ble det også observert (fig. 4D) [34]. Vi har også undersøkt for frigjøring av cytokrom C til cytoplasma og resultatene viste en tydelig økning i nivået av det cytosoliske cytokrom C ved behandling med 4a (fig. 4E).
caspase-8 er et annet protein som er aktivert i løpet av ytre vei av apoptose. Resultatene viste spaltning av caspase-8 ved 4a behandling (fig. 4D). Dette bekrefter ytterligere aktivering av død-reseptor-mediert apoptose. Aktivert kaspase-8 også spalter PROCASPASE-3, og i overensstemmelse med dette finner vi aktivering av PROCASPASE-3 sammenlignet med kontrollene, etter 4a behandling, på en doseavhengig måte (fig. 4D).
4a behandling inhiberer tumorprogresjon hos mus
EAC avledet fra bryst adenokarsinom er en aggressiv og raskt voksende carcinoma ofte brukt for evaluering av effekten av nye små molekyler på tumorprogresjon. På grunnlag av pilotforsøk, ble 20 mg /kg kroppsvekt av 4a anvendes for behandling i dyr som bærer tumorer (data ikke vist). Etter 12
th dag av EAC injeksjon (liten størrelse svulsten var synlig), ble dyrene behandlet med seks doser hver annen dag. Vi har funnet at behandling med 4a på dyr som bærer tumor resulterte i signifikant reduksjon av tumorstørrelse sammenlignet med ubehandlede, så vel som levamisol behandlede tumor dyr (20 mg /kg) (Fig. 5A). Vi fant at 80% av musene overlevde ved behandling med 4a, mens 50% av de ubehandlede tumor musene var døde mellom 30 til 40 dager etter tumorutvikling (Fig. 5A, B og data ikke vist). Brutto utseendet av låret vev inneholdende tumor, lever og milt av negativ kontroll, ubehandlede tumorkontroll og 4a-behandlede mus viste en proporsjonal morfologisk forskjell (Fig. 5C og data ikke vist).
fast tumor ble indusert i sveitsiske albino mus ved å injisere EAC celler. Seks doser av 4a og Levamisole (20 mg /kg) hver administrert til tumorbærende mus på hver annen dag fra 12
th dag av EAC celleinjeksjon. A. Effekt av 4a og levamisol på tumorprogresjon ved ulike tidspunkt. Data som vises er basert på to uavhengige grupper av eksperimenter som inneholder fire dyr hver. Feilfelt indikerer SD fra uavhengige forsøk. B. Kaplan-Meier-overlevelseskurver for mus behandlet med 4a. Ut av 24 tumorindusert sveitsiske Albinodyr, 12 ble behandlet med 4a (20 mg /kg) og overlevelse graf ble plottet, viste Log-rank statistisk test P 0,005 (**). I kontroll tilfelle ble median overlevelsestid funnet å være 59 dager, og i tilfelle av 4a behandlede det er udefinert (verdi viste seg til 250 dager). C. Brutto utseende 4a behandlede og ubehandlede tumor mus og deres utvalgte organer ved 25
th dag av behandlingen. en. mus uten tumor, f. mus peiling svulst, c. tumorbærende mus etter behandling med 4a, d. lår vev fra normale mus, f.eks. tumor, f. lår vev av en behandlet mus, g. leveren fra normal mus, h. lever av en svulst mus, i. leveren fra en 4a behandlet mus, j. milt av en normal mus, k. milt av en mus med svulst, l. milt fra en behandlet mus.
Enda viktigere, har vi funnet at ved behandling med 4a, dyr med tumor viste en signifikant forskjell i overlevelse sammenlignet med ubehandlede tumorkontroll (fig. 5B). Mens kontrolldyrene overlevde i bare maksimalt 70 dager etter tumorutvikling, flertallet av mus behandlet med 4a overlevde i mer enn 250 dager, indikerer en ~4-ganger økning i levetid (fig. 5B). Derfor våre resultater viser at 4a behandling betydelig redusert svulsten belastning og økt levetid av dyrene.
Histologisk Evalueringen ble også utført ved to forskjellige tidspunkter (25
th og 45
th dag ) for behandling. Seksjoner fra tumorvev av en 25 dagers behandling mus viste mange hematoksylin fargede kjerner med liten cytoplasmatisk farge som indikerer aktiv celleproliferasjon, mens i tilfellet med kontroller, ingen andre enn kjernen av skjelettmuskler celler ble farget (fig. S3A). 4a behandlede tumorvev viste en signifikant reduksjon i prolifererende celler (Fig. S3A). Vevssnitt fra lår etter 45
th dag av behandlingen viste ubetydelig antall prolifererende celler, og var mer sammenlignbar med normale vev, mens prolifererende celler var rikelig i mus med tumor, hvor ingen behandling ble gitt (fig. S3A). For å analysere hvorvidt 4a behandling hadde noen ugunstig virkning på andre vev, ble deler av leveren analysert ved hematoksylin og eosin-farging (fig. S3C, D). Våre resultater viste hypertrofi av hepatocytter i både tumorbærende og 4a behandlet mus. Imidlertid ble det gjenopprettet til det normale bare i tilfeller hvor tumoren tilbakedannede etter behandling med forbindelse 4a, i motsetning til de ubehandlede musene hvor uregelmessig hepatocytter ble fortsatt sees (fig. S3C, D).
