Abstract
I kraft av sin evne til å regulere sammensetningen av cerebrospinalvæsken (CSF), årehinnen plexus (CP) er ideell for å sette i gang en rask respons til traumatisk hjerneskade (TBI) ved å produsere vekst regulatoriske proteiner. For eksempel, spiserørskreft tilhørende Gene-4 (Ecrg4) er et svulsthemmer-gen som koder for et hormon-lignende peptid kalt augurin som er tilstede i store konsentrasjoner i CP epitel (CPE). Fordi augurin er tenkt å regulere senescens, neuroprogenitor cellevekst og differensiering i sentralnervesystemet, evaluert vi kinetikken av Ecrg4 uttrykk og augurin immunoreaktivitet i CPE etter CNS-skade. Voksne rotter ble skadet med en gjennomtrengende cortical lesjon og endringer i augurin immunoreaktivitets ble undersøkt ved immunhistokjemi. Ecrg4 genekspresjon ble preget av
in situ
hybridisering. Celleoverflaten augurin ble identifisert histologisk av konfokal mikroskopi og biokjemisk ved sub-cellulær fraksjonering. Både Ecrg4 genekspresjon og augurin proteinnivåer ble redusert 24-72 timer etter skade, men restaurert til uskadde nivåer ved dag 7 etter skade. Protein farging i den supraoptic nucleus av hypothalamus, anvendt som en kontroll hjerneregion, viste ikke en reduksjon av auguin immunreaktivitet. Ecrg4 genuttrykk lokalisert til CPE celler, og augurin protein til CPE ventrikkel ansiktet. Ekstracellulær celleoverflate-tilknytning av 14 kDa augurin ble bekreftet ved celleoverflaten fraksjonering av primære humane CPE-celler in vitro mens en 6-8 kDa fragment av augurin ble påvist i kondisjonert media, noe som indikerer frigivelse fra celleoverflaten ved proteolytisk prosessering. I rotte CSF ble imidlertid 14 kDa augurin oppdaget. Vi hypoteser den første utgivelsen og proteolytisk prosessering av augurin deltar i aktivering fasen av skade, mens vedvarende Ecrg4 nedregulering er dysinhibitory under proliferativ fase. Følgelig augurin ville spille en konstituerende hemmende funksjon i normal CNS mens nedregulering av Ecrg4 genekspresjon i skade, som i kreft, dysinhibits spredning
Citation. Podvin S, Gonzalez AM, Miller MC, Dang X, Botfield H, Donahue JE, et al. (2011) Esophageal Cancer Relaterte Gene-4 er et årehinnen Plexus-Avledet Injury Response Gene: Bevis for en bifasisk Response i eldre og yngre hjerneskade. PLoS ONE 6 (9): e24609. doi: 10,1371 /journal.pone.0024609
Redaktør: Colin Combs, University of North Dakota, USA
mottatt: 03.06.2011; Godkjent: 14 august 2011; Publisert: 14. september 2011
Copyright: © 2011 Podvin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr. Podvin er støttet av en mentor Young Investigator Award fra Hydrocephalus Association (www.hydroassoc.org). Dr. Baird, Dr. Eliceiri og Dr. Coimbra er støttet av en USA National Institutes of Health (www.nih.gov) P20 Utforsksenter Grant for Ville Healing Forskning fra USA National Institute of General Medical Sciences (www.nigms .nih.gov; P20 GM078421) og er også støttet av National Institutes of Health (NIH) EY018479 (Dr. Baird), (NIH) HL073396 (Dr. Eliceiri) og ved supplerende finansiering gjennom den amerikanske Recovery og reinvestering Act (Arra ). Ingen ekstern finansiering ble mottatt for disse studiene av Dr. Miller, Dr. Dang, Dr. Donahue, Dr. Rossi eller Dr. Stopa. Conrad Johanson støttes av NIH AG027910. Alle studier utført ved University of Birmingham av Dr. Gonzalez, Dr. Botfield, Dr. Boissaud-Cooke og Dr. Leadbeater ble finansiert av et stipend fra School of Clinical and Experimental Medicine, College of Medical og Dental fakultet, Universitetet Birmingham, Storbritannia (www.medicine.bham.ac.uk). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Traumatisk hjerneskade (TBI) er ofte forbundet med dårlige kliniske utfall fordi en over overstrømmende betennelsesreaksjon kan forårsake utilsiktet skade på både skadet og ikke-skadet sentralnervesystemet (CNS) vev [1]. I tillegg er det biofysiske endringer i CNS, som begrenser funksjonelle inngang. For eksempel, dannelsen av en glial arr etter skade, som beskytter nerveceller fra eksitotoksiske faktorer [1], [2], men blokkerer synaptisk re-vekst og neuroprogenitor celleinfiltrasjon fra subventricular sonen (SVZ) [3]. Videre kan ødem forstyrre blod-hjerne (BBB) og blod-cerebrospinalvæske (BCSFB) barrierer, komprimere hjerne parenchyma [4] og kompromiss endotel, choroid plexus epitel (CPE), ventrikulær ependymal (Ve) og subaraknoidal (SA) celler som normalt filtrere giftstoffer fra interstitiell væske, opprettholde ioniske balanse av CSF, og skiller ut hormoner og vekstfaktorer for å opprettholde CNS homeostase [5].
CPE spesielt lider unike metabolske og strukturelle påkjenninger i løpet av de akutte fasen av CNS skade, noe som begrenser funksjoner som ellers ville gjenopprette homeostase under reparasjon. For eksempel, vasogenic ødem etter skade øker volumet av det ekstracellulære væskerommet og forårsaker ventriculomegaly. Den resulterende mekanisk stress [6] og nøytrofile invasjonen [7] øke leakiness av BCSFB tett veikryss og sloughing av apikal cilier fra CPE og Ve celler. Videre forstyrres tett veikryss forringe proteinultrafiltrering og føre til økt bulk og osmotisk strømning av vann inn i CSF [8], [9], [10].
Blant peptidene fremstilt i, og reguleres av den CPE [11], [12], augurin er et nylig beskrevet hormon-lignende protein som blir produsert etter proteolytisk prosessering av
spiserørskreft relatert gen-4 plakater (Ecrg4) holoprotein [13] og er antatt å spille en rolle i CNS homeostase [14], [15]. Tidligere rapporter [15] har vist at Ecrg4 gene ekspresjonsnivåene i CNS er høyest i CPE og ependyma under både utvikling (www.genepaint.org [16]), og i den voksne CNS (www.brain-map.org [17] ), og har foreslått en mulig rolle for sitt produkt augurin i CNS homeostase. Denne hypotesen støttes av våre observasjoner at knockdown av Ecrg4 genuttrykk under sebrafisk utvikling indusert celle over-spredning i utviklings CNS og genererte en ventriculomegaly fenotype. I motsetning til dette, Ecrg4 overekspresjon i voksen rottehjerne redusert celleproliferasjon i SVZ bassenget av voksne neuroprogenitor celler etter en kortikal stikk modell av CNS-skade [14].
Her viser vi at det er et hurtig tap av både augurin og Ecrg4 genuttrykk i CPE etter CNS skade. Disse data støtter hypotesen om at augurin spiller en konstitutiv inhiberende funksjon på vanlig CNS, og at dets hurtige frigivelse av og påfølgende forsvinning fra CPE etter skade kan bidra til å utløse og opprettholde CNS respons på skade ved å aktivere celleformering.
resultater
augurin er en cellemembran protein
Immunhistokjemisk analyser av augurin i periventrikulær regioner av hjernen (figur 1A, rød) viste at i mange tilfeller ble den største intensiteten av augurin immunolabeling polarisert (pil) med sterk farging lokalisering til ventrikkel siden av CPE celler (røde flekker i forhold til DAPI atom flekken i blått). Videre er mønsteret av immunreaktivitet i cytoplasma i CPE var granulære, som kan være en indikasjon på augurin nærvær i sekretoriske vesikler (innfelt). I motsetning til dette augurin immunoreaktivitet ble ikke påvist i CP endotel eller ved abluminal forsiden av CPE. Dette antydet at straks utenfor cellen, kan augurin være et plasmamembran-assosiert protein i kontakt med og med mulighet for utskillelse i CSF. For å bestemme hvorvidt augurin er sluppet inn CSF in vivo, behandlet vi rotte CSF for immunblotting og detektert et 14 kDa bånd (figur 1B) som samsvarer med den forutsagte molekylvekt av augurin, det bearbeidede 118 aminosyre hormon-lignende peptid kodet for av ECRG4 ( 31-148) [18]. En annen høyere MW band av ukjent identitet ble også oppdaget noe som kan gjenspeile peptid sin overvekt for aggregering (upublisert observasjon)
Panel A:. Immunhistokjemisk bevis for deling på celleoverflaten: The immunoreactive augurin kjennes av dette antistoff i CP ekstrakter ble identifisert som produkt av Ecrg4 ved immunoblotting og demonstrere nærværet av et 14 kDa-protein ECRG4 (31-148) behandlet ved spaltning av den 30 aminosyre-ledersekvensen som vi fastslått tidligere [13]. Blant periventrikulær celler i hjernen, ble observert polarisert foci av punctated augurin flekker på ekstracellulære ventrikkel ansiktet av årehinnen plexus epitelcellelaget (rød pil) i referanse til kjernefysiske counterstain (blå, DAPI). En granulær fargemønster er observert i cytoplasma hvis CPE-cellelaget, noe som er en indikasjon på regulert vesikulært sekresjon til celleoverflaten. Panel B: Påvisning av immunoreaktivt augurin i rotte CSF: Immunoblotting av rotte CSF viste et 14 kDa bånd (pil) som korresponderer med den forutsagte molekylvekt av augurin (ECRG4 (31-148)). Panel C: Biokjemisk bevis for celleoverflaten tethering av augurin: Uttrykk for Ecrg4 i de dyrkede CPE cellene ble påvist verken av Western blot (venstre panel) eller ved RT-PCR av untransduced celler (ikke vist). Således for å studere Ecrg4 in vitro var det nødvendig å bruke en adenovirus-vektor som inneholder det humane Ecrg4 ORF. Protein ble hentet fra CPE celler 48 timer etter at det ikke transduksjon eller transduksjon med AD
GFP eller AD
ECRG4. Molekylvekten av Ecrg4-avledede peptidfragmenter uttrykt i hele cellelysater ble bestemt ved Western blotting i det venstre panel. Celleoverflate-proteiner ble fraksjonert ved utfelling av Neutravidin-binding av biotinylerte proteiner på celleoverflaten (midtpartiet), etterfulgt av Western blot-analyse. Den peptid formen utskilles fra celler ble påvist ved direkte Western blotting av kondisjonert medium (høyre panel).
For ytterligere å møte den subcellulære fordelingen av augurin i CPE, biotinylert vi celleoverflaten av primære humane CPE celler i kultur og fraksjonert de biotinylerte proteiner via preciptiation med neutravidin perler. Vi deretter immunoblottet den celleoverflatefraksjon med et anti-augurin antistoff [19]. Dyrkede CPE celler, som mange andre celletyper i kultur som vi har undersøkt, ikke uttrykker endogen Ecrg4 men kunne gjøre det etter genet levering med virus eller plasmidvektorer [14]. Etter å infisere CPE celler med AD
ECRG4, en 14 kDa bånd ble påvist i helcellelysater (figur 1C, venstre panel, spor 3). Likeledes, ble et 14 kDa-proteinet påvist ved immunblotting av celleoverflateproteiner som indikerer at augurin lokaliserer til celleoverflaten (figur 1C, midtre panel, spor 3). Western blot-analyse av det kondisjonerte medium av CPE-celler imidlertid som vi tidligere viste inneholdt augurin (eller et immunoreaktivt fragment av augurin, som ble kvantifisert ved hjelp av ELISA [14]), viste et immunoreaktivt peptid som var omtrent 6-8 kDa (figur 1C, høyre panel, spor 3). Dette tyder på at i våre in vitro modell, peptid spaltningsseter utslipp (en) augurin fragment (e) fra CPE-celleoverflaten. Disse data fastslår at in vitro augurin fastholdes på celleoverflaten, og at celleoverflate-proteolytisk spaltning frigjør et mindre peptid inn i mediet i forhold til det som ble funnet i rotte CSF. Dette hevet muligheten for at to forskjellig bearbeidede former av augurin kan kaste av CPE celler og kan være en indikasjon på to peptid productes hver med en distince aktivitet. Ingen immunoreaktivitets ble påvist i helcellelysater, celleoverflate fraksjoner eller kondisjonert medium av enten untransduced eller AD
GFP transduced celler (figur 1C, banene 1 og 2).
Augurin distribusjons i choroid plexus endringer etter CNS skade
Vi brukte en cortical lesjon modell av CNS skade [20] for å vurdere om skaden skje Ecrg4 genekspresjon og augurin immunoreaktivitets i den laterale ventrikkel partiene. Kontroll og skadede rotter ble drept på 1, 3 og 7 dager etter å ha utført en 3 mm dypt lesjon i den høyre hjernebark, sideveis til ventriklene. Som vist i figur 2, ble det observert ved konfokal mikroskopi at det var signifikant diffus farging i den normale, intakte lateral ventrikkel CP som dukket opp i mange CPE celler til å polariseres til den apikale, ventrikulære som vender mot overflaten av epitelceller og med tegnsetting områder immunofluorescent etiketten (Figur 2A). Når evaluert 24 timer etter skade (figur 2B) i farging signalet var nesten fraværende selv om det var noen immunoreaktivitets funnet i isolerte foci. Selv det imidlertid den generelle intensiteten i farging dukket redusert. Av 3 dager etter skaden (figur 2C), ble immunofarging fremdeles redusert sammenlignet med kontroll uskadde dyr, men det viste seg mer jevnt fordelt i CP i forhold til farging 1 dag etter lesjonen. Ved 7 dager, intensiteten av fargingen var nå skjelnes fra kontroll hjerner, og det var en kombinert mønster av polarisert apikal og midtpunktformet flekk med et mer diffust mønster av augurin immunreaktivitet. Samlet utgjør disse data tyder på at augurin ble mobilisert umiddelbart etter CNS skade og antagelig sluppet ut i CSF.
En cortical stikksår redusert augurin protein nivåer i kontralaterale CP som bestemmes av immunhistokjemisk farging og konfokalmikroskopi. Den oftalmisk kniv trengt rotte dorsal cortex å skjære over corpus callosum 3 mm dype og side til høyre laterale ventrikkel. Immunreaktive augurin protein nivåer i kontralaterale CP minket med 24 timer (Panel B) og 3 dager (Panel C) etter skade sammenlignet med intakte kontrolldyr (Panel A). Ved 7 dager etter skade augurin protein hadde kommet tilbake til omtrent samme nivå som intakte kontroller. Bilder representant for n = 3 rotter.
Ecrg4 er en skade respons gen
Den langsiktige tap av immunoreactive augurin i CPE celler etter cortical lesjon kunne tilskrives enten (1) kontinuerlig og rask sekresjon-og-slipp av augurin tappe intracellulære butikker eller (2) mistet augurin gjennom redusert genekspresjon. Følgelig har vi anvendt in situ hybridisering for å evaluere genekspresjon i choroid plexus etter skade (figur 3). En antisense-probe til rotte Ecrg4 mRNA viste et sterkt signal i uskadde kontroll rottehjerner som lignet mønsteret observert for immunhistokjemisk farging (figur 3A). Signalet dukket begrenset til CPE celler og som med protein, ble signalet borte 24 timer etter skade (figur 3B) og forble slik til 3 dager (Figur 3C) etter som det re-dukket opp etter 7 dager (figur 3D) til nivåer tilsvarende de som i kontrolldyrene. Det signal som detekteres i kontrolldyr og 7 dager etter skade ble også ansett som spesifikke fordi ingen hybridisering ble påvist i CP-seksjoner fra sham eller 7 dagers post lesjon dyrene som ble behandlet med en syntetisk kontroll-proben (figur 3E og F). Sammen tyder disse data på at Ecrg4 er en tidlig skade reaksjon gen, og at tapet av augurin er bifasisk: For det første på grunn av bulk frigjøring fra celleoverflaten og intracellulære lagrings vesikler og den andre, på grunn av tap av Ecrg4 genekspresjon i løpet av proliferative fase av skade.
kortikal stikksår redusert genekspresjon nivåer i CP som bestemmes av
in situ
hybridisering. Den oftalmisk kniv trengt rotte dorsal cortex å skjære over corpus callosum 3 mm dype og lateral til høyre laterale ventrikkel og Ecrg4 genuttrykk evaluert ved binding av en Ecrg4 mRNA antisense probe i kontralaterale CP i intakte rottehjerner (Panel A), 24 timer (Panel B) 72 timer (Panel C) og 7 dager (Panel D) etter skade. En syntetisk, negativ kontroll mRNA-probe ble dannet fra pSPT18-neo-plasmid kontroll ryggrad og ble brukt til å vurdere bakgrunnssignal i kontroll (panel E) og 7 dager (panel F) deler. Bilder representant for n = 3 rotter.
Augurin fordeling i supraoptic kjernen (SON), reduseres ikke når CNS skade
For å undersøke om augurin nivåer endres i et mønster som ligner på CPE følgende cortical lesjon, så vi for immunoreaktivitets i et annet område av hjernen med høye nivåer av augurin og Ecrg4 uttrykk, sønn av hypothalamus [21]. Vi fant ingen reduksjon i ekspresjon ved ett og tre d.p.i. i skadede rotter (figur 4B og C) sammenlignet med kontroll figur 4A). Dette regional sammenligning indikerer redusert nivå av augurin på 1 og 3 d.p.i. er ikke en global respons i hele hjernen, og ytterligere sammenligninger av anatomiske regioner vil avgjøre om dette mønsteret er unikt for CPE i respons til CNS skade.
For å demonstrere spesifisitet for skade respons i CPE i motsetning til andre regioner av hjernen som har høye nivåer av Ecrg4 genet og augurin protein uttrykk [21] undersøkte vi SØNNEN av hypothalamus i skadede rotter ved en (B Panel), 3 (panel C) og 7 (Panel D) dpi og sammenlignet farging i intakte hjerne (panel A). Selv om det kan ha vært en liten incrase på 3 og 7 d.p.i., ble den stupbratte nedgangen av uttrykk som skjedde i CPE etter skade ikke observert i SON. Bilder representant for n = 3 rotter.
Diskusjoner
De data som presenteres her fastslå at CP-avledet Ecrg4 er en skade respons genet. Først utfellinger CNS skade en rask tap av Ecrg4 genekspresjon innen 24 timer etter skaden og den forble vedvarende i 7 dager, og da skaden har begynt å løse [22]. Den umiddelbare responsen var imidlertid antagelig en første hoveddelen frigjøring av augurin fra CPE-celleoverflaten, etterfulgt av mer vedvarende sekresjon og frigjøring av intracellulære lagre av augurin. Funksjonen til denne masse frigjøring i den tidligste fase av skade er ikke kjent, men det ble etterfulgt av en utarming av immunreaktivitet i midt-fase av skade som ble forsterket av en nedregulering av Ecrg4 genekspresjon som blir opprettholdt gjennom den proliferative fase av CNS skade gjennom å oppløsning på dag 7.
Ecrg4 genet er en kandidat tumor suppressor gen som har fått betydelig oppmerksomhet på grunn av den inverse sammenslutning av genuttrykk med veksten og utviklingen av epiteliale kreft [23], [ ,,,0],24]. Nedregulering medieres av sin epigenetisk lyddemping via DNA-metylering av den Ecrg4 promotoren [25], [26], [27]. Nylig, Ecrg4 genekspresjon har også blitt inverst korrelert med kreft progresjon og invasivitet [27], anti-inflammatorisk genregulering ved NF-kB [25], celleproliferasjon i SVZ [15] og direkte korrelert med økt senescens i CNS [ ,,,0],15] og endokrin regulering av perifer hydro-mineralbalansen [21], [28]. Dens åpen leseramme (ORF) koder for et 148 aminosyre protein som er svært konservert blant artene og har sekundære struktur motiver som karakteriserer neuropeptides [13]. Men avslører database gruvedrift som Ecrg4 er ikke en del av en større familie av relaterte gener. Dette kan tyde på stram evolusjonære kontroll blant Ecrg4 ortologer og et unikt biologisk funksjon.
Nedgangen i augurin protein (figur 2) og Ecrg4 genekspresjon (figur 3) oppstår til tider når celler sprer i normal CNS skade respons [29]. Tidsforløpet for redusert augurin korrelerer med akutte og sub-akutte responstid til CNS skade [1] som både gen og protein uttrykk er redusert med 1 til 3 dager etter skade, men kommer tilbake til uskadde nivåer ved dag 7. Dette er i tråd med vår tidligere demonstrasjon [14] at Ecrg4 genuttrykk er høy i normal CP og at Ecrg4 overekspresjon kompromisser neuroprogenitor cellevekst og differensiering. Funnene er presentert her tyder på at augurin kan være som en «sentinel» quiescence faktor hvis konstituerende tilstedeværelse er hemmende, men hvis fraværet blir en dysinhibitory signal som gjør at proliferativ respons på skade.
Det faktum at Ecrg4 genuttrykk er epigenetiske reguleres ved hjelp av DNA-metylering øker interessant mulighet for at de konstitutive nivåene av augurin i CP kan styres epigenetiske i tillegg. I så fall ville DNA metylering av Ecrg4 kontrollere mengder av basal augurin som er konstitutivt stede og tilgjengelig for utgivelse i den akutte fasen av skade. Betydningen av denne hypotese er ikke klar, men det kan bety at DNA-metylering kan også måle retur av genekspresjon i oppløsningsfasen for skade. Lignende epigenetiske endringer i DNA metylering er nå godt beskrevet etter CNS iskemi og skade [30]. Ved reversering av slike endringer påvirker utvinning av augurin ekspresjonsnivåer, da med henblikk på virkningene av Ecrg4 genet slå ned og over uttrykk [30], neuroprogenitor respons på skade kunne bli betydelig påvirket.
Det er spesielt bemerkelsesverdig at , mens augurin er lik andre peptidhormoner ved at den er konstitutivt produsert av CPE for sekresjon inn i CSF [22], er det også forskjellig fra peptidhormoner ved at celleoverflate-tilknytning (figur 1C) er minner om parakrine faktorer som epidermal og fibroblast vekstfaktorer, hakk, ujevne og ephrins [31], [32], [33], [34]. Vi [14] og andre [15], har tidligere beskrevet en utgivelse av augurin inn kondisjonerte mediet etter transduksjon med Ecrg4 transgenet, og vi har nå vist påvisning av en 14 kDa formen i rotte CSF, det første bevis på utskilt augurin in vivo. Våre funn av to ulike former for augurin produsert av CPE, 6 kDa (in vitro) og 14 kDa (in vivo), øke muligheten for ulike mekanismer for utgivelse. Det faktum at to forskjellige immunoreaktive formene ble påvist kunne være en konsekvens av cellebiologi endret av celledyrkingsprosessen, og det er mulig at i respons til skade på 6 kDa støtes inn i CSF, mens 14 kDa-formen i figur 1B er konstitutivt løslatt. Isoformen oppdaget kan være avhengig av celletype og betinget: Vi har oppdaget at begge isoformer i kondisjonerte mediet av omsatte cultured prostata epitelceller (XD, manuskript i gjennomgang) og 6 kDa formen i en ex vivo modell av betennelse (AK, manuskript under forberedelse). Figur 1C støtter hypotesen om at en tethered 14 kDa formen er utgytt ved proteolyse i media. Skjemaet i CSF men (figur 1 B) kan bli frigitt ved (1) fjerning av membranen anker, (2) konstitutiv frigjøring fra ER /golgi sti eller (3) ved en annen celletype opprinnelse.
tapet av augurin immunreaktivitet i CPE vev etter skade tyder på at det er tre bassenger av augurin: (1) peptid som slippes ut i biologiske fluider slik som CSF, (2) protein beholdt på celleoverflaten, og (3) peptider som er lagret i intracellulære vesikler. Den umiddelbare responsen til skade er antagelig å behandle på celleoverflaten, og etterfulgt av hurtig augurin frigjøring fra intracellulære lagrings vesikler. Gene uttrykk nivåer etter skade (figur 3) speil protein nivåer (figur 2) som tyder på at augurin løslatt kort tid etter skaden ikke blir oppfylt. Observasjonen at en mindre, bearbeidet form av augurin er funnet i kondisjonert medium (figur 1B, panel 3) antyder at proteolyse og behandling forekommer på tidspunktet for celleoverflate-shedding. Den biologiske funksjon, om noen, av disse fragmentene er ikke kjent, men de kan være forskjellig fra intakte augurin tjoret på celleoverflaten (figur 5).
Normale choroid plexus epitel uttrykke Ecrg4 og inneholder betydelige 14 kDa augurin protein som er i en hemmende konformasjon. Den ubearbeidede peptid inneholdes i 3 rom (1) intracellulære vesikler (dvs. punktformet intracellulær farging i figur 1) (2) i nærheten av ventrikulær celleoverflaten (dvs. polarisert apikal farging av celler i figur 1, og (3) bundet til celleoverflaten ( dvs. figur 1 B). ved skade, blir plutselig frigjøring og prosessering på celleoverflaten, etterfulgt av frigjøring fra intracellulære lagre som en «panikk-signal» for å indikere systemisk skade. den første pro-inflammatorisk respons før den slår seg Ecrg4 genekspresjon i minst 1 til 3 dager etter skade. Derfor under den innledende fasen av skade, er de vanlige, konstitutivt hemmende funksjoner er fraværende og så reparere celler sprer. Som genuttrykk avkastning, er quiescence restaurert og homeostase reetablert.
resultatene som presenteres her er kompatible med en dobbel funksjon modell av augurin aktivitet (figur 5). augurin virker normalt som et fast punkt inhiberende faktor som er konstitutivt til stede på den epiteliale celleoverflaten, men på tidlige tider etter skade, augurin fragmenter generert fra celleoverflaten kan være en ettergivende signal for skade aktivering. Den lokale reduksjon i augurin konsentrasjon ville dysinhibit proliferasjon og migrering av neuroprogenitor celler i SVZ. Faktisk, augurin overekspresjon i CP og ependyma avtar BrdU opptak og nestin immunoreaktivitet her, noe som indikerer at CPE-avledet augurin regulerer proliferasjon og levetiden for neuroprogenitors [3], [35], [36]. Dens dysinhibition kunne hjelpe avlede stamfar migrasjon til skadestedet fra rostral vandrende stream [3], [35], [36]. I så fall kan det epigenetisk regulering av Ecrg4 genuttrykk i CP hjelpe måle den delikate balansen mellom neuroprogenitor celle mobilisering i SVZ for reparasjon og undertrykkelse av voksen hemming. . Ytterligere kinetiske analyser av augurin distribusjon og Ecrg4 uttrykk i løpet av akutte og kroniske faser av utvinning fra kortikale lesjoner vil ta denne muligheten.
Materialer og metoder
Dyr
Alle studier ved hjelp rottene ble gjennomført med forhåndsgodkjenning av, og i samsvar med, enten Institutional Animal Care og bruk komité ved Brown University (Providence, RI, godkjenningsnumre 0062-07 og 0073-10) eller hjemmekontoret ved Birmingham University (Edgbaston, UK , godkjenningsnummer 3012720-19b2). Alle overlevelse operasjoner ble utført under aseptiske forhold. Vev ble høstet fra voksen Sprague Dawley rotter vedlikeholdt i standard lys /mørke forhold med
ad libitum
tilgang til mat og vann. For hjernevev høsting, ble rottene avlivet ved CO
2 innånding og umiddelbart perfusert med 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS). Hjerner ble fjernet og ytterligere fiksert over natten i PBS inneholdende 20% sukrose og 4% PFA ved 4 ° C. Den, Hjernene ble inkubert i PBS inneholdende 30% sukrose over natten og frosset i oktober forbindelsen på tørris og lagret ved -80 ° C inntil videre behandling.
Antistoffer
Immunofluorescence.
En polyklonale IgY antistoff ble reist i kyllinger mot rekombinant humant ECRG4 (71-148) og antigen affinitet renset ved kommersiell kontrakt med Genway Biotech, Inc., (San Diego, California). Renset pre-immun IgY fra det samme dyr ble anvendt som en negativ kontroll i farging av rottehjernevevet og geite-anti-kylling-AlexaFluor® 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA) ble anvendt for påvisning. Western blotting: Affinitetsrenset kanin anti-humant ECRG4 primære antistoff (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og geit-anti-kanin-pepperrot peroksidase (HRP) konjugert sekundært antistoff (JacksonImmuno Labs, West Grove, PA) ble anvendt for å detektere protein i Western blot-analyse.
Virale vektorer
en adenovirusvektor som inneholder et transgen for det humane Ecrg4 ORF (AD
ECRG4) ble fremstilt som beskrevet tidligere. Et adenovirus inneholdende transgenet for grønt fluorescerende protein (AD
GFP, Vector BioLabs, Philadelphia, PA) ble benyttet som en kontroll.
Cell Culture
A primære humane CP epitelcellelinje ble kjøpt fra ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, California) og dyrket i epitelcelledifferensiering Medium henhold til produsentens instruksjoner. For adenovirus-infeksjon, ble sammenflytende celler tellet og transdusert med en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 20.
Gjennomtrengende CNS Lesjon Model
Rotter ble bedøvet med 5% isofluran i oksygen (1,7 L /min) og gitt 0,3 mg /kg subkutant for buprenorfin analgesi før CNS-skade. Anestesi ble vurdert ved pote klype refleks. Skallen ble først utsatt med en sagital snitt langs midtlinjen av hodet, og etter å skape en Burr hull gjennom dura med en dental drill, ble en lesjon gjort 3 mm høyre for bregma, 7,5 mm rostralt av øret-bar fly og tre mm dyp ved hjelp av en oftalmisk kniv (Unitome Knife, BD Waltham, MA). Skaden påført transected corpus callosum og knivstikk kom inn i striatum. Vi har brukt denne skademodellen i stor utstrekning i andre studier [37], [38], [39], [40]. Intakte rottehjerner fra ikke-opererte dyr ble benyttet som kontroller.
Samling av rotte CSF
CSF-prøver fra voksne Spragu-Dawley rotter ble samlet som tidligere beskrevet [41]. I korthet, ble rottene bedøvet dypt i en stereotaksisk ramme med hodet hevet over legemet. Et snitt ble gjort fra toppen av hodet til bunnen av halsen. Muskelen ble trukket tilbake fra rundt bunnen av hodeskallen. Ved hjelp av en Hamilton-sprøyte, ble CSF trukket tilbake fra cisterna magna og umiddelbart frosset på tørris. Rotter ble deretter drept av terminal anestesi.
Cell Surface Protein fraksjonering og immunoblotting
Primære menneskelige CPE celler ble infisert med AD
ECRG4 eller AD
GFP en MOI på 20 til overuttrykker enten Ecrg4 eller GFP. Celleoverflateproteiner var biotinylated og trakk ned ved hjelp av Cell Surface Protein Isolation Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Pierce, Rockford, IL). Utfelte proteiner ble eluert fra Neutravidin kulene ved inkubering i 2% litium-dodecyl-sulfat-prøvebuffer under reduserende betingelser i en time ved 25 ° C. Immunreaktivt protein ble påvist ved Western blotting. I korthet, proteiner var størrelse fraksjonert på en 4-12% Bis-Tris gel for SDS-PAGE. Proteiner ble overført til 0,2 um polyvinylidenfluorid-membran, som ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) løsning i en time ved 25 ° C. Kanin-anti-human augurin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble fortynnet i 1% BSA ved en konsentrasjon på 0,5 ug /ml og inkubert med membranen over natten ved 4 ° C. Etter vaskinger med PBS inneholdende 0,05% Tween-20, ble membranene inkubert med 0,1 ug /ml geite-anti-kanin-HRP-sekundært antistoff fortynnet i 1% BSA i en time ved 25 ° C, skyllet og deretter inkubert med Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce, Rockford, IL).
