Abstract
Bakgrunn
Selv om de siste fremskritt i sirkulerende DNA-analyse tillate prediksjon av tumor genomer av ikke-invasiv måte, noen utfordringer gjenstår, noe som begrenser den utbredte innføringen av cfDNA i kreftdiagnostikk. Vi analyserte status for de to beste karakterisert tykktarmskreft (CRC) genetiske og epigenetiske forandringer i en kohort av CRC pasienter, og deretter sammenlignet i hvilken grad de to mønstrene flytte fra vev til plasma for å forbedre vår forståelse av biologi modulere samsvar mellom vev og plasma metylering og mutasjons profiler.
Metoder
Plasma og tumorvev ble samlet inn fra 85 pasienter (69 ± 14 år, 56 menn).
KRAS Hotell og
SEPT9
status ble vurdert av allel ildfast mutasjon system kvantitativ PCR og kvantitativ metylering spesifikk PCR, henholdsvis. Seks av de vanligste punktmutasjoner ved kodon 12 og 13 ble undersøkt for
KRAS
analyse.
Resultater
KRAS
mutasjoner og
SEPT9
promoter metylering var til stede i 34% (29/85) og i 82% (70/85) av primær tumor vevsprøver. Både genetiske og epigenetiske analyser av cfDNA avdekket en høy total samstemmighet og spesifisitet sammenlignet med tumorvevet analyser. Pasienter med både genetiske og epigenetiske forandringer i vevsprøver (31,8%, 27/85) ble vurdert for videre analyser. Median metylering priser i tumorvev og plasmaprøver var 64,5% (12,2 til 99,8%) og 14,5% (0 til 45,5%), henholdsvis. Median
KRAS
mutasjon belastning (for matchet mutasjoner) var 33,6% (1,8 til 86,3%) i vev og 2,9% (0 til 17,3) i plasmaprøver. Plasma /vev (p /t) forhold på
SEPT9
metylering var betraktelig høyere enn p /t forhold på
KRAS
mutasjon belastning, spesielt i tidlig stadium kreft (p = 0,0108) .
Konklusjon
resultatene fra denne studien viser en avvikende hastighet på epigenetiske vs. genetiske endringer flytter fra vev til plasma. Mange faktorer kan påvirke mutasjon cfDNA analyse, inkludert både tilstedeværelse av tumor klonal heterogenitet og streng compartmentalization av
KRAS
mutasjon profil. Denne studien fremhever viktigheten av å vurdere innholdet i endring når analysere tumor-avledet cfDNA
Citation. Danese E, Minicozzi AM, Benati M, Montagnana M, Paviati E, Salvagno GL, et al. (2015) Sammenligning av genetiske og epigenetiske Endringer i primærsvulster og matchet plasmaprøver hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10,1371 /journal.pone.0126417
Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
mottatt: 11 februar 2015; Godkjent: 01.04.2015; Publisert: 06.05.2015
Copyright: © 2015 Danese et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bevis for at tumorspesifikke genetiske og epigenetiske forandringer kan påvises i sirkulerende DNA ekstrahert fra plasma fra cancerpasienter har vist lovende for å forbedre tidlig diagnostisering, prognostisering og sykdom overvåking. Det overordnede målet om å utnytte celle gratis DNA som en biomarkør innebærer medisinsk praksis optimalisering, personlig medisin utvikling og livskvalitet forbedring på grunn av minimal invasivitet av blod testing. Men godkjenning av selve klinisk validitet av ulike cellefritt DNA (cfDNA) endringer som mulige kreft biomarkører i klinisk praksis er fortsatt utfordrende [1]. Den ledende problemet er i dag representert ved det faktum at sirkulerende DNA-fragmenter som bærer tumor-spesifikke forandringer representere en variabel og generelt liten brøkdel av den totale sirkulerende DNA, og dermed generere en høy variabilitet i samstemmighet mellom endringsmønster påvises i vev av primære tumorer og tilsvar plasma.
de faktorer som påvirker den kvantitative så vel som de kvalitative endringer i cfDNA med hensyn til vev av kreftpasienter er mange og ennå ikke fullt utforsket så langt. Men innsats under det siste tiåret har ført til viktige fremskritt.
Ved å evaluere metylering mønster av
PCDH10
genet i vev og plasma hos pasienter med tykktarmskreft (CRC) har vi nylig demonstrert at metylering rente påvist i plasma økte med forbedret metylering rente i tumorvev bare i tidlig stadium kreft, mens denne sammenhengen ble tilsynelatende tapt i avansert kreft. Videre viste vi at graden av cfDNA metylering var forbundet med noen av egenskapene til cfDNA, slik som dens konsentrasjon og integritet, og at disse korrelasjoner varierte i styrke og retning i parallell med tumortrinnet [2].
i de to siste årene to uavhengige forskergrupper viste at muligheten til å påvise tumor spesifikk cfDNA i plasma av CRC pasienter i stor grad er avhengig av sensitiviteten av PCR-basert metode for korte muterte sekvenser [3-5], og dermed understreker viktigheten av å minimere analysen lengde ved analyse svært fragmentert cfDNA, slik som i innstillingen av kreftpasienter.
intratumoral heterogenitet og klonal utvikling under progresjon er flere problemer som kompliserer bruken av cfDNA som flytende biopsi for kreft, ettersom begge faktorer generere bemerkelsesverdig forskjeller i andelen og mønster av avvik oppdages i primærtumor og sirkulerende DNA [6,7].
Ifølge dette bevis, ulike tekniske og biologiske aspekter bør vurderes når analysere variabelen samsvar mellom vev og plasma endringer hos kreftpasienter, ikke minst innholdet i de underliggende endringer.
Både epigenetiske og genetiske endringer er kjente avvik involvert i kolorektal kreftutvikling. Gitt deres enorme potensialet som biomarkører i CRC diagnose, iscenesettelse, prognose og respons på behandling, de har blitt grundig undersøkt i det siste tiåret. Imidlertid er en kritisk sammenligning av deres status i vev og cfDNA mangler. Derfor denne studien var rettet til å analysere status for de to beste kjennetegnet genetiske og epigenetiske endringer av CRC (dvs.
KRAS
mutasjon og
SEPT9
promoter metylering) i en kohort av CRC pasienter, for å forbedre vår forståelse av de biologiske aspektene moduler det samsvar mellom vev og plasma metylering og mutasjon profiler. Så, vi også sammenlignet i hvilken grad den genetiske og epigenetiske mønstre flytte fra vev til plasma.
Materiale og metode
Pasienter og Prøver
Studiet kohorten inkluderte 85 påfølgende pasienter som gjennomgår kirurgi for CRC ved University Hospital of Verona (Italia) mellom januar 2010 og desember 2010. Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet før kirurgisk reseksjon. Tumorprøver ble tatt i løpet av kirurgi, umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Histologisk diagnose og tumorstadium ble vurdert i henhold til 2000 World Health Organization (WHO) klassifikasjonssystem for svulster i fordøyelsessystemet og det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system, henholdsvis [8]. Kun pasienter med primære kolorektal adenokarsinomer ubehandlede med neoadjuvant radio kjemoterapi ble inkludert i studien. Alle fag ga skriftlig samtykke til å være tatt opp i denne undersøkelsen. Studien ble godkjent av den lokale etisk komité (Institutt for miljø- og reproduksjon Sciences, University of Verona) og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen av 1975. Klinisk informasjonen ble hentet fra pasientjournaler.
DNA isolert fra plasma og vevsprøver
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet i 7 ml EDTA-rør og behandlet innen en time etter samlingen. Etter dobbel sentrifugering (800 g i 10 min sentrifugering, etterfulgt av separasjon og en andre 1600g i 10 min sentrifugering), ble plasma separert, lagret i aliquoter og nedfrosset ved -80 ° C inntil behandling. DNA ble ekstrahert fra plasma og ferske seksjoner frosset vev ved hjelp av QIAamp DNA Blood midi kit og Gentra Purgene Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), henholdsvis.
cfDNA konsentrasjon og integritet indeksen
cfDNA fragmentering ble bestemt ved å beregne DNA-integritet indeks som tidligere beskrevet [2]. I korte trekk, ble det bestemt ved å beregne forholdet mellom større (247 bp) sammenlignet med kortere (115 bp) mål av konsensussekvensen av human ALU gjentas. ALU-qPCR resultat som oppnås med ALU115 primerne ble også brukt til å kvantifisere total DNA.
Metylering spesifikk PCR (MSP)
Renset genomisk DNA ekstrahert fra vev og plasma ble underkastet bisulfitt behandling og DNA rensing ved hjelp av Epitect Bisulfite kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. En detaljert protokoll har tidligere blitt rapportert andre steder [2].
Bisulfite-modifisert DNA ble brukt som mal for Real-Time PCR ved hjelp av en SYBR grønn basert kvantitativ MSP. Primere for MSP ble designet spesielt forsterke enten en sulfitt-sensitive, unmethylated strand eller en sulfitt-resistent, denaturert strand på
SEPT9
genet promoter-regionen. Den web-basert programvare MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) ble brukt til å velge en bestemt CpG island, som nylig ble funnet som den mest sårbare for metylering endringer i adenom-karsinom sekvens [9] .
var sekvensene av primeren settene som følger:
M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC
M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG
U- Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG
U- Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (M: metylert, U: unmethylated).
CpGenome Universal denaturert DNA (Chemicon, Millipore Billerica, MA, USA) ble brukt som 100% denaturert (positiv ) kontroll, mens DNA ekstrahert fra perifert blod mononukleære celler fra normale individer ble anvendt som unmethylated (negativ) kontroll
PCR-reaksjonsblanding ble fremstilt i et sluttvolum på 20 ul, bestående av de følgende konsentrasjoner:. 0.375 iM av forover og bakover primere, 250 pM hver dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 × Hotstart Buffer (Qiagen), 2,5 mM MgCl2, 1,5 enheter Hotstart polymerase (Qiagen), 2 mikrometer SYTO 9 (Invitrogen, Rednings Technologies, Carlsbad, CA), og 1 x ROX henvisning fargestoff (Invitrogen), 3 ul av bisulfitt-modifiserte DNA.
PCR-amplifisering ble utført med precycling varmeaktivering av DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 min , etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 64 ° C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. En ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA) ble anvendt.
PCR-produktet ble kjørt på 2% agarosegel for å bekrefte størrelsen og spesifisiteten av PCR, og deretter visualisert under UV-lys. Et band på 110 bp ble ansett som diagnostisk av metylering status, mens et band av 114 bp ble ansett for å diagnostisere unmethylation status.
KRAS mutasjonsanalyse
DNA ekstrahert fra vev og plasmaprøver var utsatt for et allel ildfast mutasjon system qPCR (ARMS-qPCR) for påvisning av seks av de vanligste mutasjonene i kodon 12 og 13 i
KRAS
genet (G12A, G12D, G12V, G12S, G12C, og G13A ). DNA ble amplifisert i en 25 pl reaksjonsblanding inneholdende 0,25 pM av hver amplifikasjonsprimer, 200 pM av hver dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 x varmstart Buffer (Qiagen, Hilden, Tyskland), 2 mM MgCl
2, 2 enheter Hotstart polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland), 2 mikrometer SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California), 1 x ROX henvisning fargestoff (Invitrogen) og 25 ng DNA. Primersekvensene er tidligere blitt beskrevet andre steder [10], med unntak av den felles revers primer som er blitt re-designet for å forkorte amplikonene både kodon 12 (90 bp) og kodon 13 (85 bp) (opprinnelig av 149 og 144 bp i lengde). Den resulterende sekvens var som følger:. TGTTGGATCATATTCGTCCACA
PCR-amplifisering ble utført med precycling varmeaktivering av DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 64 ° C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek, i en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA). PCR-produktet av muterte prøvene ble kjørt på 2% agarosegel for å bekrefte tilstedeværelsen av de spesifikke bånd.
Kvantitativ analyse og analytiske resultatene
Terskel sykluser (CT) ble anvendt for å beregne metylering hastighet og mutasjon belastning i hver prøve, i henhold til følgende formel:% = 100 /[1 + 2 {Ct
oppfylt /mut-Ct
udekket /WT}] [2,11]. Ctmet og Ctunmet betegne terskel sykluser spesifikke for denaturert og unmethylated stater, mens Mut og WT refererer til muterte og villtype-alleler, henholdsvis. Proporsjonene (%) av metylering hastighet eller mutasjon last påvist i plasma sammenlignet med de som er påvist i vev ble uttrykt som plasma /forholdet vev (p /t-forhold).
Median av minst to gjentatte målinger ble beregnet for hver prøve, og deretter brukt for statistisk analyse. Forhåndsbestemt kvalitetskrav ble satt, slik at målinger med Ct-verdier større enn 38 sykluser, ble ekskludert.
Siden det har blitt observert at følsomheten av cfDNA assays kan økes ved å forkorte størrelsen av amplikonene [5,6] , primere for begge analysene ble utformet for å tillate amplifisering av produkter som er mindre enn 120 bp. Den intra-assay unøyaktighet for metylering testen var 9%. Den nedre grensen for deteksjon av metylert DNA for MSP analyser (vurdert ved hjelp av serielle fortynninger av Universal denaturert DNA) var 1,5%.
Den intra-assay unøyaktighet for
KRAS
analyser varierte mellom 2% og 8%, avhengig av typen av mutasjonen. Cellelinje DNA-blandinger inneholdende mutasjon av interesse i en normal DNA bakgrunn ble brukt for å evaluere deteksjonsgrensen og forsterkes i samme instrument kjøres for å virke som positive kontroller. Den analytiske følsomheten ARMS-qPCR var under 2%, som tidligere rapportert [12].
Statistisk analyse
Normalitet fordeling ble sjekket med Shapiro-Wilk test og kontinuerlige variabler ble rapportert som median (utvalg) eller gjennomsnitt ± SD, når det passer. Statistiske analyser og plotting av data ble utført ved hjelp GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, California). Den diagnostiske ytelsen cfDNA analyse ble sammenlignet med tumorvevet analyse (dagens gullstandard) for sin sensitivitet og spesifisitet i å skille mellom muterte /hypermethylated og nonmutated /ikke denaturert individer. Den prediktive positive og negative prediktive verdier ble også beregnet med Fishers eksakte test. Satsen for samsvar mellom vev og plasma-profiler ble bestemt med avtalen test (og verdier presentert som vektet kappa (k) ± standard feil). Forskjeller mellom kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Korrelasjoner ble testet med Spearman korrelasjon. Verdier av p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Femti seks av 85 pasienter i utgangspunktet vurdert for deres potensielle inkludering i studien var menn, resten kvinner (gjennomsnittsalder 69 ± 14 år. ). Den tumorstadium fordeling var som følger: 15 pasienter var i trinn I (17,6%), 35 i trinn II (41%), 24 ved trinn III (28,2%) og de resterende 11 i trinn IV (12,9%). Tjue ni av 85 kreft vevsprøver (34%) var positiv for en av de seks
KRAS
mutasjoner som vi har testet. Av disse viste 22 tumorvev avstemt mutasjoner i plasmaprøver. Samlet sett viste cfDNA analyse 89,4% (76/85) konkordans for
KRAS
deteksjon med tumorvevet analyse (k = 0,753 ± 0,077, p 0,0001). Det var ni uharmoniske resultater blant de 85 undersøkte prøvene. Fem Resultatene viste en WT genotype for
KRAS
-tested mutasjoner av cfDNA analyse, mens tumorvevet analyse viste en
KRAS
G13D-mutasjon (n = 2), en
KRAS
G12D mutasjon (n = 2) eller en
KRAS
G12V mutasjon (n = 1). To pasienter (både på scenen II) vises en
KRAS
G12S og et G12A mutasjon av plasma-analyse, men ble bestemt som WT av tumorvevet testing. Til slutt, to pasienter (begge med avansert metastatisk CRC) utviste enestående mutasjoner mellom vev og plasma.
SEPT9
promoter metylering var til stede i 82,3% (70/85) av primær tumor vevsprøver . Analysen viste 86% (73/85) samsvar med cfDNA analyse (k = 0,630 ± 0,092, p 0,0001). Uharmoniske resultater bare opptatt av pasienter med avvikende metylering av
SEPT9
i vevsprøver og unmethylated plasmaprøver (n = 12).
Fordelingen av positive og negative prøver i vev og plasma er vist i tabell 1, sammen med den analytiske ytelsen cfDNA analyser.
Etter eksklusjon av to pasienter med forskjellig
KRAS
genotype i vev og plasma, de 27 pasientene (81,5% menn) som viser både genetiske og epigenetiske forandringer i vevsprøver (31,8%, 27/85) ble vurdert for ytterligere kvantitative analyser. Hos disse pasientene frekvensen av samsvar mellom vev og plasma var 93% (25/27) for epigenetisk endring og 81% (22/27) for
KRAS
mutasjonsanalyse (dvs. to cfDNA prøvene var negative for metylering av
SEPT9 Hotell og fem var negativ for tilstedeværelsen av
KRAS
mutasjoner). Blant de forskjellige KRAS mutasjoner som vi har testet, den G12V substitusjonen var den mest representerte (n = 11), etterfulgt av G12D (n = 7) og G13D (n = 7). Til slutt, en prøve oppviste G12A mutasjon, mens den G12S ble funnet i en annen. Overall, 74% og 26% av mutasjons steder ble plassert i kodon 12 og 13, henholdsvis.
Median
SEPT9
metylering priser i tumorvev og plasmaprøver var 64,5% (12,2 til 99,9 %) og 14,5% (0 til 45,5%), henholdsvis. Median
KRAS
mutasjon last var 33,6% (1,8 til 86,3%) i vev og 2,9% (0 til 17,3%) i plasmaprøver. Kvantitative data for både genetiske og epigenetiske forandringer i henhold til ulike kliniske patologiske egenskaper er oppsummert i tabell 2. Ingen signifikante sammenhenger ble funnet med kjønn, primær tumorlokalisering og differensiering status både i tumorvev og plasmaprøver. I form av patologisk stadium klassifisering, median metylering frekvensen av
SEPT9
var signifikant høyere i avansert stadium kreft vev enn i tidlig stadium vev. En statistisk signifikant korrelasjon ble funnet mellom vev og plasma
SEPT9
metylering rate (r = 0,407, p = 0,035), mens ingen sammenheng ble funnet mellom vev og plasma
KRAS
mutasjon belastning (r = 0,092, p = 0,651).
Flere analyser ble utført på p /t forhold på
KRAS
mutasjon belastning og
SEPT9
metylering rente, for å identifisere potensielle forskjellene mellom genetiske og epigenetisk grad av overgang fra vev til plasma. Den p /t forhold på
SEPT9
metylering var betraktelig høyere enn p /t forhold på
KRAS
mutasjon belastning (24,2% vs 7,9%, p = 0,0228), begge parametrene som viser en bredt spekter av verdier (område 0 til 72,9% for
SEPT9
p /t-forholdet og 0 til 62,6% for
KRAS
p /t ratio). Dette funnet var nesten utelukkende tilskrives det store avviket mellom genetiske og epigenetiske p /t forholdstall påvise i tidlig stadium kreft (p = 0,0108), siden forskjellen i avansert stadium kreft var ikke lenger signifikant (p = 0,6806) (fig 1). Konsentrasjonen av cfDNA i tidlige stadier CRC-pasienter (median 30,6 ng /ml, 4,6 til 66,8) var lavere enn den i avansert stadium pasienter (80,2 ng /ml, 31,0 til 195,0; p = 0,0001). Den cfDNA ble også funnet å være mer fragmentert (integritet Indeks: 0,36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, 0,33 til 0,95; p = 0,0163). Ingen signifikante sammenhenger ble funnet mellom cfDNA parametere og genetiske eller epigenetiske forandringer, bortsett fra en svak sammenheng mellom cfDNA integritet indeksen og
KRAS
mutasjon belastning i avansert kreft (r = 0,572, p = 0,040).
Diskusjoner
Selv om bruken av cfDNA som potensiell surrogat for kreft genom er opprinnelig foreslått mer enn 30 år siden [13], og rollen til flytende biopsi har blitt evaluert for forutsigbar og prognostisk verdi i en rekke innstillinger med lovende resultater, har cfDNA-baserte kreft tester ikke blitt utviklet for klinisk bruk så langt.
den høye graden av fragmentering kombinert med lav blodkonsentrasjonen gjøre cfDNA en utfordrende analytt under en teknisk perspektiv. Videre er fortsatt usikre kinetikk tumor-relaterte cfDNA utgivelsen i blodet og genetiske endringer komposisjonen under progresjon både bidra til å gjøre cfDNA en «vanskelig å lese» analytt, selv under et biologisk perspektiv.
Resultatene fra vår studie, annet enn som bekrefter at væske biopsi forut endringer av tumorvev, er i samsvar med hypotesen om at noen forskjeller kan eksistere mellom hastigheten ved hvilken genetiske og epigenetiske forandringer flytte fra vev til plasma.
for å gjøre resultatene blir mindre utsatt for tekniske inngrep og gjøre genetiske og epigenetiske data pålitelig og direkte sammenlignbare, vedtok vi en rekke metodiske utveier tilpasset fra nyere publikasjoner. Først ble utført analyse i plasma siden denne biologiske matrisen representerer en bedre kilde til cfDNA enn serum [1, 6]. Deretter brukte vi relative korte amplikonene for begge bestemmelser, og dette var på grunn av det faktum at lengden av fragmentet kan påvirke sensitiviteten til deteksjon av mutasjoner og metylering [5, 14, 15]. Vi har også sikret en høy grad av sensitivitet av epigenetisk assay ved å målrette en spesifikk CpG øy, som nylig har blitt funnet å utvise den høyeste følsomhet for metylering endringer i adenom-karsinom-sekvensen [9]. Til slutt, i henhold til American Society for Clinical Oncology og National Comprehensive Cancer Network (NCCN), et høyt nivå av oppklaringsprosenten er innhentet for
KRAS
mutasjonsanalyse ved å målrette hotspots i kodon 12 og 13, som er kjent å gjøre rede for om lag 95% av alle mutasjoner [16].
i denne studien, en metylering bestemt qPCR og en ARMS-qPCR baserte metoder ble brukt for
SEPT9
metylering og
KRAS
mutasjon analyser, henholdsvis. På grunn av viktige teknologiske fremskritt, nye metoder som digital PCR [17], Inteplex qPCR [14] strålte teknologi [18], MethyLight kvantitative eller MethyLight digital PCR [19] og nye dype sekvenser nærmer [20] er nå tilgjengelig, og dermed gir absolutt kvantifisering av mutante eller denaturert alleler ved svært lave frekvenser og med lavere unøyaktighet enn det som er rapportert her. Imidlertid analysene som vi brukt i denne studien er mer allment tilgjengelig i kliniske laboratorier, og er også kjennetegnet ved en optimal følsomhet, være i stand til å detektere minst 2% endring i en normal bakgrunns [21]. Enda viktigere, den analytiske ytelsen av genetiske og epigenetiske analyser var svært like når det gjelder følsomhet og presisjon, og dermed gir direkte sammenligning av data fra ulike endringer.
Den første delen av studien, utført på hele kullet av 85 CRC pasienter, vesentlig bekreftet tidligere bevis på at analysen av
KRAS Hotell og
SEPT9
i plasma kan bli sett på som en pålitelig alternativ til vevet. Statusen for
KRAS
brukes vanligvis som prediktiv markør for respons på etablerte epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) hemmere på grunn av det faktum at mutant
KRAS
er assosiert med resistens mot anti-EGFR monoklonale antistoff immunterapi med agenter som centuximab eller panitumumab [22,23]. Omvendt, avvikende metylering i promoter-regionen i
SEPT9
genet har blitt overbevisende foreslått som sensitiv og spesifikk biomarkør for tidlig non-invasiv diagnostisering av CRC [24].
Ved å følge forslagene nylig foreslått av Wasserkort og medforfattere [9], og dermed rettet mot en bestemt CpG øy på arrangøren av
SEPT9
genet, fant vi et svært høyt antall hypermetylated vev prøver (82%), i større grad enn tidligere rapportert i litteraturen (vanligvis i området mellom 78 og 81%) [25]. De oppnådde i passet plasmaprøver Resultatene viste høy global samstemmighet (86%) og spesifisitet (100%) sammenlignet med tumor-vev analyse. I samme prøve, en
KRAS
mutasjon ble påvist hos 34% av pasientene, i tråd med data innhentet i andre årskull av uselekterte CRC pasienter [10,26]. Den tilsvarende analyse av plasmaprøver viste også en høy grad av overensstemmelse (89,4%) og spesifisitet (93%) sammenlignet med vev. De fleste av studiene som sammenligner resultatene fra en cfDNA analysen med tumorvevet analyse rapportert en mye lavere diagnostisk ytelse, med verdier på spesifisitet stadig lavere enn 80% [27-29]. Som et unntak bare to nylige studier rapporterte verdier av spesifisitet som ligger mellom 95,3% [30] og 98% [14].
I den andre del av studiet, analyserte vi frekvensen av samsvar mellom vev og plasma mutasjon belastning og metylering hastighet, og resultatene som er oppnådd med de to analysene ble deretter sammenlignet. I undergruppen av 27 pasienter som hadde vev genetiske og epigenetiske forandringer,
KRAS
mutasjon belastning varierte fra 1,8% til 86,3% (nesten 48 ganger), og viser dermed en høyere inter heterogenitet enn
SEPT9
metylering rate, som varierte fra 12,2% til 99,9% (dvs. ca. 8 ganger). I overgangen fra vev til plasma, ble fem prøver WT for mutasjonen status og to ikke lenger var hypermethylated. Graden av metyleringen i bevegelse fra vev til plasma var nesten 3 ganger høyere enn frekvensen av mutasjonen belastning som resulterer fra sammenligning av de to p /t-forhold (24,2% mot 7,9% for p /t-forhold på
SEPT9
metylering hastighet og
KRAS
mutasjon belastning, henholdsvis). I overensstemmelse med nylige rapporter, kan dette funn forklares ved intratumoral heterogenitet av den primære tumor, som fortrinnsvis hemmer genetiske snarere enn epigenetisk analyse [7, 31]. Likevel, siden avviket funnet mellom de to p /t forholdstall er utelukkende tilskrives data innhentet i tidlig stadium kreft mens klonal evolusjon skjer vanligvis når metastase utvikler, svulsten klonalitet ville bare delvis forklare våre funn [32].
KRAS
analyse, sammenlignbare verdier av mutasjonsbelastnings ble oppnådd mellom tidlig og avansert kreft i begge vev (26,9% mot 34,7%) og plasmaprøver (1,9% vs 4%), slik at p /t analyse viste ikke signifikant forskjell i henhold til kreft stadier (8,6% vs 7,3%). Motsatt var en statistisk signifikant forskjell funnet for
SEPT9
metylering analyse mellom p /t-forholdet i tidlige og avanserte kreftformer (33,8% vs 19,0%, p = 0,0108). Dette avviket var helt tilskrives et avvik i metylering rente påvist i vev (57,2% vs 80,8%, p = 0,0009), siden ingen forskjeller ble funnet i plasmaprøver (15,8% vs 12,9% for tidlig vs avanserte stadier). Således er overgangen av DNA huse den epigenetisk endring i sirkulasjonen i tidlig fase kreft tilsynelatende mer konsistent enn overgangen av DNA huse en
KRAS
mutasjon. Ifølge med de nyeste litteraturdata, kan dette bevis tolkes som følge av forskjeller i vev typer engasjement tidligere observert for CRC genetiske og epigenetiske signaturer [33]. Spesielt mens
SEPT9
avvik metylering utspring i epitelceller og deretter raskt overført til stromale celler [9],
KRAS
mutasjoner næret av epitel rommet ikke deles av stromale celler [ ,,,0],34]. Følgelig molekylær krysstale mellom tumor epitel og stroma oppstår for
SEPT9
epigenetisk endring kan lette overgangen til avvikende DNA fra primærtumor til sirkulasjonen.
I tillegg er den generelle lavere grad av mutasjon belastning med hensyn til metylering verdien detektert i CRC-vev (26,9% mot 57,2% i tidlig fase kreft) kan ha bidratt til å forbedre den fortynning effekten av villtype
KRAS
DNA i omløp .
som konklusjon, resultatene av denne undersøkelsen bekrefter at cfDNA analyse representerer en passende strategi for omfattende analyse av tumor genetiske og epigenetiske profiler, selv ved hjelp av rutinemetoder. Viktigst, forutsatt første bevis på at frekvensen til hvilken tumor avledet cfDNA kan påvises i sirkulasjonen ikke bare avhengig av sensitiviteten av metoden og kompleksiteten av frigjøringskinetikk, men også av arten av den eneste forandring. I en tid preget av økende bruk av omfattende genuttrykkstudier av solide svulster å belyse kompleksiteten i tumorvev og heterogenitet av celle fenotyper, understreker vår studie behovet for å bedre karakterisere kreftspesifikke genetiske og epigenetiske signaturer i henhold til ulike kreft avdelinger, så at betydningen og klinisk verdi av cfDNA vurdering kan bli slutt forbedres.
Andre bekreftende studier støtter hypotesen allerede foreslått av noen forfattere, i henhold til hvilke analyser av cfDNA representerer et verdifullt alternativ til vev analyse, men kan også bli førstevalget for både genetisk og epigenetisk svulst karakterisering ved å tilby en bedre samlet portrett av ondartede sykdommer [5, 14, 29, 30].
