Abstract
benmarg-avledet mesenchymale stamceller (MSC) er stand til å migrere til svulster, der de fremmer tumordannelse og kreft metastasering. Men den molekylære fenotypen av de rekrutterte MSC på svulsten mikromiljøet og de genetiske programmene underliggende deres rolle i kreft progresjon er fortsatt i stor grad ukjent. Ved å bruke en tre-dimensjonal roterende vegg fartøy coculture system hvor menneske MSC ble dyrket alene eller i nær kontakt med LNCaP, c4-2 eller PC3 prostatakreftcellelinjer, vi etablert
i
vitro
matchet par av normale og kreft-assosiert MSC derivater for å studere stromal responsen fra MSC til prostatakreft. Vi observerte at prostatakreft-forbundet MSC fått en høyere potensial for adipogenic differensiering og viste en sterkere evne til å fremme prostata kreft celle migrasjon og invasjon sammenlignet med normale MSC både
in vitro Hotell og i eksperimentelle dyremodeller. Den forbedrede adipogenese og pro-metastatiske egenskaper ble gitt av de høye nivåer av IL-6-sekresjon med kreft-assosiert MSC og var reversibel ved funksjonelt inhibering av IL-6. Vi har også funnet at IL-6 er et direkte mål genet for la-7 mikroRNA, som ble nedregulert i kreft-assosiert MSC. Overekspresjon av la-7 via transfeksjon av la-7 forløperne redusert IL-6-ekspresjon og trykt den adipogenic potensial og metastase-fremmende aktivitet av kreftassosiert MSC, som var i overensstemmelse med inhiberingen av IL-6 3’UTR luciferaseaktivitet . Motsatt, behandling av vanlige MSC med let-7 hemmere førte til effekter som ligner de som er sett med IL-6. Til sammen våre data viste at MSC co-utvikle seg med prostata kreft celler i svulsten mikromiljøet, og nedregulering av la-7 av kreft-assosiert MSC oppregulerer IL-6 uttrykk. Dette oppregulering utløser adipogenesen og letter prostatakreft progresjon. Disse funnene ikke bare gi viktig innsikt i det molekylære grunnlaget for tumor-stroma interaksjoner men også bane vei for nye behandlinger for metastatisk prostatakreft
Citation. Sung SY, Liao CH, Wu HP, Hsiao WC, Wu IH, Jinpu, et al. (2013) Tap av Let-7 mikroRNA oppregulerer IL-6 i benmargavledede stamceller utløser en reaktiv stromal Response til prostatakreft. PLoS ONE åtte (8): e71637. doi: 10,1371 /journal.pone.0071637
Redaktør: Ching-Ping Tseng, Chang Gung University, Taiwan
mottatt: 18 april 2013; Godkjent: 30 juni 2013; Publisert: 19 august 2013
Copyright: © 2013 Sung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NSC 101-2314-B-039-007, NSC 99-2320-B-039-029-My3 og NSC 99-2632-B-039-001-My3 fra National Science Council i Taiwan, gi DOH102 -TD-C-111-005 fra Taiwan Department of Health og University Cancer Foundation via SINF av MD Anderson Cancer Center, USA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bone er den nest vanligste stedet for kreft hos mennesker metastase [1], og bidrar også direkte til prostatakreft dødelighet og sykelighet, med mer enn 85% av pasientene som dør av prostatakreft har benmetastaser [2] , [3]. Kvaliteten på livet av prostatakreftpasienter kan bli betydelig svekket av skjelettmetastaser gjennom utvikling av skjelettsmerter, kreft-assosiert benbrudd og rygg komprimering, beinmetastase-fremkalt hjerne nevropati fra bunnen av skallen syndromer, anemi og infeksjon [4] , [5]. Til tross for de alvorlige komplikasjoner av prostatakreft skjelettmetastaser, har det vært få fremskritt i terapeutisk arena for å forebygge eller redusere disse lesjoner [6]. Det er viktig at en solid forståelse av patofysiologien av prostata kreft skjelettmetastatisk prosess er utviklet for å gi grunnlag for å lage strategier for å forebygge eller redusere deres forekomst og tilhørende komplikasjoner.
Forskning har gitt bevis for at tumor-mikromiljøet samhandling er avgjørende i onkogenese og kreft progresjon, som først beskrevet i 1889 av Paget som foreslo at seeding av metastatiske kreftceller er avhengig av verts organ mikromiljøet (det «frø og jord» -konseptet) [7]. Selv om de fleste vertsceller i stroma ha visse tumorundertrykkende egenskaper, er utviklingen av karsinomer i høy grad av ondartede sykdommer ledsaget av dyptgripende histologiske endringer i tumorassosiert stroma. Disse endringene omfatter stromal celle fenotypiske switching, ekstracellulære matrise ombygging og angiogenese induksjon [8], [9]. Utviklingen av en endret stromal mikromiljø som reaksjon på carcinoma er et felles trekk ved mange tumorer og er egnet til å fremme tumorgenese. I løpet av prostatakreft invasjon prosess, for eksempel kreft epitelceller har kapasitet til å fremme den såkalte «reaktive» stroma reaksjon via den transdifferensiering av normale fibroblaster til den reaktive myofibroblast fenotype. I motsetning til vanlige fibroblaster, reaktive myofibroblasts drive videre genetiske og genuttrykk endringer i prostatakreftceller, noe som åpner for vekst og overlevelse av svulsten og formidling til fjerne organer med dødelige effekter [10] – [13]. Genekspresjon profilering av kliniske prøver viste samtidige og uavhengige genetiske endringer i stromale og kreft epitelceller [14], [15], noe som bekrefter den ko-utviklingen av kreft og stromale cellulære responser. Clinicopathological studier har også vist en kritisk rolle for den reaktive stroma i den postoperative utfallet av pasienter [16] – [18]. Den intrikate intercellulær kommunikasjon mellom epiteliale og stromale elementer antyder viktigheten av epigenetiske baner i tilrettelegging av prostatakreft progresjon i stedet for en direkte prosess bare tilskrives kreftceller alene.
i musemodeller og hos mennesker har rapportert at stromale tumorceller kan være avledet fra benmarg-avledede stamceller som kan mobiliseres til sirkulasjonen, migrerer mot tumorer, innlemme inn i svulsten mikromiljøet, og bidra til vekst av forskjellige tumorer [19] – [21]. Benmarg-avledede stamceller (MSC) er multipotente mesenchymal forløperceller som bidrar til å opprettholde og regenerering av en rekke av bindevev, inkludert ben, adipose, brusk, og muskel [22]. Nylig har sirkulert MSC vist seg å integrere seg i og vedvare i svulsten stroma [23], noe som gir en ny plattform for selektiv
in vivo
levering av legemidler mot kreft til invasive og metastase svulster [24] – [27] . Samspillet mellom MSC og tumorceller er ikke begrenset til homing men synes også å indusere flere uønskede bivirkninger. Mange observasjoner tyder på at i svulsten mikromiljøet, MSC har flere tumorvekstfremmende funksjoner, inkludert ekspresjon av vekstfaktorer [28], fremming av tumordannelse fartøyet [29] og opprettelse av kreft stamcelle nisjer [30]. Men den molekylære fenotypen av de rekrutterte MSC på svulsten mikromiljøet og de genetiske programmene underliggende deres eiendom i kreft progresjon er fortsatt hovedsakelig ukjent. Forstå hvordan nyrekrutt MSC er endret under tumorprogresjon og hvordan de gjensidig påvirker neoplastisk progresjon kan føre til utvikling av nye behandlingsformer for å redusere metastasedannelse.
I denne studien har vi fokusert på å definere om beinmargs MSC «co-utvikler seg» med prostatakreft epitelceller gjennom gjensidig tumor-stromal interaksjon. Rolle og spesifikke molekylære mekanismer av reaktive MSC i prostata kreft progresjon ble også belyst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
De dyrestudier ble utført i henhold med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of China Medical University (IACUC # 101-76-N). Alle operasjoner ble utført under Zoletil (tiletamin-zolazepam) anestesi ved en dose på 20 mg /kg ved intraperitoneal injeksjon. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Cellelinjer og cellekultur
Alle cellekulturmedier og reagenser ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). De prostatakreft-cellelinjer LNCaP, c4-2 og PC3 ble anvendt i tidligere studier [13], [31] og dyrket i T-medium supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS). Menneskelig benmargavledede MSC (hMSCs) og normale menneskelige prostata epitelceller (PREC) kjøpt fra Lonza (Rockland, Maine) ble opprettholdt i MSCGM ™ og PrEGM ™, henholdsvis i henhold til produsentens instruksjoner (Lonza). Den 3A6 human benmarg-avledede MSC-cellelinjen [32] ble opprettholdt i DMEM-LG-medium supplert med 10% FBS. For tre-dimensjonal (3-D) coculture, 1 x 10
7 3A6 celler ble dyrket alene eller blandet med et likt antall av LNCaP, c4-2 eller PC3-celler i en roterende vegg fartøy (RWV) systemer (Synthecon, Houston , TX) etter tidligere etablert protokollen [33] med mindre endring. I korte trekk ble enkeltcellesuspensjonen tilsettes til fartøy som deretter ble fylt med 10 ml medium sammensatt av T medium og DMEM-LG (01:01). Rotasjonen av fartøyene ble i utgangspunktet satt ved 15-20 rpm og deretter økes for å opprettholde celleaggregater i fri suspensjon. Mediet ble endret etter 3 dager. For å isolere 3A6 celler fra 3-D kimære tumoroids, ble celle tilslag høstet fra RWV og disassociated med 0,25% trypsin etter 2 uker med coculture. 3A6 celler ble selektert ved antibiotisk utvalg med 800 ug /ml G418 i 1 uke.
Differensiering av MSC
3A6 MSC-celler ble sådd i 6-brønns plater ved en tetthet på 10
4 celler /cm
2 for induksjon av osteogene og adipogenic differensiering under visse dyrkningsbetingelser. For osteogene differensiering, ble celler dyrket i osteogene differensieringsmedium bestående av DMEM-LG med 10% FBS, 10 nM deksametason, 50 ug /ml askorbinsyre, og 10 mM β-glycerofosfat i 14 dager og deretter underkastet Alizarin Red S farging, som tidligere beskrevet [32]. For adipogenic differensiering, ble cellene dyrket i adipogenic differensieringsmedium bestående av DMEM-LG supplert med 10% FBS, 100 nM deksametason, 0,45 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 10 ug /ml insulin og 50 ug /ml indomethacin for 21 dager, og deretter underkastet Oil Red O farging. Dannelsen av adipocytter ble overvåket ved fremkomsten av lipid dråper under et mikroskop. For å kvantifisere farging, ble Oil Red-O ekstrahert med isopropanol inneholdende 4% Nonidet P-40 og målt som absorbans ved en bølgelengde på 510 nm. Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Sanntids Kvantitativ PCR
Totalt cellulært RNA og beriket små RNA arter inneholder mikroRNA (miRNA) ble isolert fra dyrket celler ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX) etter produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert fra anrikede lite RNA og total RNA hybridisert med stammesløyfe revers transkripsjons (RT) primere og tilfeldige primere, henholdsvis, og revers transkribert med MMLV revers transkriptase (Invitrogen). Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av LightCycler 480 TaqMan mester kit med miRNA- eller gen-spesifikke primere og tilsvarende Universal Probe Bibliotek probe (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Scammeløkke-RT-primere, PCR-primere og prober ble utformet og sekvensene er vist i tabell S1. The real-time PCR reaksjonen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner og ble beskrevet i en tidligere studie [34]. U6 small nuclear RNA og varmesjokk 90 kD protein 1, beta (HSPCB) ble brukt som husholdningsgener for å normalisere ekspresjon av hvert gen miRNA og, respektivt.
cytokin antistoff Array og ELISA
uttrykket nivåer av forskjellige cytokiner i kondisjonert medium ble målt ved anvendelse av et humant cytokin antistoff Array C Series 2000 kit (RayBiotech, Norcross, GA) som tidligere beskrevet [27]. Menneskelig interleukin 6 (IL-6) protein nivåer i kondisjonert medium ble kvantifisert ved hjelp av kommersielle ELISA kits (eBioscience, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
oligonukleotid Transfeksjon
3A6 cellene sådd ut ved 2 x 10
5 celler /brønn i 6-brønns plater og inkubert over natten. -Celler ble transfektert med enten pre-mirnas (pre-MIR negativ kontroll og pre-MIR-la-7c) (Ambion, Austin, TX) eller LNA ™ miRNA-inhibitorer (anti-MIR negativ kontroll og anti-MIR-la-7 ) (Exiqon, Vedbæk, Danmark) på en endelig konsentrasjon på 10 nm eller 30 nm, henholdsvis ved hjelp DharmaFECT transfeksjon reagens (Dharmacon, Lafayette, CO) i henhold til produsentens instruksjoner.
Reporter vektorer og Luciferase Assay
oligonukleotider med den antatte la-7c gjenkjenningselementet, enten villtype eller mutant sekvens, ved nukleotider 316-322 av den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av det humane IL-6 gen ble utformet med flanke HindIII og Spel steder og syntetiserte. Etter gløding av sense- og antisense oligonukleotider, ble de resulterende DNA-fragmenter klonet inn i pMir-RAPPORT-Luc vektor (Ambion) etter Hindlll Spel og fordøyelse. De resulterende pMir-RAPPORT-Luc plasmider ble blandet med pCMV-β-gal (galaktosidase) ved et 5:01 molforhold og ble ko-transfektert med det pre-mirnas inn i HEK 293-celler. Etter 24 timers inkubasjon ble celleekstrakter fremstilt for luciferase og β-gal aktivitetsanalyser ved bruk av Luciferase Assay System og β-galaktosidaseenzym Assay System (Promega, Madison, WI). Den relative luciferaseaktivitet ble beregnet ved å dividere luciferase relative lysenheter av den tilsvarende verdi for β-gal-aktivitet til stede i hver prøve.
In vitro
migrering og invasjon Assay
hMSCs eller 3A6-derivater (2 x 10
5 celler) ble dyrket i det nedre kammer av transwells med serumfritt RPMI-1640 (Invitrogen). Etter 24 timers inkubering, 2 x 10
5 prostatakreftceller i serumfritt RPMI-1640 ble tilsatt til det øvre kammer som inneholder en 8-um porestørrelse polykarbonat filter som var belagt med (invasjon) eller uten (migrering) Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Etter 16 timer inkubering ble cellene på den nedre overflaten av membranen farget med krystallfiolett og tellet under et Zeiss Axiovert 200 fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) med et 10x objektiv.
Animal Studies
Seks uker gammel mann naken mus (BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl) ble hentet fra National Laboratory Animal senter (Taipei, Taiwan). 1 x 10
6 PC3-celler, enten alene eller blandet med likt antall 3A6
RWV eller 3A6
PC3-celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant inn i flankene av mus (
n =
10 i hver gruppe). Tumorvolummålinger ble tatt ukentlig. Musene ble avlivet 10 uker etter celle inokulasjon, og svulster var glade for histopathologic eksamen.
Immunohistochemistry
Spesifikk protein ble påvist i tumordelene med en Novolink Polymer Detection System (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne , UK) ved å følge instruksjonene i settet som tidligere beskrevet [35]. Muse monoklonale antistoffer mot ki-67 og CD31 ble kjøpt fra Leica Microsystems og utvannet 1:100 og 1:200 hhv. For å detektere lipider, ble vevet dehydrert objektglass med absolutt propylenglykol i 5 minutter og farget med 0,5% Oil rød O-løsning i 48 timer. Vevssnitt ble kontra farget med hematoksylin.
Statistical Analysis
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD, med mindre annet er angitt. Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av den tosidige Student
t
-test eller enveis ANOVA for multiple sammenligninger. En
p
-verdi mindre enn 0,05 ble definert som statistisk signifikant.
Resultater
Etablering av matchet par av Normal og kreft-assosiert MSC fra kimære Prostata Tumoroids Under 3- D RWV betingelser
Etter avtale med flere tidligere rapporter som MSC besitter iboende fortrinnsrett trekkfugl evne til noen epiteltumorer, demonstrerte vi migrasjon kapasitet av menneskelig benmarg-avledede MSC mot prostata kreft celler, men ikke normale prostata epitelceller i en
in vitro
coculture celle modell (fig. 1a). For ytterligere å forstå hvorvidt de rekrutterte human benmarg-avledede MSC «co-utvikle seg» med prostatakreftceller i svulsten mikromiljøet, en udødeliggjort human MSC cellelinje 3A6 [32] ble dyrket alene eller med androgen-avhengige LNCaP, dens androgen-uavhengig c4-2 underlinjen, eller beinmetastatisk PC3 prostatakreftceller i tidligere etablerte 3-D RWV dyrkningsforhold, rekapitulere
in vivo
svulstens mikromiljø [13]. Vi fant at celler, enten i monokultur eller i coculture tilstander, dannet 3-D kulelignende aggregater spontant (Fig. 1B). Spesielt, mens 3A6 coculturing med LNCaP (3A6 /LNCaP) eller c4-2 celler (3A6 /c4-2) dannes større aggregater enn 3A6 monokultur (3A6 /3A6), en markant redusert antall og størrelse på aggregatene ble observert i dyrke gruppe 3A6 og PC3 celler (3A6 /PC3). Å identifisere celletypene som finnes i aggregatene ble noen av de cellulære aggregater utsatt for histomorphological analyse. Intens farging av kromatin rike cellekjernen (Fig 1C;. H E) og positiv immunoreaktivitets av epitelceller markør E-cadherin (fig 1C;. IHC) ble påvist i tilslag høstet fra 3A6 /LNCaP, 3A6 /C4 2 og 3A6 /PC3 kulturgrupper, men ikke i aggregater av 3A6 celler dyrket alene. Dette funnet bekreftes av 3-D vekst av kimære tumoroids består av prostata kreft celler og MSC under disse coculture forhold.
(A) Migratory respons av menneskelige MSC til mediet, normale prostata epitelceller (PREC) og prostata kreft cellelinjer (DU145, PC3 og LNCaP). Migrerte celler gjennom membranen av transwells ble farget med krystallfiolett 8 timer etter celle plating. Den nedre overflate av membranen ble fotografert (100x), og et representativt bilde fra hver tilstand er vist ved toppen. Kvantitative data blir representert som gjennomsnitt ± SD av antall celler pr høy effekt felt (100x) i triplikat eksperimenter. (B) Makroskopisk (øverst) og mikroskopisk (nederst) visning av cellulære aggregater underkant av 3-D RWV kulturforhold 3A6 celler alene (3A6 /3A6) eller blandet med LNCaP (3A6 /LNCaP), c4-2 (3A6 /C4 2) eller PC3 (3A6 /PC3) celler. (C) Påvisning av blandede cellulære komponenter i 3-D cultured prostata tumoroids av H E og immunhistokjemisk farging av E-cadherin (E-Cad) i celle samlede seksjoner
Vi ytterligere isolert. de 3A6 celler fra monokultur aggregater og hver av de kimære prostata tumoroids (3A6 /LNCaP, 3A6 /c4-2 og 3A6 /PC3). De resulterende 3A6 derivater som representerer de genetisk relevante normale MSC og prostata kreft-assosiert MSC cellelinjer ble utpekt som 3A6
RWV og 3A6
LNCaP, 3A6
c4-2 og 3A6
PC3, henholdsvis. Renheten av disse 3A6 derivater ble bekreftet ved å vurdere MSC overflatemarkører, inkludert CD105, CD166, CD44 og CD29. Ingen signifikante forskjeller i ekspresjonsnivåer ble funnet i forhold til foreldre 3A6 celler som ble dyrket i plastskåler blant alle 15 passasjer (fig. 2A, 2B og Tabell S2). Fraværet av forurensende prostatakreftceller ble også demonstrert ved mangelen på E-cadherin uttrykkende celler (Fig. 2C). Disse sammenkoblede normale og prostata cancerassosierte MSC-cellelinjer ble anvendt for ytterligere karakterisering.
(A) Strømningscytometrisk analyse av celleoverflateantigener av foreldrenes 3A6 og dets derivater isoleres fra 3-D RWV dyrkede celleaggregater. Histogrammene viser fluorescens-profilene til 3A6 derivater farget med antistoffer mot de angitte antigener og de respektive isotype kontrollantistoff (sort linje). Uttrykket nivåer av individuelle antigener ble kvantifisert som forholdet mellom den midlere kanal fluorescensen av kontroll-antistoff og spesifikt antistoff. Feilfelt angir SD av tredoble målinger. (B) Immunoblotting analyse av CD105 uttrykk i 3A6 derivater. EF1-α protein nivåer er vist å variere i laste mengder. (C) Flowcytometrisk analyse av epithelial markør E-cadherin i 3A6 derivater og tilhørende coculture partnere av prostata kreft cellelinjer. Svarte linjer representerer isotype kontroller.
Prostate Cancer Påvirker Lineage Engasjement av Bone Barrow-avledet MSC Etter Kontakt coculture
Vi først undersøkt om prostatakreft har potensial til å lede differensiering skjebner av benmargen-avledet MSC etter langvarig fysisk kontakt. Vi har funnet at 3-D dyrket 3A6-derivater, uavhengig av om de var isolert fra homotypisk celleaggregater eller kimære prostata tumoroids, vedlikeholdes MSC egenskaper og var i stand til å differensiere i osteoblaster og adipocytter ved kultur i den respektive differensieringsmediet (Fig. 3) . Imidlertid, en økt tendens til adipogenic differensiering, noe som ble indikert ved forbedret lipidakkumulering (Fig. 3A, fig. S1A) og høyere ekspresjon av adipocytt-spesifikke markører adiponectin (Adipoq) og frakobling protein 1 (UCP1) (fig. 3B) var finnes i alle tre kreftrelatert 3A6 derivater med suveren induksjon sett i
PC3 3A6 sammenlignet med normale 3A6
RWV eller foreldre 3A6 celler. På den annen side, selv om Alizarin-rødt S farging for matrise mineralisering (Fig. 3C, Fig. S1B) samtidig med osteoblastspesifikke gener alkalisk fosfatase (ALP) og osteokalsin (OC) (Fig. 3D) ekspresjon viste en mindre økning i osteogene aktivitet av kreft-assosiert 3A6 derivater, ble en omvendt trend mellom osteogene og adipogenic differensiering funnet blant disse cellelinjene. Det var ingen signifikant forskjell i vekst mellom 3A6
RWV og kreft-assosiert 3A6-derivater (fig. S2), som kan utelukke at det endrede differensiering potensialet er en konsekvens av den endrede spredning kapasiteten av cellene.
3A6 derivater ble dyrket i osteogene eller adipogenic medium for å vurdere deres multilineage differensiering evne. Sperre 3A6 celler dyrket i fravær av differensieringsmedium (-DM) ble benyttet som den ikke-induserte kontroll. Representative farging av (A) Olje rød O-farging for å bestemme fettdråpeinnhold etter 21 dager med differensiering og (C) Alizarin-rødt S for å detektere benmineralisering 14 dager etter dyrkning i osteogene-induksjon media. Forstørrelse: 100x. (B) QRT-PCR-analyse av ekspresjonen av felles adipogenese markører og (D) osteoblastmarkørgener. Verdier er uttrykt som normaliserte mRNA mengder i forhold til HSPCB husholdningsgenet, og feilfelt representerer SD av tre uavhengige forsøk. *
P
0,05; **
P
. 0,001 mellom normal 3A6
RWV og kreft-assosiert 3A6 derivater
Kreft-forbundet MSC Utøve en høyere evnen til å akselerere prostatakreft vekst og fremgang enn normalt MSC
Vi neste analysert og sammenlignet den biologiske effekt som tilsvarer den pro-metastatisk potensial for normal 3A6 med kreft-assosiert 3A6 i prostatakreft. Den vandrende og invasive kapasitet av LNCaP, c4-2 og PC3 prostatakreftceller som reaksjon på signaler fra den tilsvarende kreft-assosiert 3A6
LNCaP, 3A6
c4-2 og 3A6
PC3, respektivt, eller den normale 3A6
RWV celler, ble vurdert via Boyden kammer analyser. Som vist i figur 4, er alle tre kreftassosiert 3A6-derivater som utøves betydelig høyere pro-metastatiske virkninger ved å fremme prostatacancer cellevandring (Fig. 4A) og invasjon (Fig. 4B) med en gjennomsnittlig 2- og 3-gangers økning i antall celler beveger seg mot den nedre kammer, henholdsvis, når sammenlignet med normale 3A6
RWV celler.
Migration (A) og (B) invasjon av de indikerte prostata kreftceller mot normal 3A6
RWV og de tilsvarende cancerassosierte 3A6 derivatene ble analysert ved hjelp av transwell-analyse etter 8 timer og 20 timer inkubering, respektivt. Data blir representert som gjennomsnitt ± SD av antall celler pr høy effekt felt (100x) i triplikat eksperimenter. **
P
0,001. Representanten bilde fra hver tilstand er vist nederst.
For ytterligere å validere avansert tumor-fremme atferd av kreftrelatert MSC på prostatakreft
in vivo
, vi subkutant injisert PC3 celler alene eller blandet med enten normal 3A6
RWV (3A6
RWV /PC3) eller kreft-assosiert 3A6
PC3 celler (3A6
PC3 /PC3) i nakne mus og vurdert effekten av 3A6 celler på PC3 svulster. I en parallell studie ble 3A6
RWV og 3A6
PC3 celler injisert alene, og resultatet bekreftet nontumorigenic eiendom 3A6 derivater (data ikke vist). Selv om begge 3A6
RWV og 3A6
PC3 hadde ingen effekt på cellevekst PC3
in vitro plakater (fig. S3), ble det observert en signifikant økning i tumorvolum i 3A6
PC3 /PC3 men ikke 3A6
RWV /PC3 xenografter (fig. 5A). Flertallet av PC3 svulster i fravær av 3A6 forble omskrevet, mens PC3 svulster vokst sammen med 3A6
RWV eller 3A6
PC3 vises et infiltrerende vekstmønster, med invasjon i det omkringliggende stroma og underliggende muskel (Fig. 5B H E). Den svært proliferative og invasiv tumorceller ble bekreftet ved hjelp av KI-67 ekspresjon og var assosiert med høy microvessel tetthet (fig. 5B, CD31). Disse invasive egenskapene er mest åpenbart sett i 3A6
PC3 /PC3 xenografter. Spesielt en av 10 mus som fikk den 3A6
PC3 /PC3 xenografter utviklet lungemetastaser (Fig. 5C), mens ingen metastaser ble sett i enten gruppen med svulster fra PC3 celler alene eller de med PC3 celler blandet med normal 3A6
RWV celler. I tillegg, i samsvar med
in vitro
finne at cancerassosierte 3A6-derivater har høyere adipogenic differensiering potensial enn normal 3A6
RWV, Oil rød O farging viste en økt mengde lipid-akkumulering i tumor delene av 3A6
PC3 /PC3, sammenlignet med den i 3A6
RWV /PC3 (fig. 5B, Oil rød O).
Nakne mus ble implantert subkutant med PC3 prostatakreftceller, enten alene (PC3) eller blandes med vanlig 3A6
RWV (PC3 + 3A6
RWV) eller kreft-assosiert 3A6
PC3 celler (PC3 + 3A6
PC3) på flanken (
n =
10 for hver gruppe). (A) tumorvekst kinetikk ble målt over 10 uker med oppfølging og presenteres som fold endringer i forhold til uke 1 etter celle implantasjon. *
p
0,05 versus PC3 kontrollgruppe. (B) Representant panel av histologiske H E farging, immunhistokjemisk farging for celleproliferasjon markør ki-67 og vaskulær markør CD31, og Oil red O farging for lipid vakuoler (rød) av subkutane tumorsnitt. (C) Lung metastaser observert av histologiske H E farging av vevssnitt (40x) fra 3A6
PC3 co-inokulert PC3 dyr. Tumor området var sirklet og indikert.
IL-6 Bidrar til det reaktive stromal Phenotype av kreft-assosiert MSC
For å identifisere kandidat faktorer ansvarlig for de reaktive stromal aktivitetene til kreft-assosiert MSC, menneskelige cytokine antistoff matriser ble brukt for å sammenligne cytokin uttrykk profiler av kondisjonert medium samlet inn fra normal 3A6
RWV og kreft-assosiert 3A6
LNCaP, 3A6
c4-2 og 3A6
PC3 celler. Blant 174 cytokiner ble testet, IL-6, var signifikant høyere i alle de tre kreft-assosiert 3A6-derivater sammenlignet med 3A6
RWV (Fig. 6A). Kvantitative data fra en ELISA-analyse (Fig. 6B) bekreftet forhøyet IL-6 protein nivåer i 3A6
LNCaP, 3A6
c4-2 og 3A6
PC3 celler tilsvarende økning på 145%, 204% og 1403%, henholdsvis, over det av
RWV 3A6 (112 pg /ml).
(A) Cytokin ekspresjon profilen av kondisjonert medium oppnådd fra normal 3A6
RWV og prostata cancer -associated 3A6
LNCaP, 3A6
c4-2, og 3A6
PC3 ble analysert ved hjelp av en menneskelig cytokin antistoff Array C Series 2000. autoradiogram av ett sett av Array VI inneholder IL-6 flekker (rektangulær bokser) er presentert. (B) Kvantitativ påvisning av ekspresjonen nivået av IL-6 ved hjelp av ELISA-analyse. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre eksemplarer bestemmelse. (C) kjemotaktiske respons av PC3-celler indusert av humant rekombinant IL-6 (rIL-6). Data blir representert som gjennomsnitt ± SD av antall celler pr høy effekt felt (100x) i triplikat eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,001
vs
serumfritt medium alene.. (D) Inhibering av PC3 cellevandring mot 3A6
PC3 kondisjonert medium av anti-IL-6 antistoff. Kondisjonert medium fra 3A6
PC3-celler ble forbehandlet med den angitte konsentrasjon av mus anti-IL-6 antistoff, og deretter lastet på bunnen av kammeret transwells. Behandling med 30 ug /ml av muse-IgG (mIgG) var en negativ kontroll. *
P
0,05, **
P
0,001
vs
mus IgG.. (E) induksjon av adipogenese av 3A6
RWV celler av human rekombinant IL-6, og (F) hemming av adipogenese av 3A6
PC3-celler ved anti-IL-6 antistoff ved den angitte konsentrasjon. Cellene ble farget med Oil red O for å visualisere lipid dråper etter 21 dager inkubasjon. Representanten bilde (100x) for hver tilstand er vist på toppen. De fargede celler ble kvantifisert ved anvendelse av et fargestoff utvinning metode og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. **
P
0,001
vs
mus IgG kontrollgruppe
Vi undersøkte om IL-6 er involvert i induksjon av prostata kreft celle migrasjon.. av kreft-assosiert 3A6. Vi har funnet at eksogen human IL-6 (rIL-6) induserte en doseavhengig økning i transwell migrering av PC3-celler (Fig. 6C). I tillegg ble antallet av PC3 cellene som migrerte mot 3A6
PC3 kondisjonert medium i bunnkammeret ble inhibert med 23% og 36% når det kondisjonerte mediet ble forbehandlet med en IL-6-nøytraliserende antistoff ved konsentrasjoner på 10 ug /ml og 30 ug /ml, henholdsvis (fig. 6D).
rolle av IL-6 i den forbedrede adipogenese av cancer-assosiert MSC ble også vurdert.
