Abstract
Universal fenotyping teknikker som kan diskriminere mellom ulike tilstander av biologiske systemer har stort potensial. Vi søkte 557 fluorescerende bibliotek forbindelser til NCI sin 60 humane kreftcellelinjer (NCI-60) for å generere en systematisk fluorescens fenotypisk profilering data. Av den kinetiske fluorescensintensitet analyse, vi lykkes diskriminert opprinnelsen organ av alle 60 cellelinjer
relasjon:. Lee J-S, Kim YK, Kim HJ, Hajar S, Tan YL, Kang N-Y, et al. (2012) Identifisering av Cancer Cell Line Origins med fluorescens bildebasert Phenomic Screening. PLoS ONE 7 (2): e32096. doi: 10,1371 /journal.pone.0032096
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 5 oktober 2011; Akseptert: 19. januar 2012; Publisert: 23 februar 2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en egenutført midler fra Direktoratet for Science, Technology and Research (A * STAR), Singapore Biomedical Research Council og A * STAR SSCC Grant (SSCC10 /024). Dette arbeidet ble også støttet av konvergerende Research Center Program gjennom departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010K001410). JSL er en mottaker av T. J. Park Science Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en hovedutfordring for funksjonell genomforskning er å identifisere genotyper som er knyttet til en bestemt fenotype. Nylige fremskritt i genuttrykk profilering og neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi har kjørt betydelige forbedringer i high-throughput genotyping. [1], [2] Men i motsetning til de godt etablerte genotyping plattformer, er det ingen standard kvantitative metoder for fenotyping ennå. [3] fenotyper kan defineres på mange ulike nivåer; f.eks, biokjemiske eller fysiologiske egenskaper som kan måles på et cellulært nivå, eller oppførsel eller klinisk historie hos en organisme nivå. [4] Hver fenotype målingen har blitt brukt for videre studier på et sak-til-sak basis. For eksempel, atferd og hjerneavbildning mønster har ofte blitt brukt til Phenomic karakter i nevrovitenskap, [5] – [8] og CD (klynge av betegnelse) -marker basert biokjemiske fenotyper er mye brukt til å diskriminere mellom celletyper i ulike felt. [9], [10] Det er imidlertid ennå ikke universell Phenomic parameter som kan brukes til forskjellige screening formater. [11]
Vi så for seg at en fluorescerende probe bibliotek ville ha stort potensial for å identifisere et sett av universelle Phenomic parametre grunnet deres uniform fenotypiske avlesning (fluorescens signal), enkle dose kontroller, høy følsomhet for mikro-miljøer, og strukturelle diversitet på molekylært nivå. Vår gruppe har nylig utviklet fluorescerende biblioteker og rapportert en rekke bilde sonder i glukagon sekresjon celler, [12] differensierte myotube celler, [13] og pluripotente stamceller. [14] Selv i tilfelle de intracellulære mål ikke er klart definert, den fenotypiske signaturen kan brukes for en rekke anvendelser. [15] Enda viktigere, avhengig av egenskapene til den fluorescerende probe, høyt innhold informasjonen kan hentes ut fra en enkelt fluorescens bilde. [16], [17] Følgelig fluorescerende fenotype profilering bruke syntetiske prober kunne avsløre subtile forskjeller i biokjemiske egenskaper. I denne artikkelen rapporterer vi først fluorescens intensitet-basert mobil Phenomic profilering studie ved hjelp av et mangfold orientert fluorescens bibliotek (DOFL) og NCI-60 kreftcellelinjer.
For å demonstrere Phenomic omfanget av fluorescens bildebasert screening metode, ble 60 mennesker kreftcellelinjer (NCI-60) av Developmental Therapeutics Program National Cancer Institute utvalgte. Disse cellene ble valgt på grunnlag av følgende to grunner. (I) det er den største standard samling av brede kreftcelletyper. NCI-60 settet inneholder kreft 9 forskjellig opprinnelse, inkludert leukemi, melanom, nyre, bryst, tykktarm, lunge, sentralnervesystemet, prostata, og ovariekarsinomer. (Ii) rik biokjemisk bakgrunnsinformasjon om samlingen er tilgjengelig for allmennheten. Det karakteristiske ved NCI-60 set er profilert på den genomiske, [18], [19] proteomikk, [20] og legemiddeleffektnivå, [21] – [23], og disse data kan enkelt anvendes for å fremme «omics «studier. Mens ulike profilerings tilnærminger har blitt mye utforsket å karakterisere NCI-60 cellelinjer, har en systematisk fluorescerende probe-baserte profilering ikke blitt fulgt opp ennå.
Diskusjon
fluorescerende prober og fluorescens
Resultater og fenotyping
kombinasjon av rosamine (RS) og BODIPY (BD) fluoroforen biblioteker (240 rosamine [24] og 317 BODIPY [12] forbindelser, 557 forbindelsene i totalt) ble brukt til å generere fluorescens fenotyping data. Som tidligere rapportert, disse forbindelsene viste god celle permeabilitet, og bred absorbans (λ
abs = 480~616 nm) og fluorescens utslipp (λ
em = 530~656 nm) varierer med en bred strukturell mangfold. For å maksimere informasjonen fra cellebaserte analyser, benyttet vi en hel celle fluorescens bildebaserte screening plattform, som ville gi integrerte cellulære egenskaper, såkalte høy-innhold screening. Den store profilering ble utført ved hjelp av en automatisert fluorescens mikroskop system (ImageXpress Micro, Molecular Devices, Inc.). NCI-60-celler ble sådd ut i tynne bunn 384-brønners plater ved 70% konfluens, og 557 fluoriserende forbindelser ble tilsatt til forskjellige brønner ved to sluttkonsentrasjoner på 250 nM og 500 nM. Fluorescens bilder ble oppnådd både i FITC og TRITC kanaler for å dekke bredt område av spektrene til probene. Fluorescerende bilder ble tatt fra to uavhengige områder av hver brønn i 3 tidspunkter (1 time, 24 timer og 48 timer), og alle forsøk ble duplisert. Til sammen ble 1,604,160 bilder (557 prober × 60 kreftceller × 2 konsentrasjoner × 2 kanaler × 2 sites × 3 tidspunkter × 2 duplikater) samlet. En representativ fluorescens bildedata av BD-46 er presentert i figur 1, og detaljene i platekonstruksjonen er beskrevet i figur S1. Fra disse fluorescens bilder, kunne mange forskjellige typer funksjoner, for eksempel morfologi, tekstur, eller intensitet trekkes ut og brukes som en fenotypisk signatur. [25] Spesielt de fargeintensitet og mønster av lokaliseringer variert i enkelte cellelinjer, selv om alle cellene ble farget med en identisk mengde BD-46.
Kvantitativ fluorescens intensitet profilering av NCI -60 cellelinjer
Blant forskjellige mulige parametre, fokuserte vi på fluorescensintensiteten av cellene, siden bildeprosesseringsmetode var enkel, og den behandlede data var mindre avhengig av analysealgoritmen enn andre. For ytterligere å undertrykke artefakt fra batch-til-batch variasjoner (dette er spesielt viktig i denne studien på grunn av lang datainnsamling tid enn 2 år), bestemte vi oss for å bruke fluorescens intensitet ganger endring over tid (intensitet kinetisk profil), i stedet for den absolutte verdien av intensiteten. For det første, målte vi middelverdiene av fluorescensintensiteten av cellene, og den intensitetsmønsteret for forskjellige cellelinjer ble analysert ved hjelp av sin intensitet kinetiske profil (endring av intensitetsverdiene på 48 timer i løpet av 1 t; databehandlings protokollene beskrevet i de eksperimentelle metoder). Deretter, analyserte vi den totale fluorescens-intensiteten mønster forandring av NCI-60 sett av cellelinjer ved heatmap analyse og hierarkisk clustering (fig. 2). Generelt, lunge, kolon, og eggstokkreft celler ble godt klassifisert av enkel gruppering. På den annen side, fra et perspektiv av kjemisk struktur, fluorescerende forbindelser som deler samme klasser av xanton-derivat struktur (for eksempel RS-A, RS-E, og RS-K-serien) oppviste lignende reaksjonsmønsteret i de cellelinjer for samme kreft opprinnelse (fig. S2).
fluorescens intensitet fold endringer ble gruppert for 557 fluorescerende prober (x-aksen) over 60 kreftcellelinjer (y-akse). Fold = (fluorescens-intensitet ved 48 timers inkubering) /(fluorescens-intensitet ved 1 timers inkubering).
er interessant at en bemerkelsesverdig signatur ble observert for RS-K-serien av forbindelser. Disse forbindelser viste i utgangspunktet lav fluorescensintensitet, men etter 24 timer ble deres fluorescens dramatisk økt bare i bestemt sett med cellelinjer (HCT-116, HT29, COLO205, HCC-2998, EKVX, HOP-62, NCI-H460, NCI -H322M, og NCI-H23). Videre fluorescens responsprofiler var sterkt korrelert med proben struktur og kreftcelletype (fig. S2). For eksempel, en serie med RS-K forbindelser (K1, K3, K4, K14, K15, 16 m, og K17) viste fluorescens turn-on effekter i lunge og tykktarm kreft celler (fig. S3), og RS-E forbindelser ( E1, E3, E7 og E29) viste slå på reaksjoner i lungekreftceller (fig. S4). Selv om den fluorescerende reaksjon av RS-K og RS-E-serien økes for de bestemte kreftceller, som hver forbindelsene viste subtil men tydelig signatur. Spesielt RS-K serien forbindelser viste slå virkninger overfor brede områder av lungekreft celle, men de skiller seg handlingsmønster avhengig av 9-fenylringen strukturen rosamine (Fig. S3). Det er også verdt å legge merke til å peke på noen av disse sondene skille spesifikke cellelinjer fra identisk kreft opprinnelse. RS-E1, RS-E3 og RS-E7 forbindelser selektivt slått på bare i ACHN celler blant nyrekreftceller (Fig. S5). Videre må de oppviste spesifikk respons til SW60-celler, men ikke for resten av 6 tykktarmskreftceller.
En annen cellelinje spesifikk profil ble observert med RS-C3 forbindelsen. RS-C3 induserte en sterk fluorescens opphissende virkning bare i KM12-celler, en human koloncancercellelinje, blant 60 cellelinjer (Fig. 3). Sammenlignet med gjennomsnitts fluorescerende intensiteter i andre NCI-60-celler, RS-C3 viste en eksepsjonell 5,64 ganger høyere intensitet i KM12-celler. For å utforske den funksjonelle karakteristiske for KM122 cellene som induserer selektivt fluorescens fenotype, analyserte vi mRNA-ekspresjon data av NCI-60-cellelinjer. Basert på mRNA uttrykk data av GSE5846, forskjellig uttrykt gener (degs) som oppregulert i KM12-celler (Log
2 (brett) 1,5) ble valgt, og deres genet merknaden informasjon ble analysert. KEGG sti og genet ontologi analyser identifisert fem trasé som viser signifikant forskjell (
P
verdi 0,001) mellom KM12 celler og alle de andre NCI60 celler, for eksempel cellekommunikasjon, blodkreft celle avstamning, urea syklus og metabolisme av aminogrupper og p53 signalveien (tabell S3, S4). Med disse kombinasjonene av degs uttrykk, er det mulig å diskriminere KM12-celler med andre NCI60 cellelinjer, og oppregulert Profilen til disse genene er unike funksjonelle signatur av KM12-celler. Siden fluorescensen fenotype av RS-C3 viser kollektiv informasjon om slike degs profil innenfor et enkelt fluorescens bilde som intensitetsendringer, denne proben har potensial for avføling lignende funksjonell signatur fra andre cellelinjer. Mens det ikke var klart i øyeblikket hva slags endogen biomolecule er direkte samspill med denne proben, kan det brukes til å visuelt identifisere en tykktarmskreft cellelinje (KM12) blant 60 kreftcellelinjer etter 24 timer før ruge.
(a) søylediagram av kinetisk ganger endring (b) fluorescens bilder av 60 kreftcellelinjer.
Diskriminering av kreft celle opprinnelse
for kvantitativ mønster analyse, intensiteten kinetiske profiler ble videre undersøkt ved hjelp av lineær diskriminant analyse (LDA) for å klassifisere kreftcelletyper. LDA er en vanlig klassifisering metode spesielt for høye dimensjonale data for reduksjon av dimensionality. Ved å anvende LDA til kinetiske profiler, var det mulig å evaluere ganger endring responsene til hvert kjemikalie sonde for å oppnå optimal kreftcelle identifikasjon, og generere resultatet funksjon for å forutsi identiteten av celler og med hver probe ikke viser spesifikk respons til én cellelinje. Minste fluorescerende probe sett som kunne diskriminere 9 kreftcelletyper ble valgt av en fremtids trinnvis variabel utvalg algoritme, og 37 forskjellig svarer fluorescerende prober ble valgt (Fig. S6). Overraskende, alle 60 kreftceller ble med hell gruppert på en LDA resultatet plottet (fig. 4), og 98% var fullstendig tilordnet hvert av de opprinnelige grupper ved hjelp av
jackknifed
kryssvalidering (tabell S1). LDA score er vilkårlige andelsverdier som representerer maksimal identitet prediksjon, og vårt resultat viste de første og nest høyeste LDA score var nok til å diskriminere 60 cellelinjer i form av kreft opprinnelse (tabell S2). Det er verdt å merke seg at klassifiseringen ved hjelp av en kombinasjon av både BD og RS prober ble mye mer vellykket som bestemmes av kryssvalidering enn hvilken som helst kombinasjon av enten RS eller BD sonder alene (tabell 1). Dette resultatet innebærer at den kjemiske mangfoldet av fluorescerende prober som brukes til å generere den intensitetsprofilen signifikant påvirket resultatene av krefttype klassifisering. Et annet interessant aspekt av utvalgte 37 prober satt er at ingen av disse probene er selektive til encellete eller krefttyper. De viste spesielle svarmønstre for flere cellelinjer, og målcellen var ikke alltid begrenset innenfor identiske krefttyper. Vi mener slike selektive responser som stammer fra bestemte biokjemiske signatur eller integrert intakte miljøer i mål celletyper.
x- og y-aksen representerer den høyeste og 2
nd høyeste LDA score på cellen scoring funksjon (tabell S2). De 60 kreftcellelinjer ble merket i henhold til opprinnelsen av kreft type; CNS: rød, tykktarm: lilla, leukemi: oransje, lunge: grønn, melanom: rosa, bryst: mørk grønn, prostata: blek rosa, eggstokkene: grå, og renal. Oliven
Konklusjon
kort sagt, rapporterer vi først fluorescens intensitet-basert fenotype profilering av 60 humane kreftcellelinjer (NCI-60) ved hjelp av syntetiske fluorescerende prober. Struktur mangfold av fluorescerende prober synes å være en kritisk faktor for generering av distinkte fenotyper, og resultatene viste at 60 cancercellelinjer er alle med hell diskriminert i form av 9 kreftcelle opprinnelse. Den mest vekt på kreftforskning har vært fokusert på patogenesen og metastasering, og metastase forskning har blitt stagnert på grunn av mangel på pålitelig sporing teknikk som kan visualisere en bestemt opprinnelse av kreftceller. Fluorescens forbindelser som sonde spesifikk opprinnelsen til kreftcellen ikke bare kunne tilveiebringe et nytt vindu for metastasering forskning, men også benyttes for kreftdiagnose og progresjon overvåking. Selv om denne studien har begrensninger i at vi utførte identifisering av kreftceller opprinnelse kun ved hjelp av
in vitro
kreftcellelinjer, våre resultater ga en anelse om at kombinasjoner av fluorescerende prober kan skille komplekse og subtile forskjeller i kreftceller. Basert på reaksjonsmønsteret, ble det bedre identifikasjon resultat oppnås når flere fluoroforen stillasene ble anvendt, og fluorescensintensiteten profiler ble sterkt korrelert med den kjemiske strukturen til de fluorescerende prober og krefttyper. Disse funnene demonstrerer den praktiske nytten av mangfold orienterte fluorescens bibliotek tilnærming i universell celle fenotyping.
Metoder
Diversity-orientert fluorescens bibliotek forberedelse
rosamine og BODIPY bibliotek forbindelser ble fremstilt i henhold til tidligere rapporterte protokoller, og det sammensatte strukturer og karakteriseringsdata er blitt rapportert. [12], [24], [26] Alle forbindelser ble lagret ved -20 ° C i microtilter platene i fast form, og stamløsninger ble fremstilt ved å oppløse forbindelsene i DMSO før screening.
NCI- 60 kreftcellekultur
NCI-60 cellelinjer ble hentet fra National Cancer Institute. Alle NCI-60 cellelinjer ble dyrket som beskrevet i distributørens manualen. I korthet ble cellene dyrket i et høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 1% antibiotika.
Kvantitativ analyse fluorescensintensitet
Midlere verdier av fluorescensstyrkene var beregnes ved hjelp av Matlab 7.9.0 (R2009b). I vårt datasett, 4 bilder representerte hver eksperimentell betingelse (2 duplisere × 2 bilder /brønn). Vi har kombinert de 4 bildene ved hjelp av
cat
funksjon i Matlab for å optimalisere IO behandling. For å minimalisere bakgrunnseffekten, ble bare fluorescensintensiteten verdiene for området som var positive for Otsu terskel brukes til å beregne gjennomsnittsverdien.
graythresh Hotell og
im2bw
funksjoner i Matlab bildebehandling modulen ble brukt til å beregne Otsu terskel og utvalget celleområdet. Alle kvantitative bildebehandling batch jobber ble beregnet ved hjelp av en 16-node PC klyngen i 3 dager.
diskriminant analyse
Lineær diskriminant analyse (LDA) ble utført ved hjelp av brette endre verdier av fluorescensstyrkene mellom 48 time og 1 time ruge poeng. Probe utvalget ble behandlet av fremtids trinnvis variabel utvalg algorithum i SYSTAT (versjon 13).
NCI-60 genekspresjon og sti analyse
mRNA uttrykk mønstre for NCI-60 sett med celle linjer ble lastet ned fra databasen NCBI genuttrykk studenter (GEO). De GSE5846 data ble analysert ved hjelp GenePlex v3.0 ° funn og Pathway analysemoduler (ISTECH, Inc.).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Skjemaer av NCI-60 analyse format. Vi brukte 384 brønners plate for høy gjennomstrømming fluorescerende bildebehandling. 60-celler ble delt opp i 13 undergrupper (hvert sett inneholder mindre enn 5 cellelinjer), og 2 fluorescerende prober er testet med hver av undermengdene i en enkelt brønn plate. Siden kulturmedier fordampe fort i kant brønner, første og siste to kolonner ble ikke brukt for analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
SAR av fluorescerende prober i fenotype profil. Hierarkisk klynge av fluorescerende respons fenotype avslører strukturelle forhold av fluorescerende probe. Fluorescent intensitet endrer mønsteret av 557 fluorescerende prober (x-aksen) mot 60 kreftceller (y-akse) ble gruppert. Brett = (fluorescerende intensitet etter 48 timers inkubering) /(fluorescerende intensitet etter en h inkubasjon)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
fluorescens intensitet profilen til RS-K-serien. (A) Fluorescens respons profilen til RS-K15 i NCI60 celler og fluorescens bilder av lungekreftcellelinjer. Første og andre rad bildene ble tatt etter 1 time og 24 timer etter probe behandling hhv. Alle 4 bilder for hver eksperimentell tilstand vises. (B) fluorescensintensiteten søylediagram mønster av RS-K-serien mot 60 kreftcellelinje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
fluorescens intensitet profilen til RS-E-serien.
doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Cell linje spesifikk respons av RS-E-serien forbindelser mellom nedsatt og tykktarmskreft opprinnelse. Fluorescens intensitet søylediagram av RS-E1, RS-E3, og RS-E7 forbindelser for kreftceller fra (a) kolon og (b) nedsatt opprinnelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s005
(TIF)
Figur S6.
Strukturer av 37 utvalgte fluorescens prober fra LDA. Prober ble choosed basert på trinnvis frem automatisk variabel utvalg algoritme med alfa-å-gå inn: 0.150 og alpha-to-remove. 0.150 kriterier bruker SYSTAT v13
doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s006
(TIF)
Tabell S1.
Jackknifed kryssvalidering
matrise for tre sett med fluorescerende prober.
doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s007 plakater (XLS)
Tabell S2.
LDA poengsum funksjon og koeffisient av utvalgte fluorescerende prober.
doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s008 plakater (XLS)
tabell S3.
Valgte KEGG trasé basert på degs av KM12.
P
-verdier ble beregnet ved å
Fishers eksakte test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s009 plakater (XLS)
Tabell S4.
Topp 20 biologiske prosesser fra genet ontologi annotering av degs i KM12 celle
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s010 plakater (XLS)
Takk
Vi vil gjerne takke Korea Institute of Science and Technology for kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av PC klynge.
